Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Белки теплового шока. Открытие семейства 11
1.2. Характеристика семейства белков теплового шока 11
1.3. Индукция синтеза белков теплового шока 13
1.4. Структура основных белков теплового шока 16
1.5. Функции белков теплового шока : 20
1.6. Особенности биологических активностей белков теплового шока в
опухолевой и неопухолевой клетках 21
1.7. Участие белков теплового шока в регуляции иммунного ответа 26
1.7.1. Стимуляция HSP неспецифического иммунного ответа 26
1.7.2. Стимуляция HSP специфического иммунного ответа 28
1.8. Методы лечения онкологических заболеваний 31
1.8.1. Основные виды противоопухолевых вакцин 33
1.9. Белки теплового шока как объекты , для иммунотерапии онкологических заболеваний 35
1.10. Использование вакцин на основе белков теплового шока в клинической практике . 39
Заключение 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Забор биологических образцов 43
2.2. Перевивка опухоли 43
2.3. Выделение и очистка белков теплового шока 43
2.4. Дот-блот 44
2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях 45
2.6. Вестерн-блот 45
2.7. Иммуноферментный анализ
2.8. Определение цитотоксической активности полученных фракций .47
2.9. Определение стимуляции синтеза ДНК 2.10. Определение содержания эндотоксина 49
2.11. Определение неспецифического иммунного ответа на аутологичные белки теплового шока в клетках моноцитарно-макрофагального ряда 49
2.12. Иммуногистохимическое исследование 50
2.13. Экспериментальное лечение животных 51
2.14. Оценка эффективности противоопухолевой терапии 54
2.15. Измерение размера опухоли 54
2.16. Гистологическое исследование 54
2.17. Окрашивание гематоксилин-эозином 55
2.18. Статистика 55
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 56
3.1. Выделение и очистка белков теплового шока 56
3.1.1. Определение условий гомогенизирования 57
3.1.2. Определение условий осаждения белков теплового шока 57
3.1.3. Определение условий хроматографирования 60
3.1.4. Оценка степени очистки фракций, обогащенных белками теплового шока 63
3.1.5. Выбор условий ингибирования протеолитической деградации
белков 65
3.1.6. Концентрирование фракций, содержащих белки теплового шока, после хроматографии на гепарин-сефарозе 68
3.1.7. Определение содержания эндотоксина в выделенном препарате белков теплового шока 72
3.1.8. Количественное определение содержания белков теплового шока 72
3.2. Анализ цитотоксической активности и стимуляции синтеза ДНК in vitro
3.3. Определение неспецифического иммунного ответа на аутологичные белки теплового шока в клетках моноцитарно-макрофагального ряда 75
3.4. Влияние радиотерапии на продукцию белков теплового шока в опухоли молочной железы 81
3.5. Исследование противоопухолевой активности in vivo
3.5.1. Выбор опухолевой линии и организация работы с экспериментальными животными 83
3.5.2. Использовавшиеся показатели оценки противоопухолевой активности
3.5.3. Изучение динамики роста опухоли 85
3.5.4. Изучение динамики смертности экспериментальных животных...90
3.5.5. Гистологическое исследование 92
3.5.6. Дополнительные показатели эффективности противоопухолевого лечения 101
Заключение 104
Выводы 108
Благодарности 109
Список литературы
- Индукция синтеза белков теплового шока
- Выделение и очистка белков теплового шока
- Определение условий осаждения белков теплового шока
- Использовавшиеся показатели оценки противоопухолевой активности
Введение к работе
Актуальность темы
Современная медицинская наука располагает широким арсеналом средств лечения опухолевых заболеваний. Наиболее традиционным подходом к противоопухолевой терапии является сочетание хирургического и терапевтического методов лечения. При этом немаловажное значение в результативности применения противоопухолевой терапии должно отводиться иммунной системе пациента: адекватный уровень иммунной защиты зачастую определяет успех противоопухолевого лечения. Известно, что при удалении материнской опухоли риск развития метастазов многократно увеличивается, особенно у пациентов с ослабленной иммунной системой. Поэтому стимуляция, как общего, так и специфического противоопухолевого иммунного ответа является неотъемлемой частью современных подходов к лечению опухолей.
