Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп - одна из массовых вирусных
инфекций, возбудитель которой существенно отличается от остальных вирусов особенностями строения и репродукции. Геном вируса гриппа,состоящий из 7-ми (вирусы типа С) или в-ми 'вирусы п"Р А и В) фрагментов, представлен одноцепочечной (-)-РНК.
Для лечения гриппозной инфекции как в нашей стране, так и за рубежом широко применяются химиопрепараты адамантанового ряда. Однако, эффективность использования этого класса соединений существенно снижается из-за появления в вирусной популяции штаммов, устойчивых к их действию. Для синтеза новых и модификации существующих препаратов, способных преодолевать лекарственную резистентность и, возможно, снизить вероятность возникновения устойчивых вариантов вируса, необходимо знание молекулярных основ их действия.
При изучении механизма действия химиопрепаратов адамантанового ряда первоначально было установлено, какие сегменты вирусного генома связаны с признаком устойчивости. Для этого использовали явление генетической реассортации, когда в результате одновременного заражения клеток двумя или несколькими штаммами вирусов с сегментированным геномом вновь синтезированные вирусные частицы имеют геномы, содержащие различные комбинации сегментов исходных штаммов. Исследованием генетической реассортации геномов устойчивых и чувствительных к химиопрепаратам вирусов гриппа типа А было установлено, что признак устойчивости определяется либо 4-ым сегментом генома, который кодирует гемаг-глютинин, либо 7-ым сегментом, кодирующим белки М1 и М2 . По мнению ряда авторов именно 7-ой сегмент вРНК играет основную роль в устойчивости гриппа типа А к химиспрепаратам, а исходя из функциональных особенностей белков, кодируемых этим сегментом, наибольшее внимание уделяется белку М2.
Цель настоящей работы заключалась в определении и сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей генов М2 и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, ответственных за проявление устойчивости штаммов вируса гриппа
типа А к действию химиопрепаратов адамантанового ряда. На основании обобщения вновь полученных результатов и уже имеющихся данных предполагалось исследовать молекулярно-геяетические основы действия химиопрепаратов адамантанового ряда.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: 1} определить нуклеотидные последовательности генов М2 штаммов вируса гриппа типа А, устойчивых и чувствительных к действию химиопрепаратов адамантанового ряда, выделенных из природных популяций и полученных в лабораторных условиях; 2) провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей и соответствующих им аминокислотных последовательностей белка М2 в устойчивых и чувствительных штаммах вируса гриппа типа А; 3) исследовать влияние аминокислотных замен в белке М2 на проявление устойчивости к химиопрепаратам; 4) исследовать роль вторичной структуры 7-го сегмента генома вируса гриппа типа А в появлении замен в участке, кодирующем транс-мембранный домен белка М2.
ЙЭД!Э95_Э21211_И_ПРктическая_ценность_работы. В результате анализа полученных данных показано, что устойчивость вирусов гриппа типа А к химиопрепаратам определяется заменами аминокислот в транс-мембранном домене белка М2. Также установлено, что на устойчивость влияют замены и во внемембранном ЫН2-домене белка М2, Показано, что для изменения фенотипа вируса с чувствительного на устойчивый, достаточно даже единичной нуклеотидной замены в участке 7-го сегмента РНК, которая приводит к амино-. кислотной замене в транс-мембранном домене белка М2. Предложена модель взаимодействия белка М2 вируса гриппа с химиопрепаратами адамантанового ряда, согласно которой такие химиопрепараты подвижно ориентированы в полости канала, сформированного тетра-мером белка М2. При этом происходит гидрофобное взаимодействие лиганда с белком без жесткой фиксации адамантана. У устойчивых вариантов вируса нарушается внедрение химиопрепаратов в канал, что является результатом изменения структуры участка вз аимодействия.
Предложена вторичная структура 7-го сегмента РНК вируса гриппа. В ней обнаружены консервативные (шпилечные, петлевые) и вариабельные участки. Основные зарегистрированные различия
структур сосредоточены вне шпилечных (петлевых) районов; следовательно, большинство нуклеотидных замен происходит вне консервативных участков РНК. Для некоторых эпидемических штаммов вируса гриппа установлено, что ген М2 полностью соответствует гену лабораторного вируса A/PR/8/34, который использовался для получения вакцинных штаммов. Можно предположить, что вирусы, использованные для вакцинации населения, явились донорами 7-го сегмента у природных устойчивых штаммов. Также не исключается возможность восстановления вирулентности реассортантных вакцин, полученных с использованием этого штамма, или сохранения ими жизнеспособности в следствии несовершенства технологий ин актив ации.
На основании полученных результатов в настоящее время Институтом гриппа (С.-Петербург) проводятся работы по конструированию противогриппозных химиопрепаратов с заданными свойствами.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи (1 статья в печати). Результаты работы представлены на 17-ом Международном Конгрессе по Химиотерапии ( Берлин, 1991г. ).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125_ страницах, включающих 20 рисунков, 3 таблицы и список литературы (164 ссылки). Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава 1 - "Вирус гриппа типа А. Проблема устойчивости вируса гриппа типа А к химиопрепаратам." (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫ). Глава 2 - Экспериментальная часть. Глава 3 содержит изложение и обсуждение результатов, полученных в работе.
