Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Липополисахариды, структура и биологическая активность 10
1.2. Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку 16
1.3.ЛПС-зависимое праймирование нейтрофилов 24
1.3.1. Изменение цитоскелета клетки 24
1.3.2. Реорганизация микрофиламентов цитоскелета 27
1.3.3. TLR4-onocpedoeaHHbiu фагоцитоз 29
1 ANADPH-оксидазный комплекс и роль праймирования в его сборке. 32
1.4.1. Сборка NADPH-оксидазного комплекса 34
1.4.2. Рецептор-опосредуемая продукция АФК 37
1.5. Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов 38
1.6. Активация клеток приобретенного иммунитета ЛПС 42
Приложение Промономиелоцитарная линия клеток ТНР-1 43
2. Материалы и методы исследования .
2.1 .Материалы 47
2.2.Объекты исследования 47
2.3.Получение ЛПС из Rhodobacter capsulatus 48
2.3.1. Очистка ЛПС 49
2.3.2. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза в вертикальном пластинчатом геле по Крауссе [KraussetaL, 1988] 49
2.3.3. Определение ЛПС по реакции с карбоцианиновым красителем 50
2.3.4. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2- тиобарбитуровой кислотой 51
2.4.Культивирование бактерий Е. coli К12 52
2.4.1. Получение FITC-меченых клеток Е. coli К12 52
2.5.Выделение мононуклеаров и нейтрофилов из периферической крови человека 53
2.6.Праймирование нейтрофилов липополисахаридами 54
2.6.1. Регистрация образования активных форм кислорода (АФК) хемилюминесценцентным методом 54
2.6.2. Регистрация образования АФК хемилюминесценцентным методом в условиях подавленной сборки цитоскелета 55
2.7.Проведение реакции фагоцитоза с FITC-мечеными клетками Е. coli К12 56
2.8.Дифференцировка и активация ТНР-1 клеток 56
2.9,Определение концентрации TNF-a и IL-6 в пробах 57
2.10. Оценка экспрессии рецепторов на моноцитах и ТНР-1 клетках методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания 58
2.11. Определение синтетической активности лимфоцитов методом микроспектрального флуоресцентного анализа 58
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Исследование влияния структуры эндотоксинов на праймирование нейтрофилов по оценке уровня дыхательного взрыва 60
3.2.Влияние цитохалазина на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов 69
3.3.Исследование функциональных ответов дифференцированных ТНР-1 клеток на ЛПС разной структуры 77
3.3.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности ТНР-1 клеток 77
3.3.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов TNF-a и IL-6 дифференцированными ТНР-1 клетками 80
3.4.Исследование функциональных ответов фагоцитов на ЛПС разной структуры 84
3.4.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека 84
3.4.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов TNF-a, IL-6 мононуклеарами крови человека 88
3.6..Влияние структуры ЛПС на синтетическую активность лимфоцитов человека 91
Выводы 96
Список литературы 97
- Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку
- Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов
- Исследование влияния структуры эндотоксинов на праймирование нейтрофилов по оценке уровня дыхательного взрыва
- Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека
Введение к работе
Актуальность работы
Липополисахариды (ЛПС) - эндотоксины являются потентными активаторами клеток врождённого иммунитета. Активность ЛПС столь велика, что в пикограммовых концентрациях в крови они могут вызвать эндотоксиновый шок. Эндотоксин является главной составляющей внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Ответ организма на грамотрицательные бактерии обусловлен распознаванием и ответом клеток хозяина на него [Weckesser et al, 1995]. ЛПС распознаётся разными путями..В одном пути (гуморальном) участвуют собственные антитела [Reid et al., 1997] липопротеины [Wurfel & Wright, 1995; Hailman et al, 1996; Vreugdenhil et al., 2001] и катионные белки крови [Munford et al., 2005], которые нейтрализуют и очищают кровь от ЛПС. В другом пути (рецепторном) участвуют связывающий ЛПС (LBP) белок, рецептор CD 14, передающий ЛПС комплексу TLR4/MD-2, который, в свою очередь передаёт сигнал, в клетку, что приводит к мощному воспалительному ответу [Diks et al., 2001]. Известны нетоксичные ЛПС, в частности ЛПС из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter, которые способны конкурентно связываться с рецептором на поверхности клетки, проявляя антагонистическую активность в отношении эндотоксинов [Schramm et al., 2000]. Структуры ЛПС определяют набор дополнительных белков, которые вовлекаются в специализированные участки мембраны, формируя разные рецепторные кластеры. Состав такого кластера и стереохимия вовлеченных в него рецепторов, определяют запускаемый сигнал от ЛПС и специфичный ответ клетки [Triantaiilou et al., 2004].