В современных иммуномодулирующих средствах используется широкий набор механизмов, приводящих к стимуляции неспецифического и специфического иммунного ответа, - базисной защиты от появления чужеродных агентов (в том числе клеток) в организме. Клетки, подвергшиеся вирусному или бактериальному заражению, при адекватном состоянии иммунной системы, в общем и целом, могут быть мишенями для иммунной системы. Однако опухолевые клетки, являющиеся частью организма человека, не распознаются иммунной системой человека. Это обусловлено в частности тем, что опухоли характеризуются низкой иммуногенностью: на их поверхности отсутствуют белки, чужеродные для организма, благодаря которым они могли бы отличаться от нормальных клеток, и, следовательно, быть распознанными и уничтоженными иммунной системой. Таким образом, наиболее важным направлением для решения данной проблемы является разработка вакцин, способных вызвать специфический иммунный ответ против опухоли.
Современные биологическая и медицинская науки успешно развивают первое направление. В настоящее время существует множество разработок противоопухолевых вакцин на основе самых разнообразных подходов. Среди них - рекомбинантные опухолевые антигены, клеточные опухолевые лизаты, целые опухолевые клетки, вакцины на основе дендритных клеток, ДНК-вакцины и т.п. Однако, наряду с их неоспоримым достоинством, а именно способностью к стимуляции специфического иммунного ответа, все они обладают рядом недостатков: недостаточная индукция специфического иммунного ответа, технологические сложности изготовления, высокая стоимость и т.д.
Наиболее перспективным подходом, направленным на решение вышеуказанных проблем, является использование аутологичных вакцин. Материалом для изготовления таких вакцин является собственная опухолевая ткань пациента, удаленная хирургическим путем. Согласно многочисленным литературным данным, наибольшую противоопухолевую активность проявляют аутологичные вакцины на основе белков теплового шока (HSP, от англ. heat shock protein). Выполняя шаперонную функцию, они практически постоянно находятся в комплексах с пептидами, характерными для данной клетки. Это свойство позволяет выделять из опухолевых клеток комплексы, состоящие из HSP и антигенов, специфических для данной опухоли.
Аутологичная вакцинация активно изучается во многих ведущих медицинских центрах: согласно данным компании Antigenics, в настоящее время к участию в проведении клинических испытаний на основе HSP-вакцин допущено 69 клиник Европы и Америки. В настоящее время проводимые испытания находятся на различных стадиях (I, II, III фазы), что подтверждает противоопухолевую эффективность HSP-вакцин. В проведенных на данный момент клинических испытаниях уже показана стимуляция специфического иммунного ответа у 75% пациентов, что является высоким показателем и свидетельствует в пользу перспективности данного метода.
Несмотря на успешные результаты, полученные при изучении иммунотерапевтического лечения аутологичными HSP-вакцинами, остается нерешенным вопрос о том, как, при наличии специфического иммунологического стимулятора (комплексов «HSP-пептид»), повысить собственную иммуногенность опухоли и ее метастазов.
Важной проблемой, которая не позволяет расширить использование данного метода, является ограниченное количество опухоли, что осложняет получение необходимой дозировки вакцины. Следовательно, актуальным является поиск способов повышения иммуногенности опухоли и ее метастазов, а также повышение в ней количества антигенного материала, составляющего основу данной вакцины (в данном случае пептидных комплексов с HSP).
В данной работе предложена попытка решить указанные проблемы с целью повышения противоопухолевой эффективности аутологичных вакцин. Эта задача решалась двумя способами. Во-первых, основу получаемой вакцины составили не один, как в исследованиях Srivastava et al, а три белка теплового шока: hsp70, hsp90 и grp94 (далее hsp96). Это позволяет существенно увеличить количество ант игенного материала и расширить его спектр. Во-вторых, до хирургического удаления опухоли пациенту проводилась терапия препаратом Онкофер на основе радиоактивного железа (59Fe). 59Fe способно накапливаться в опухолевой ткани за счет связывания с белками-переносчиками, количество которых в новообразованиях повышено, и за счет у-излучения вызывать некроз опухолевых клеток и тромбозы в микроциркуляторном русле. Это, в свою очередь, вызывает гипоксический стресс, который способствует усилению продукции комплексов HSP со специфическими пептидами и, как следствие, ведет к повышению иммуногенности опухолевых клеток.
6 Цель и задачи исследования
Цель исследования: изучение противоопухолевой активности продукта на основе антиапоптотических аутологичных HSP в комплексе с опухолевыми антигенами, а также их комбинации с внешним стрессовым фактором in vivo.
Задачи исследования:
Разработать методику выделения и очистки комплексов «HSP+опухолевый антиген» из опухолевой ткани.
Оценить цитотоксичность полученного продукта in vitro.
Изучить влияние полученного продукта на неспецифический иммунный ответ ex vivo.
Оценить возможность использования внешнего стрессового фактора для повышения продукции HSP, как источника иммуногенного материала.
Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности аутологичных HSP (монопрепарат), внешнего стрессового фактора, а также их сочетания.
Научная новизна
Впервые разработана методика единовременного выделения и очистки пептидных комплексов на основе трех белков теплового шока, показана цитотоксическая безопасность данных комплексов in vitro. Продемонстрирована способность полученного продукта активировать неспецифический иммунный ответ ex vivo в зависимости от используемой дозы и времени. Впервые исследована возможность применения Fe59, как внешнего стрессового фактора, с целью повышения содержания белков теплового шока в опухолевой ткани, и впервые доказано, что эффективность комбинации полученного продукта с исследуемым стрессовым фактором in vivo является более высокой по сравнению с использованием монопрепаратов.
Практическая значимость работы
Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока за счет одновременного увеличения количества иммуногенного материала в вакцине и повышения иммуногенности самой опухолевой ткани.
Апробация диссертации
Апробация работы проведена на заседании кафедры биохимии ГОУВПО ММА им. И.М. Сеченова (6 декабря 2007 г.)
Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались: -на II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (февраль 2005 г., г. Москва);
-на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (октябрь 2005 г., г. Москва);
-на научно-практической конференции «Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентности до лікарських засобів» (ноябрь 2006 г., г. Киев); -на XXXII конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).
Публикации
По результатам проведенных исследований опубликовано 8 печатных работ.
Основные положения, выносимые на защиту
Предложена методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока.
Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7.
Полученный продукт дозо- и времязависимо увеличивает продукцию TNF-a в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.
Применение 59Fe, как внешнего стрессового фактора, п озволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока - материала для аутологичных вакцин.
Сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе HSP (монопрепарат), 59Fe, а также их сочетания показала, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает комбинированное применение.
Структура и объем диссертации
Индукция синтеза белков теплового шока
Основная функция HSP - шаперонная. В отсутствие стресса конститутивные формы белков активно участвуют в процессах фолдинга синтезированных пептидов в эндоплазматическом ретикулуме, а также в транспортировке пептидов в различные части клетки. При стрессовых воздействиях их функциональная активность расширяется: они отвечают за рефолдинг (восстановление поврежденной конформации белков клетки) и протеолитическую деградацию мисфолдинговых пептидов, поддерживая постоянство конформации белков клетки.
При этом существуют данные о том, что для каждого отдельного белка существует свой собственный набор пептидов, связывающихся с ним (Табл. 4). 1.6. Особенности биологических активностей белков теплового шока в опухолевой и неопухолевой клетках
В случае возникновения и развития опухолевой ткани структура и функции HSP не изменяются, и они также играют важную роль в жизнедеятельности клеток. Однако при этом возникают определенные различия по составу HSP между опухолевыми и нормальными неопухолевыми клетками организма.
Комплекс инициации репликации ДНК Кальмодулин SV40 Т-антиген Микротубулы Одной из основных причин возникновения опухолей является нарушение генетической стабильности клетки, что приводит к появлению мутантных форм белков. Это касается любых белков, но не HSP: их структура и свойства в опухолевой клетке остаются неизменными.
Нарушение генетической стабильности клетки повышает активность всех изоформ HSP и стимулирует экспрессию их индуцибельных вариантов (Рис. 1.3). На фоне активно пролиферирующей опухолевой ткани развивается относительная гипоксия опухоли, поскольку ее рост опережает скорость синтеза новых сосудов. Нарастающая гипоксия из-за более низкой скорости неоангиогенеза является одним из основных стрессовых факторов, активирующих синтез HSP. За счет низкой дифференцировки опухоли становятся также более чувствительными и к другим стрессовым факторам.
В итоге, в составе опухолевых клеток будет происходить значительное увеличение содержания индуцибельных форм HSP по сравнению с неопухолевыми клетками. Вместе с тем, поскольку опухоли постоянно подвергаются стрессовым воздействиям, комплексы HSP с пептидами клетки, в том числе и с опухоль-специфичными («HSP-пептидные» комплексы), будут находиться в клетках практически постоянно.