На биологическую активность ЛПС не только из разных бактерий, но и из разных хемотипов одной и той же бактерии, влияют состав как гидрофобного фрагмента молекулы — липида А, так и состав гидрофильного фрагмента — кора и полисахаридного остатка ЛПС. В работах Teghanemt et al. (2005) на клетках миелоидного ряда показано, что максимальной биологической активностью обладают ЛПС, в состав которых входит липид А, содержащий 6 жирных кислот и 2 фосфатные группы. Любое изменение количества жирных кислот снижает эндотоксическую активность ЛПС [Rossignol & Lynn, 2005]. Гидрофильная составляющая молекулы (полисахаридный фрагмент) может усиливать как у эндотоксина из S. typhimurium [Muroi & Tanamoto, 2002], или ослаблять как у Е. coli [Raetz et al., 2006] действие ЛПС, оцениваемое по индукции провоспалительного цитокина TNF-a в макрофагах. Усечение структуры кора в последовательности от Ra- до Re- ЛПС снижает высвобождение TNF-a нейтрофилами [Lentschat et al., 1999]. Интенсивность ответов клеток на эндотоксин, зависит не только от структуры ЛПС, но и от состояния, в котором находятся клетки - предактивированы они или находятся в состоянии покоя [Agarwal et al., 1995]. Поскольку результат взаимоотношения клетка-эндотоксин неоднозначен, весьма актуальным является иследование влияния разных факторов для предсказания ответа клетки на стимул.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение влияния состава липополисахаридов на разные функциональные ответы клеток, в их числе дыхательный взрыв, экспрессия рецепторов на поверхности клеток и секреция провоспалительных цитокинов.
Были поставлены следующие задачи:
1.- Оценить степень праймирования нейтрофилов липополисахаридами из Е. coli или из фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus по интенсивности генерации активных форм кислорода в ответ на различные вторичные стимулы — бактерии или fMLP; - исследовать влияние подавления полимеризации актина на праймирование нейтрофилов.
2.- Оценить активацию моноцитоподобных клеток ТНР-1 и мононуклеаров крови человека липополисахаридами из R- и S-хемотипов энтеробактерий Е. coli и S. typhimurium и из бактерии Rb. capsulatus по следующим характеристикам; по уровню экспрессии рецепторов CDllb, CD14 и TLR4 на поверхности ТНР-1 клеток и моноцитов ; по уровню секреции провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6 ТНР-1 клетками и мононуклеарами.
3.- Оценить влияние разных ЛПС на индуцированную синтетическую активность лимфоцитов при активации мононуклеаров. Научная новизна
В работе впервые в единой серии экспериментов проведена оценка влияния структуры липополисхаридов на разные функциональные ответы клеток врожденного и приобретенного иммунитета. Показана значимость структуры липида А в степени праймирования нейтрофилов, оцениваемой по уровню дыхательного взрыва в ответ на разные вторичные стимулы. Установлено, что ЛПС из Rb. capsulatus обладает слабой праймирующей активностью и проявляет свойства антагониста в отношение токсичного ЛПС из Е. coli. Показано, что подавление образования псевдоподий цитохалазином D не отменяет праймирования клеток эндотоксинами.
Обнаружена корреляция между исходной экспрессией TLR4 на поверхности моноцитов и уровнем синтеза провоспалительного цитокина TNF-a в ответ на эндотоксин из Е. coli.
На мононуклеарах выявлена способность ЛПС из Rb. capsulatus блокировать синтетическую активность лимфоцитов, индуцируемую ЛПС из S. typhimurium.
Научно-практическая значимость.
Оценка исходного уровня экспрессии TLR4 на поверхности моноцитов позволяет прогнозировать дальнейший ответ клеток на липополисахарид по синтезу провоспалительного цитокина, и в связи с этим корректировать терапию в ходе лечения сепсиса. Полученные данные позволяют рекомендовать ЛПС из Rb. capsulatus в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С-Петербург, 2005), 9-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2005), V симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний» (Москва, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых Российских журналах.
Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку
При делении или гибели бактериальных клеток ЛПС высвобождаются из клеточной стенки бактерий в кровь и в свободном состоянии могут взаимодействовать со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней организма (нейтрофилы, моноциты/макрофаги, эндотелиальные клетки и т.д.). Прежде чем связаться с рецепторами на поверхности клеток, ЛПС распознается и доставляется внеклеточными белками-рецепторами: LBP,CD14HMD-2.
Высвободившись из клеточной стенки, эндотоксины формируют вследствие своей амфифильной структуры надмолекулярные агрегаты, которые обнаруживаются в крови. К классу белков, переносящих липиды, относится LBP (lypopolysaccharide-binding protein). Он связывается с агрегатами ЛПС, высвобождая из них отдельную молекулу, с которой образует комплекс LBP/ЛПС [Wyckoff et al., 1998]. LBP содержит в N-терминальном домене кластер катионных остатков аминокислот, необходимый для связывания ЛПС и последующей передачи сигнала [Lamping et al., 1996]. По причине электростатического взаимодействия между фосфатными группами липида А эндотоксина и катионного кластера белка LBP происходит снижение токсической активности эндотоксинов [Reyes et al., 2002; Pristovsek et al., 2005]. Участок LBP, связывающий фосфолипиды, по-видимому, представляет удобный участок для связывания липида А, однако его размер слишком мал для размещения ацильных цепей липида А. Расстояние между катионным и гидрофобным участком достаточно большое, чтобы молекула липида А могла взаимодействовать с обоими участками. Взаимодействие с гидрофобным участком играет основную роль, поскольку использование детергента препятствует связыванию ЛПС с N-терминальным доменом LBP [Kohara et al., 2006]. С-терминальный домен LBP необходим для взаимодействия с CD 14 или с мембраной клетки [Iovine et al., 2002]. LBP при взаимодействии с ЛПС играет двоякую роль: при низких концентрациях он усиливает сигнализацию путем экстракции ЛПС из мембран бактерий и переноса мономеров ЛПС к CD 14 [Vesy et al., 2000], a при высоких концентрациях — подавляет сигнализацию, доставляя ЛПС к сывороточным липопротеинам [Gutsmann et al., 2001]. В сыворотке септических больных концентрация LBP повышается, для того чтобы предотвратить чрезмерный ответ клеток на ЛПС.
Образовавшийся комплекс ЛПС/LBP взаимодействует с псевдорецепторным белком CD 14 (55 кДа), который экспрессируется на поверхности моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, эпителиальных и других клеток [Haziot et al., 1988]. CD14 существует в мембраносвязанной (mCD14) и растворимой (sCD14) формах. mCD14 не является истинным сигнальным рецептором, поскольку не является трансмембранным белком. Он заякорен в мембране через гликозилфосфатидилинозитол. В состав молекулы CD 14 входят 11 лейцин-обогащенных повторностей, которые участвуют в узнавании патогенов (PAMPs). АК-последовательность CD14 на N-терминальном участке (до 152 АК) является весьма значимой в активности этого белка человека, но не белка мышей [Muroi et al., 2002b]. CD 14 кристаллизуется в виде димера [Kim et al., 2005], имеющего сходство с подковообразной формой разных Толл-рецепторов [Bell et al., 2005; Choe et al., 2005]. Аминотерминальный сегмент, который как полагали ранее, отвечает за связывание рецептора с ЛПС, образует гидрофобный карман между первой и второй петлями спирали на выпуклой стороне. Гидрофобный карман может вместить большую часть ацильньгх цепей липида А, и тем самым