Другим важным отличием опухолевых клеток будет увеличение количества HSP, предотвращающих развитие их запрограммированной гибели (апоптоза). Согласно литературным данным, HSP играют важную и разнообразную роль в регуляции процесса апоптоза: часть HSP (проапоптотические HSP) участвуют в развитии апоптоза (hsp60, hsplO), другая часть, - антиапоптотические HSP, - наоборот, препятствуют этому (hsp70, hsp90 и др.) [Sreedhar A.S. et al., 2004].
В опухолевых клетках семейство HSP представлено в основном антиапоптотическими белками, что вносит свой вклад в выживаемость опухолей [Wei Y.Q. et al., 1995; Gibbons N.B. et al., 2000]. Так, исследованиями in vitro (линии U937 и Wehi-s) показано, что развитие апоптоза в значительной степени зависит от уровня синтеза hsp70: высокий уровень его продукции препятствует апоптозу клеток, вызываемому актиномицином-D в концентрации 5 мкг/мл, камптотецином (5 мкг/мл), этопозидом (25 мкг/мл) [Samali A. et al., 1996]. В экспериментах in vitro также доказана антиапоптотическая роль hsp70 при воздействии повышенных температур [Li W.X. et al., 1996]. Кроме того, показано, что ингибирование активности hsp90 приводит к связыванию DD-белков, с их рецепторами и запуску апоптоза [vanden Berghe Т. et al., 2003].
Нужно отметить, что в разных клетках имеется своя специфика определенного пула анти-апоптотических HSP. К примеру, в новообразованиях молочной железы повышено содержание hsp70, а при раке простаты - hsp90 [Nylandsted J. et al., 2000; Akalin A. et al., 2001]. В результате повышения концентрации белков в клетках опухолей они начинают в большей степени связывать молекулы, стимулирующие апоптотический процесс, приводя к ингибированию их действия и последующей деградации.
При апоптозе HSP связываются с основными звеньями (молекулами) цепи передачи т.н. «сигнала смерти» [Beere Н.М. et al., 2001]. Под действием стрессового фактора, подействовавшего на клетку, из митохондрии выходит цитохром С, выход которого может быть блокирован hsp70, способным изменять конформацию митохондриальных пориновых белков. В случае попадания в цитозоль цитохром С соединяется в комплекс с белком Apaf-1, далее происходит сборка олигомера, состоящего из этих комплексов. При этом олигомеризация может быть блокирована комплексом на основе антиапоптотических белков, - hsp70 или hsp90, - что предотвратит процесс апоптоза [Soti С. et al., 2003].
На следующем этапе развития проапоптотических каскадов образовавшийся олигомер, состоящий из комплексов Apaf-1 с цитохромом С, соединяется с индуцирующими каспазами, в частности с неактивной прокаспазой-9, что переводит её в активное состояние, то есть в каспазу-9. Присоединение индуцирующих каспаз к олигомеру может быть блокировано hsp70, hsp27 и hsp90 [Soti С. et al., 2003].
После образования комплекса олигомера с каспазой-9 к ним присоединяется эффекторная неактивная прокаспаза-3, переходящая в активную форму - каспазу-3, и процесс апоптоза приобретает необратимый характер (Рис. 1.6) [Обухов А.А. и др., 2007]. Многие виды опухолей не имеют механизма созревания каспазы-3, чем достигается их иммортальность.
Кроме того, антиапоптотическая способность опухолевых клеток достигается и за счет активации ядерного фактора активации транскрипции генов (NF-kB), участвующих во множестве пролиферативных каскадных реакций (Рис. 1.7) Одним из стимуляторов активации NF-kB является hsp90 [ChiosisG. etal.,2004]. Hsp-60+ Hsp-ю -Цит C\5 Apafl П-Касп w
Участие различных HSP в регуляции апоптоза [Garrido С. et al., 2001]. Основными антиапоптотическими белками опухоли являются hsp27, hsp70 и hsp90. Они останавливают развитие апоптоза, оказывая влияние на все звенья развития апоптоза. Под действием стрессового фактора (1), подействовавшего на клетку, из митохондрии выходит цитохром С (2), выход которого может быть блокирован hsp70 (3). В случае попадания в цитозоль цитохром С соединяется в комплекс с белком Apaf-І и активировать каспазу-9 (4). Олигомеризация может блокироваться комплексом hsp70 и hsp90 (5). Затем с комплексом взаимодействует и активируется каспаза-3 (6). Этот этап может блокироваться hsp27 (7) или активироваться проапоптотическими hsp60 и hsplO (8).