защитить липид А от действия фермента ацилоксиацил гидролазы (АОАН) [Gioannini et al., 2007]. Гидрофобный карман может связывать и другие гидрофобные лиганды, что, по-видимому, объясняет неоднородность лигандов к CD 14 и его способность связывать различные хемотипы липида А с разным набором жирных кислот [Kitchens and Munford, 1995]. В молекуле CD 14 были идентифицированы остатки некоторых аминокислот, которые не участвуют в связывании ЛПС, но нарушают клеточную сигнализацию [Muroi et al., 2002b]. Предполагают, что эти остатки аминокислот взаимодействуют с другими белками сигнального каскада, и большая их часть расположена на N-конце, вблизи связывающего пакета или в пазе на наружной поверхности CD 14. CD 14 преимущественно связывает анионные липиды, возможно, из-за присутствия в рецепторе на границе гидрофобного участка консервативных катионных остатков аминокислот - Arg 53, Lys 68 и основные остатки в положении 73 и 74. CD 14 связывает также углеводные цепи ЛПС и пептидогликан [Pugin et al., 1994; Dziarski, 2003]. Связывающий участок для этих цепей находится в пазах, расположенных на верхней поверхности CD 14 вблизи N-терминального конца [Kim et al., 2005]. Т.к. липид А и углеводородная цепь ЛПС участвуют в связывании ЛПС с CD 14, отдельно вклад гидрофобного пакета трудно установить, в частности, из-за того, что CD 14 не требуется для Му088-зависимой активации TLR4 эндотоксинами R-хемотипа [Jiang et al., 2005]. CD14 требуется для активации в клетке MyD88-независимого пути эндотоксинами как R-, так и S-хемотипов. Связывание лигандов только с гидрофобным участком или дополнительное вовлечение участка CD 14, связывающего углеводную составляющую, мобилизует различных партнёров для инициации сигнального пути. Связывание ЛПС с mCD14 на моноцитах необходимо для стимуляции этих клеток, приводящей к наработке и высвобождению иммунных медиаторов. Антитела к CD 14 способны подавить продукцию цитокинов миелоидными клетками в ответ на ЛПС, что указывает на значимость CD 14 [Wright et al., 1990].
Растворимая форма CD 14 также образует комплекс с ЛПС. Этот комплекс может активировать клетки, не экспрессирующие mCD14 (эндотелиальные, гладкомышечные клетки, фибробласты) к синтезу цитокинов [Loppnow et al., 1995]. Кроме того, sCD14 может переносить ЛПС либо к липопротеиновым частицам плазмы, приводя к нейтрализации эндотоксина, либо к клеткам-эффекторам, индуцируя продукцию цитокинов [Vasselonetal., 1999].
CD 14 доставляет отдельную молекулу ЛПС к белку MD-2 (Ly96, ESOP-1), который существует в растворимой или связанной форме с эктодоменом рецептора Толл-4 (TLR4). Этот рецептор необходим для передачи сигнала от ЛПС [Shimazu et al., 1999]. Фактически TLR4 не играет никакой физиологической роли без MD-2.
Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов
Биологический ответ на эндотоксин после связывания с TLR4/MD2 рецепторным комплексом зависит от состава и структуры липида А. Клетки, у которых отсутствует TLR4, не способны отвечать на S-хемотип ЛПС даже в присутствии CD14 [Poltorak et al., 1998]. Липид А и R-ЛПС способны активировать TLR4/MD-2 без CD 14, в то время как для S-формы ЛПС требуется CD 14 [Huber et al., 2006]. Активация лигандом Толл рецепторов приводит к вовлечению цитоплазматических, содержащих TIR домен адапторных белков (MyD88, Mal/TIRAP, TRIF, TRAM), необходимых для передачи сигнала. Эти белки обеспечивают специфичность отдельных TLR опосредованных сигнальных путей [Takeda & Akira, 2004]. TLR4 опосредованная активация МуВ88-зависимого пути привлекает MyD88 и Mal/TIRAP белки к TLRIR домену, приводя к активации TRAF6, ранней фазы активации NF-кВ И митоген активируемой протеин киназы с последующей индукцией воспалительных цитокинов, таких как TNF-a [Huang et al., 2004]. TLR4 опосредованная активация Му088-независимого пути вовлекает TRIF и TRAM, которые активируют IRF3 и IRF7. Это приводит к быстрой наработке IFN-P, а затем IFN-a и других интерферон индуцибельных генов, таких как IP-10 и оксида азота, а также к поздней стадии активации NF-кВ И митоген активируемых протеин киназ [Fitzgerald et al., 2003].
ЛПС из Е. coli [Poltorak et al., 2000] и из Salmonella [Tapping et al., 2000] активируют клетки через TLR4. Липиды А, входящие в состав ЛПС из Е. coli и из Salmonella typhimurim, имеют асимметричное распределение жирных кислот, являются бифосфорилированными, но в состав липида А из Е. coli входит 6 жирных кислот, а в состав липида А из Salmonella typhimurim 7 жирных кислот [Oshiumi et al., 2003]. ЛПС Е. coli стимулирует MyD88-зависимый путь и высвобождение провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких как TNF-a и МІР-За. ЛПС из Salmonella индуцирует МуБ88-независимый сигнальный путь с высвобождением IFN-p, IP-10, оксида азота и в меньшем количестве TNF-a [Zughaier et al., 2005]. Различия в индукции эндотоксинами МуВ88-зависимого и независимого путей предполагают, что изначально взаимодействие эндотоксинов с внеклеточным доменом TLR4/MD2 комплекса происходит по-разному, что сопровождается вовлечением разных адапторных белков. Разная афинность связывания эндотоксинов с TLR4/MD2, приводящая к разным конформационным изменениям, может приводить к большей или меньшей степени связывания с участками специфических адаптерных белков TIR домена TLR4, что модулирует сигнальный путь [Triantafilou et al., 2004]. Дифференциальный запуск Му088-зависимого и независимого сигнальных путей эндотоксинами, вероятно, обусловлен различиями в структуре жирных кислот липида А или конформацией и структурой головных групп липида A. [Zughaier et al., 2005]. Число и длина остатков жирных кислот, фосфорилирование липида А и связь с кетодеоксиоктулозоновой кислотой (KDO), как известно, влияют на биологическую активность, изменяя надмолекулярную конформацию липида A [Stover et al., 2004; Tamai et al., 2003].
Как отмечалось выше, в состав молекулы эндотоксина помимо липида А входят кор и полисахарид. Вариабельность в коре и О-антигене ЛПС отражается на типе сигнального пути и ответе клеток [Jiang et al., 2005; Zughaier et al., 2005]. Показано, что липид А из разных штаммов Salmonella, в отличие от липида А из Е. coli, практически не активирует дифференцированные ТНР-1 клетки к синтезу TNF-a [Tanamoto & Azumi, 2000]. S-форма ЛПС из Salmonella abortus equi индуцирует синтез TNF-a в мышиных макрофагоподобных клетках J774.1 по механизму, отличному от механизма, индуцированного ЛПС R-формы из этой же бактерии [Shiba et al., 1984]. На дифференцированных с помощью 1,25-дигидрокси витамина D3 клетках моноцитарной линии ТНР-1 получены прямые доказательства участия О-антигенного полисахаридного фрагмента ЛПС в индукции синтеза IL-6 [Suda et al., 1999]. Эти клетки продуцировали высокий уровень IL-6 в ответ на ЛПС из Е. coli ОП1:В4 (S-форма), но не отвечали на стимуляцию соединением 506 (синтетический аналог липида А), не содержащем КДО, или на ЛПС из Е. coli (Re-мутант).
На моноцитах крови человека исследовалось влияние разных хемотипов ЛПС Escherichia coli на процесс интернализации ЛПС и на синтез провоспалительного цитокина TNF-a. Способность стимулировать экспрессию TNF-a убывала с уменьшением длины полисахаридного остатка: Ra-ЛПС, затем Rdl- и Re-ЛПС. Липид А обладал наименьшей активностью. Кинетики индукции синтеза TNF-a были сходными для Ra- и Rdl-ЛПС; максимальное высвобождение цитокина в среду наблюдалось через 5 часов инкубации с ЛПС, хотя в ответ на липид А и Re-ЛПС максимальная экспрессия TNF-a регистрировалась уже через 3 часа инкубации [Lentschat et al., 1999].