Другим вкладом HSP в анти-апоптотическую стимуляцию опухолей является их участие в защите клеток от действия химиотерапевтических средств, а именно в развитии MDR. Это объясняется, в том числе, способностью HSP связывать пептиды транспортных систем, участвующих в работе MDR, активация которых приводит к гибели клеток [Kiang J.G. et al., 1998].
За счет работы MDR-насоса развивается устойчивость опухолевых клеток на фоне химиотерапии. Эта устойчивость возрастает еще сильнее после воздействия на опухоль тепловым шоком [Kiang J.G. et al., 1998]. Показано, что в обратном транспорте химиопрепаратов принимают активное участие малые HSP (hsp20, hsp27 и т.п.). Необходимо отметить, что одним из свойств некоторых противоопухолевых препаратов является их способность связываться с HSP, что ингибирует их активность. Так, например, известный противоопухолевый препарат цисплатин блокирует С-концевой домен hsp90, убирая его из антиапоптотического каскада [Hettinga J.V. et al., 1996; Soti С. et al., 2002].
Выделение и очистка белков теплового шока
Для определения цитотоксическои активности белковых фракций in vitro использовали следующие клеточные линии: НГУК1 - невринома Гассерова узла крысы (Институт морфологии человека и животных РАМН) [Авцын А.П. и др., 1989]; MCF7 - аденокарцинома молочной железы человека (Национальные Институты Здоровья, Бетесда, США); Hela-Gal - эпителиальная карцинома шейки матки человека Hela-CD4-LTR-p-Gal, инфицированная ретровирусным вектором, экспрессирующим CD4+ (Национальные Институты Здоровья, Бетесда, США); К-562 - суспензионная культура клеток эритромиелолейкозной линии человека (Институт Полиомиелита РАМН); ФЭЧ- эмбриональные фибробласты человека (Институт Полиомиелита РАМН); Клетки культивировали в 48-луночных планшетах («Nunc», Дания) при 37С, 5% С02, 10% эмбриональной телячьей сыворотки («GibcoBRL») и антибиотики (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, ПанЭко, Россия), в средах RPMI1640 (НГУК1 и К-562), ДМЕМ (Hela-Gal), Игла-МЕМ (MCF7 и ФЭЧ), содержащей 2 мМ L-глутамин. Клетки культивировали до состояния 80% конфлюента, в течение 24 - 48 часов.
Определение цитотоксической активности белковых фракций in vitro проводили, добавляя к клеткам в состоянии плотного монослоя от 5 до 50 мкл препарата HSP, содержащего от 0,5 до 40 мкг белка. Через 24 часа определяли цитотоксичность очищенных HSP, используя тест на рост-стимулирующую активность с использованием МТТ («Sigma») (МТТ-тест) [Mossman Т., 1983]. Для этого в каждую лунку добавляли 0,15 мл 0,5%-ного раствора МТТ и инкубировали при 37 С в течение 3-х часов. Затем тщательно удаляли культуральную среду, кристаллы формазана растворяли, добавляя 0,2 мл диметилсульфоксида («Fluka»). Поглощение окрашенного раствора измеряли на мультискане «Plus Р Ver. 2.03» («LabSystem», Финляндия) при 492 нм. Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля (питательная культуральная среда, не содержащая исследуемый белковый препарат). Определение цитотоксической активности исследуемого белкового препарата проводили в 3 параллельных опытах.
Тест на определение стимуляции синтеза ДНК проводили, добавляя к клеткам через 20 часов инкубации с белковыми препаратами 15 мкл раствора С14-тимидина («Изотоп», Россия), с удельной радиоактивностью 56 мКи/мМ, содержащего 1,0 мкКи меченого тимидина. Время мечения составляло 5 часов. Измерение включения С14-тимидина и определение числа клеток в лунке проводили с использованием стандартных радиометрических методов в жидком сцинтилляторе с использованием жидкости Брея [Abakumova O.Yu. et al., 1998]. Результаты выражали в имп/мин на 106 клеток и в процентах к контролю. Определение стимуляции пролиферации исследуемого белкового препарата проводили в 3 параллельных опытах. 2.10. Определение содержания эндотоксина
Для определения соответствия полученного продукта требованиям, предъявляемым препаратам, парентерального введения, а также для устранения влияния липополисахаридов бактерий на результаты исследований продукта, выделенные белки были проверены на содержание эндотоксина методом LAL-тест по стандартной методике, в соответствии с инструкциями производителя [Ситникова А.Г. и др., 1994]. Анализ проводили в апирогенных пробирках из натриевого стекла размером 10 х 75 мм. Реакционная смесь состояла из 0,1 мл раствора LAL-реактива и 0,1 мл испытуемого раствора. После перемешивания внесенных объемов реакционные смеси немедленно помещали в термоблок. Температура инкубирования +37 ± 1 С, время инкубирования 60 ± 2 минуты. После окончания инкубирования пробирки вынимали из термоблока и переворачивали на 180 С. Положительным считался результат, при котором на дне пробирки образовывался твердый гель, который не разрушался при ее переворачивании на 180. Это означало, что концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом растворе выше, либо равна чувствительности LAL-реактива. Если гель не образовывался или разрушался при переворачивании пробирки, результат считался отрицательным.