Matsuura с соавторами исследовали способность ряда моносахаридных аналогов липида А, отличающихся по количеству и длине ацильных групп, присоединенных к 4-0-фосфо-0-глюкозаминовой основе, стимулировать дифференцированные U937 клетки человека, мононуклеары крови человека и мышиные RAW264.7 к продукции TNF-a и IL-6 [Matsuura et al., 1999]. Максимальную активность в отношении индукции синтеза цитокинов проявляло соединение 506 (липид А Е. coli), обладающее дисахаридной структурой, с шестью ацильными группами. Моносахаридный аналог GLA-60 с тремя ацильными группами С)4 и GLA-63, также имеющий три ацильные группы, две из которых Си и одна Ci2 проявляли активность в индукции синтеза цитокинов моноцитами человека, однако, в гораздо меньшей степени (около 10 ), чем соединение 506.
Исследование влияния структуры эндотоксинов на праймирование нейтрофилов по оценке уровня дыхательного взрыва
Нейтрофилы относятся к клеткам врожденного иммунитета и первыми реагируют на появление в организме патогенов. К основным функциям нейтрофилов относятся распознавание антигена, фагоцитоз, продукция активных форм кислорода (АФК), синтез цитокинов. Нейтрофилы составляют большую часть клеток врожденного иммунитета. Реагируя на присутствие эндотоксинов в крови, они способны продуцировать активные формы кислорода в большей степени в ответ на стимул, чем другие клетки, например, моноциты [Yagisawa et al., 1996]. По этой причине нейтрофилы являются удобной моделью для изучения эффектов праймирования разными ЛПС, оцениваемых по уровню дыхательного взрыва. Из литературных данных известно, что ЛПС праймируют и активируют клетки через TLR4/MD-2 рецептор [Akira, 2006]. Для эффективного праймирования нейтрофилов необходимо присутствие белков сыворотки, обеспечивающих доставку ЛПС к рецепторным комплексам, которые экспрессируются на фагоцитарных клетках и обеспечивают трансдукцию сигнала в клетку [Bortolussi et al., 1997]. В литературе представлен широкий набор вариантов использования сыворотки, различающихся как по источнику сыворотки, так и по использованной концентрации. Это не позволяло однозначно выбрать условия постановки экспериментов по исследованию влияния структуры ЛПС на праймирование нейтрофилов. Поскольку сыворотка способна активировать клетки к наработке цитокинов, нам было необходимо учесть вклад сыворотки и найти оптимальные условия постановки экспериментов для минимизации её эффектов [Brunn & Piatt, 2006; Johnson, 2003]. Критерием оценки вклада сыворотки в активацию клеток был уровень синтеза провоспалительного цитокина — TNF-a при культивировании клеток в отсутствии ЛПС. Т.к. нейтрофилы высвобождают относительно невысокие уровни цитокинов в сравнение с мононуклеарными клетками [Miyasaki, 1998], исследование по влиянию сыворотки проводили на мононуклеарах крови, культивируемых в присутствии сывороток, различающихся по концентрации и типу.
Из полученных нами данных следует, что в отсутствие внешнего стимула эмбриональная сыворотка телят более выражено активирует клетки к спонтанному синтезу TNF-a. Минимальный эффект стимуляции наблюдается при культивировании клеток в присутствии 2% аутологической сыворотки. Уровень TNF-a в присутствии этой сыворотки увеличивался в 2 раза по сравнению с уровнем в среде RPML В связи с этим все последующие эксперименты по оценке эффектов ЛПС были проведены в присутствии 2% аутологической сыворотки. Использование сыворотки обеспечивало присутствие белков, критически необходимых для взаимодействия ЛПС с нейтрофилами по CD14/TLR4/MD-2-3aBHCHMOMy механизму [Wright et al., 1991].
Критерием влияния структуры ЛПС на праймирование нейтрофилов может быть уровень дыхательного взрыва в ответ на вторичный стимул [Aida & Pabst, 1990]. В качестве вторичного стимула в работе использовались либо бактерии Е. coli, либо fMLP. Добавление бактерий приводило к их поглощению клетками - первой фазе фагоцитоза, которая сопровождалась внутриклеточным дыхательным взрывом, тогда как при стимуляции нейтрофилов fMLP реализовался внеклеточный дыхательный взрыв. Об уровне АФК судили по интенсивности хемилюминесценции добавленного в среду люминола. Этот агент проникает в клетку через мембрану, что позволяет определить как внутриклеточные, так и внеклеточные формы кислорода [Dahlgren & Karlsson, 1999].
Из литературных данных известно, что ЛПС из Е. coli проявляет более выраженное в сравнение с другими ЛПС агонистическое действие в отношении нейтрофилов [Zughaier et al., 2004]. В связи с этим для стимуляции нейтрофилов в работе использовали коммерческий ЛПС из Е. coli 055:В5. Известны нетоксичные ЛПС, которые способны конкурентно связываться с рецептором на поверхности клетки, проявляя антагонистическую активность в отношении эндотоксинов. К ним относятся, в частности, ЛПС из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter [Schramm et al., 2000]. Показано, что антагонисты подавляют синтез моноцитами провоспалительных цитокинов, индуцированный эндотоксинами [Loppnow et al., 1990] и дыхательный взрыв нейтрофилов в ответ на вторичный стимул -fMLP [Винокуров и др., 2006]. В литературе отсутствуют данные о влиянии антагонистов эндотоксинов на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов, индуцированный бактериями. В связи с этим нами исследовалась способность нетоксичного ЛПС из Rhodobacter capsulatus влиять на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов при фагоцитозе.
Хемотип ЛПС, использованных в работе, был предварительно подтверждён методом электрофореза. Стимуляция нейтрофилов в течение 30 минут каждым из ЛПС или последовательно ЛПСдб. caps_ и ЛПС& соц в концентрации 10 нг/мл в присутствии 2% аутологической сыворотки не вызывала усиления образования АФК без дополнительной активации вторичным стимулом fMLP (рис. 1). Следует отметить, что сам по себе fMLP клетки не стимулировал к дыхательному взрыву. Эти результаты согласуются с литературными данными о необходимости вторичного стимула для реализации дыхательного взрыва [DeLeo et al., 1998]. Как отмечалось в литературном обзоре, для активации продукции АФК требуется вторичный стимул, в частности, бактерии или fMLP. В качестве вторичного стимула были использованы предварительно термоинактивированные и опсонизированные бактерии Е. coli К-12. Опсонизация бактерий приближала условия эксперимента к физиологическим, т.к. известно, что проникшие в кровь бактерии подвергаются опсонизации, а затем фагоцитозу. К опсонинам относят сывороточные факторы, которые способствуют фагоцитозу; в их числе компоненты системы комплемента и иммуноглобулины.
Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека
Мононуклеары периферической крови высоко чувствительны к эндотоксинам и при концентрации ЛПС 10-50 пг/мл отвечают наработкой цитокинов [Schindler & Dinarello, 1990]. Моноциты человека, выделенные из периферической крови, отвечают на минимальные концентрации ЛПС, хотя существует вариабельность ответа от донора к донору [Van der Meer et al., 1988]. Активация моноцитов и высвобождение цитокинов зависят от физико-химических свойств ЛПС, а также от донора моноцитов [Agarwal et al., 1995]. ЛПС из Е. coli через TLR4/MD-2 активируют клетки к наработке TNF-a и IL-6 [Poltorak et al., 2000]. TLR4/MD-2 способен трансдуцировать сигнал от R-структур ЛПС и липида А, но значительно с меньшей чувствительностью, чем сигнал от S-структур даже в отсутствии CD 14 [Beutler, 2009]. Если клетка активируется липидом А в отсутствии CD 14, то сигнал от TLR4 в ядро проходит по MyD88/TIRAP-nyTH [Jiang et al., 2005]. Для связывания и интернализации S-структуры ЛПС из Е. coli необходимо присутствие mCD14 на поверхности клетки [Hamann et al., 2005]. In vitro на моноцитах, изолированных из периферической крови, показано, что инкубация с ЛПСя. сои (100 нг/мл) индуцирует экспрессию mRNA для TNF-a, IL-6, IL-P и IL-8, и этот процесс коррелирует с секрецией данных цитокинов в среду [Agarwal et al., 1995].