Заявленная чувствительность LAL-реактива Pyrogent («Cambrex», Великобритания), предназначенного для проведения анализа гель-тромб тестом составляла 0,03 ЕЭ/мл.
Лимфоциты выделяли из цельной гепаринизированной крови мыши по стандартной методике [Бейум А., 1980]. Кровь наслаивали на смесь фиколла урографина («ПанЭко», Россия) (р= 1,082 г/смЗ) и центрифугировали в течение 45 мин при комнатной температуре (3000 g). Группирующиеся в интерфазном слое лимфоциты собирали и после 2-кратной отмывки в растворе Хэнкса ресуспендировали в среде RPMI1640.
Клетки культивировали в среде RPMI1640 с 10% FBS при 5% С02. Клетки инкубировали с аутологичными HSP в течение 2, 24 и 48 ч. Очищенные белки добавляли в концентрациях 0,2 нг белка/10б клеток, 2 нг белка/10 клеток, 12 нг/106 клеток. В качестве положительного контроля активатора продукции TNF-oc использовали иммуномодулятор Полиоксидоний («Иммафарма», Россия) в стандартных концентрациях, рассчитанных на 106 клеток [Dyakonova V.A., 2004].
Подсчет количества живых клеток проводили в камере Горяева с использованием 0,1% раствора трипанового синего. В каждую пробу для определения цитокинов добавляли 1-2 миллиона лимфоцитов.
Для иммуногистохимического исследования использовали серийные криостатные срезы, которые фиксировали охлажденным ацетоном в течение 5 минут. В работе применяли иммунопероксидазный метод [Kurstak Е. et al., 1969] с использованием моноклональных антител к hsp70 (1:100) и hsp90 (1:100). Первичные антитела выявляли с помощью визуализирующей системы EnVision (DAB+) («Dako», Дания). Срезы докрашивали гематоксилином («ПанЭко»). В качестве контроля использовали замену первичных антител 0,1% раствором БСА.
При интерпретации результатов учитывали локализацию и интенсивность окрашивания, которую оценивали полу количественным методом по следующим критериям: (+) - умеренная реакция, (++) - сильная (выраженная) реакция. 2.13. Экспериментальное лечение животных
Определение условий осаждения белков теплового шока
Согласно литературным данным, для гомогенизирования опухолевой ткани с целью выделения максимального количества комплексов «HSP-пептид» предпочтительнее использовать 10 мМ - 30 мМ раствор ЫаНСОз [Basu S. et al., 1999; Ishii Т., 1999; Menoret A. et al., 2000; Noessner E. et al., 2002; Peng P. et al., 1997]. По данным наших предварительных экспериментов, использование раствора ИаНСОз при выделении пептидных комплексов из опухолевой ткани молочной железы мыши и человека так же способствовало повышению уровня их выделения.
Мы проанализировали условия выделения белков с использованием растворов ИаНСОз различной ионной силы (10-30 мМ). Наиболее высокий уровень выделения белков был обнаружен в случае использования раствора ЫаНСОз с наименьшей ионной силой. Это объясняется тем, что выбранные условия способствовали наиболее полному разрушению эндоплазматического ретикулума, в котором располагается один из выделяемых белков - hsp96 [Robert J., 2003; Todryk S.M. et al, 2003].
При этом нами было изучено влияние продолжительности воздействия буфера для гомогенизирования на лизис эндоплазматического ретикулума и, как следствие, на степень извлечения hsp96 из опухолевой ткани: эндоплазматический ретикулум является основным источником hsp96. Методами спектрофотометрического и иммуноферментного анализа было показано, что время воздействия лизирующего буфера не влияет как на выход суммарного белка, так и на выход hsp96. Это свидетельствует о значительной лизирующей способности выбранного буфера для гомогенизирования и о высокой скорости лизиса эндоплазматического ретикулума.