Нами проведены исследования по влиянию структуры ЛПС на синтез мононуклеарами провоспалительного цитокина TNF-a. Клетки культивировали в среде RPMI, содержащей 2% аутологической сыворотки, в присутствии или отсутствии ЛПС. Предварительно ЛПСя соц 055:В5 (S-хемотип), ЛПС. соп JM103 (Re-хемотип) или ЛПСдг,. caps. (R-хемотип) были выровнены по массовой доле липида А — 100, 50, 75 нг/мл, соответственно. Для выявления защитного эффекта мононуклеары предварительно инкубировали с ЛПСДЙ. caps_ с последующим добавлением ЛПС агониста в соотношении 10:1. Уровень TNF-a в пробах определяли через 24 часа инкубации. Результаты экспериментов представлены в таблице 5.
Наибольшей активностью в отношении индукции синтеза TNF-a обладал ЛПС . соц S-хемотип. S-ЛПСЕ соц является более сильным агонистом в отношении продукции TNF-a по сравнению с R-структурой ЛПС [Hamann et аі., 2005]. Активность Re-структуры ЛПС была несколько ниже по сравнению с S-структурой. ЛПСд& caps, в концентрации 75 нг/мл либо не активировал мононуклеары, либо обладал слабой активирующей способностью в отношении синтеза TNF-a. Концентрация Л11Сд& caps. 500 нг, используемая для выявления антагонистического эффекта, либо не влияла на синтез мононуклеарами TNF-a, либо приводила к слабой активации мононуклеаров.
ЛПСдг,. caps, проявлял свойства антагониста более выражено в отношении S-структуры ЛПС. В случае Re-структуры эффект защиты был менее выраженным, либо отсутствовал (табл. 5). Различия в проявлении агонистической активности S- и R-структур ЛПС объясняются, по-видимому, разной степенью их растворимости. ЛПС являются амфифильными молекулами, поэтому при концентрации мицеллообразования выше критической (ККМ) в водном окружении эндотоксины существуют в виде агрегатов [Aurell & Wistrom, 1998]. Тип агрегата и ККМ играют существенную роль в проявлении биологической активности эндотоксинов. Установлено, что наивысшие значения для ККМ наблюдаются для S-ЛПС, что связано с присутствием О-полисахарида и, следовательно, хорошей гидрофильностью молекул, тогда как изолированные липиды А обладают наименьшим значением ККМ. Принимая во внимание значения ККМ, при одинаковой концентрации липида A, Re-или S-форм эндотоксинов в среде инкубирования, большее число мономеров будет наблюдаться для последнего. Число мономеров эндотоксина при одинаковой концентрации разных хемотипов ЛПС является определяющим для проявления биологической активности [Schromm et al., 1996].
Следует отметить, что клетки, изначально экспрессирующие высокие уровни TNF-a в контроле (табл. 5, донор 1), теряли способность различать структуру ЛПС. Agarwal с соавторами показали, что моноциты, полученные от разных доноров, отвечали по-разному на один и тот же ЛПС, на основании чего сделали вывод, что в распознавании ЛПС существенную роль играет исходное состояние клеток индивидуума [Agarwal et al., 1995]. Возможно, клетки данного донора изначально находились в предактивированном состоянии и активировались за счет адгезии к пластику [Cramer, 1992] при культивировании или при действии эндогенных стимулов (компоненты сыворотки). Кроме того, мононуклеары, спонтанно синтезировавшие высокие количества TNF-a, изначально экспрессировали высокие уровни TLR4 на поверхности моноцитов. Способность различать структуру ЛПС сохранялась для доноров, клетки которых изначально экспрессировали от 14 до 33% TLR4 (табл. 6).