Согласно литературным данным, высокой степени осаждения HSP удается достичь в нейтральной среде при 30-70% насыщении (NH SC [Basu S. et al., 1999; Meng S.-D. et al., 2002; Menoret A. et al.5 2000; Sato K. et al., 2001; Wang X.-Y.etal., 2004]. Для определения необходимых границ осаждения белков (NH SC нами было проведено исследование двухступенчатого осаждения при различных степенях насыщения в интервале 30-70%. В результате эксперимента было обнаружено, что белок hsp70 имеет наиболее размытые границы осаждения, а наиболее оптимальный режим составляет от 35 до 65% насыщения (NH SC . При этом после 35% осаждения все HSP оставались в растворе, после 65% насыщения белки выпадали в осадок, который для дальнейших манипуляций растворяли в 10 мМ фосфатном буфере. В Таблице 7 приведены выходы HSP после 35% и 65%) осаждения (NH4)2S04 в процентах к содержанию белков в полученном гомогенате, которое принято за 100%.
С целью более глубокой очистки HSP на данной стадии было проведено исследование трехступенчатого осаждения белков. Нами использовались 35%), 65% и 80% насыщения (NH4)2S04. В ходе эксперимента после 35% насыщения (NH SC пептидные комплексы находились в растворе, после 65% и 80% насыщения - комплексы выпадали в осадок, после 65% насыщения (NH SC для последующего осаждения растворяли в 0,0625М трис-HCl, после 80% насыщения осадок растворяли в 10 мМ фосфатном буфере.
В результате эксперимента было показано, что трехступенчатое осаждение белковых комплексов приводит к намного более значительным потерям HSP, а в случае hsp90 - полным, и при этом практически не влияет на степень очистки белков.
Таким образом, на стадии осаждения белков наиболее оптимальным является двухступенчатое осаждение белков с использованием 35% и 65% насыщений (NH SC . Выбранный диапазон позволяет получить HSP с наибольшей степенью выхода и очистки, что было доказано электрофоретическим разделением белков в денатурирующих условиях, а также иммуноферментным анализом.
Согласно литературным данным, основным способом очистки HSP является аффинная хроматография. При этом в качестве основных носителей при аффинной хроматографии белков применяют гепарин-сефарозу или АДФ-агарозу (чаще - гепарин-сефароза) [Остерман Л.А., 1985]. Для элюции белков с носителя чаще используется неспецифическая элюция в линейном градиенте мочевины, гуанидинхлорида и др.
Для определения условий хроматографирования в качестве носителя нами была выбрана гепарин-сефароза. При изучении условий очистки белков и оптимального градиента NaCl методом УФ-спектрофотометрического исследования нами методом дот-блота было обнаружено, что часть белков hsp70 и hsp90, образующих слабые связи с носителем, удается элюировать путем усиления ионной силы буфера - то есть при промывании колонки 20 мМ фосфатным буфером, без использования градиента элюэнта. Однако это не оказывало влияния на выход белка hsp96, следовательно, для очистки данного белка требовалось использование дополнительных условий.
С этой целью нами было проведено исследование линейного градиента 0-1 М NaCl в буферах с различной ионной силой (10, 15, 20 и 25 мМ фосфатном буфере). В результате эксперимента методом дот-блота было показано, что пик hsp96 выходил из колонки при концентрации NaCl в интервале 0,05(0,1)-0,5 М, однако в случае 10 и 15 мМ фосфатного буфера он был практически неотделим от пика примесных белков. Вместе с тем, наиболее оптимальным было использование 20 мМ фосфатного буфера. Таким образом, для разделения пиков HSP и примесных белков является использование градиента 0,05-0,7 М NaCl в 20 мМ фосфатном буфере.
Использовавшиеся показатели оценки противоопухолевой активности
Среди различных средств для лечения онкологических больных достаточно широкое распространение получили радиофармацевтические препараты (РФП) - средства, содержащие радиоактивные нуклиды. Недостатками их применения являются пирогенные и аллергические реакции, затрудненность дозирования и невозможность в случае необходимости прекращения облучения и выведения РФП из организма.
Одним из новых РФП, разработанных для лечения новообразований, является оригинальный препарат, представляющий радиоактивный нуклид 59Fe наведенной активностью 0,8 мкКи на одну дозу препарата (Онкофер) [КешелаваВ.В.,2000].
Принцип действия препарата заключается в распространении железа током крови в организме больного, избирательном накоплении в опухолевой ткани, клетках и воздействии на них излучением. Это позволяет достичь высокого лечебного эффекта независимо от количества и места расположения опухоли, макро- и микро метастазов и подвергнуть разрушению опухолевые клетки, располагающиеся в кровеносном и лимфатическом русле, что доказано при воздействии на опухоли молочной железы, яичников, головного мозга и др. [Кешелава В.В., 2001; Кешелава В.В., 2000; Кешелава В.В., 1994].
Для исследования влияния радиации, как стрессового фактора, на продукцию HSP в аденокарциноме молочной железы нами использовался противоопухолевый препарат Онкофер, содержащий радиоактивное железо 59Fe. Препарат был выбран вследствие своей способности избирательно накапливаться в опухоли и, таким образом, оказывать локальное действие, нанося минимальный вред организму больного. Рис. 3.12. Влияние радиации на продукцию HSP. Стрелками показана продукция белка hsp70. Окрашивание гематоксилином. Антитела к hsp70.
Методом иммуногистохимического анализа исследовали образцы ткани до лечения препаратом (биоптаты) и через неделю после лечения (после хирургического удаления опухоли). В результате было зафиксировано увеличение содержания hsp70, - основного стрессового антиапоптотического белка опухоли молочной железы (рисунок 3.12). Наибольшая интенсивность окрашивания (содержания HSP) внутри клеток приходилась на ядра клеток, что свидетельствует об увеличении экспрессии генов, кодирующих данный белок теплового шока.
Таким образом, было показано стимулирующее действие радиации (59Fe) на продукцию HSP в аденокарциноме молочной железы.
Согласно литературным данным проведено большое количество исследований противоопухолевых свойств как отдельных белков теплового шока, так и их комплексов с опухоль-специфическими пептидами. Однако многие из таких исследований не отражают полную картину противоопухолевых эффектов вакцин на основе HSP. Более того, эксперименты по изучению противоопухолевой активности вакцин на основе нескольких HSP или их комплексов с опухоль-специфическими пептидами не проводились.
Многими исследователями проводились эксперименты по определению влияния различных внутренних и внешних стрессовых факторов на продукцию HSP в клетке, однако подобные эксперименты не рассматривались с точки зрения повышения содержания иммуногенного материала в опухолевой ткани или в качестве факторов, повышающих эффективность противоопухолевой иммунотерапии.
Вследствие данных обстоятельств нами был поставлен эксперимент по изучению противоопухолевой активности вакцины на основе нескольких HSP (hsp70, hsp90, hsp96), а также по определению целесообразности включения стрессового фактора, повышающего содержание HSP в опухоли, в иммунотерапию. В соответствии с вышеуказанными целями в эксперименте участвовало 2 контрольных и 3 опытных группы: I. Отрицательный контроль (норма) II. Положительный контроль III. Группа, получавшая препарат Онкофер (59Fe) IV. Группа, получавшая иммунотерапию вакциной V. Группа, получавшая комбинированную терапию
В соответствии с нормативной документацией по доклиническому изучению новых фармакологических веществ, стандартом по изучению противоопухолевых препаратов для лечения опухоли молочной железы на экспериментальных животных является аденокарцинома мыши Са755 (10x10 клеток/мышь), в качестве экспериментальных животных рекомендуется использование линейных мышей линии C57B16/J [Хабриев Р.У., 2005].
Содержание экспериментальных животных и работу с ними проводили в сертифицированном виварии с использованием общепринятых методов в соответствии с требованиями правил Надлежащей Лабораторной Практики (GLP) и Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005].
Аутологичность использования вакцины достигалась за счет линейности экспериментальных животных. Мышей линии C57B16/J первоначальной группы с привитой аденокарциномой молочной железы (около 10 животных) забивали (через 10-12 дней с момента перевивки) и далее производили выделение и очистку «HSP-пептидных» комплексов из опухолей; второй группе мышей той же линии перевивали ту же опухоль и через 12 дней начинали лечение.
Интервалы введения препарата Онкофер были выбраны в соответствии с доклиническими исследованиями препарата. Дозировка и способ введения вакцин на основе «HSP-пептидных» комплексов предполагала введение поддерживающих доз продукта с учетом развития противоопухолевого иммунного ответа.
Оценку противоопухолевого действия проводили в соответствии с общепринятыми требованиями, а также требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005]. Измерение частоты метастазирования было исключено вследствие того, что аденокарцинома молочной железы мыши Са755 не образует метастазов.
