Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1. Структурные белки хрусталика и системы поддержания их нативности 11
1.1.1. Особенности строения и функции хрусталика 11
1.1.2. Р-, у- и сс-кристаллины 13
1.1.3. Шаперон-подобная активность а-кристаллина 18
1.2. Повреждения и агрегация кристаллннов как первичный механизм катарактогенеза 22
1.3. Короткоцепочечные пептиды и их антикатарактальное действие 32
II. Материалы и методы исследования 39
II.З. Исследование полипептидного состава кристаллннов методом ПААГ- электрофореза 44
II.4. Индукция ультрафиолетовой и тепловой агрегации pL-кристаллина и смесей ее- и рь-кристаллинов 45
II.5. Метод анализа экспериментальных кривых агрегации 48
II.6. Определение количества карбонильных групп в Рь-кристаллине 50
II.7. Исследования растворов кристаллннов методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). 50
II.8. Триптофановая флуоресценция. 52
III. Результаты исследования и обсуждение 53
III.1. Характеристика моделей агрегации кристаллннов 53
III. 1.1 Тепловая агрегация 54
III. 1.1.1 . Анализ кинетических кривых тепловой агрегации Д-кристаллина 54
III. 1.1.2. Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина 57
Ш. 1.1.3. Механизм шаперон-подобной активности а-кристаллина при тепловой агрегации Рь-кристаллина 60
III. 1.2. УФ-индуцированная агрегация 64
III. 1.2.1. Анализ кинетических кривых УФ-агрегации /%,-кристаллина 64
III. 1.2.2. Кинетика УФ-агрегации Рь-кристаллина в присутствии яг-кристаллина 67
III. 1.2.3. Оценка "экранирующего эффекта" в защитном действии ог-кристаллина 70
III. 1.2.4. УФ-повреждения рь- и ог-кристаллинов 73
III. 1.2.5 . Усиление шаперон-подобного действия or-кристаллина под влиянием УФ- облучения 81
III. 1.2.6. Разделение во времени процессов УФ-повреждения и агрегации кристалл инов 88
III.2. Изучение взаимодействия короткоцепочечных пептидов с кристаллинами 92
III.2.1. Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-агрегации pL- кристаллина 92
III.2.2. Влияние короткоцепочечных пептидов на разделенную УФ-агрегацию рь-кристаллина 97
III.2.3. Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой агрегации PL- кристаллина 100
III.2.4. Влияние короткоцепочечных пептидов на количество карбонильных групп в pL-кристаллине при УФ-облучении 103
III.2.5. Влияние короткоцепочечных пептидов на размеры частиц Рь-кристаллина при УФ-облучении 105
III.2.6. Исследование действия КЦП на УФ-агрегацию смеси а- и Рь-кристаллинов 111
III.2.7. Влияние пантетина на размеры а-кристаллина 115
Заключение 118
Выводы 120
Список цитируемой литературы 122
- Особенности строения и функции хрусталика
- Индукция ультрафиолетовой и тепловой агрегации pL-кристаллина и смесей ее- и рь-кристаллинов
- . Анализ кинетических кривых тепловой агрегации Д-кристаллина
- . Усиление шаперон-подобного действия or-кристаллина под влиянием УФ- облучения
Введение к работе
ос-Кристаллин, структурный белок хрусталика глаза млекопитающих, обладает шаперон-подобной активностью и подавляет агрегацию дестабилизированных белков в хрусталике, преимущественно (3- и у-кристаллинов. Взаимодействие ос-кристаллина с |3- и у-кристаллинами в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании прозрачности и светопреломляющих свойств этого органа (Ponce et al., 2006; Takemoto and Sorensen, 2008). Аминокислотные последовательности субъединиц ос-кристаллина гомологичны малым белкам теплового шока. Известно, что ос-кристаллин способен взаимодействовать с поврежденными белками, образуя стабильные водорастворимые комплексы, сохраняя субстраты в фолдинг-компетентном состоянии, и, возможно, осуществляя их рефолдинг (Wang and Spector, 2001).
Хорошо известно, что агрегация белков является ключевой стадией формирования катаракты, или стойкого помутнения хрусталика. Агрегации способствует высокая концентрация кристаллинов в цитоплазме волоконных клеток (400 мг/мл и более), аккумуляция повреждений в белках и практически полное отсутствие обмена белков в центральной области хрусталика. Согласно одной из современных патогенетических концепций, катаракта является «конформационным заболеванием», или следствием нарушения фолдинга кристаллинов при ослаблении шаперон-подобной функции ос-кристаллина в клетках хрусталика, приводящем к агрегации структурных белков (Harding, 1998; Bloemendal et al., 2004; Wang et al., 2008). Шаперонные свойства ос-кристаллина ухудшаются с возрастом, вследствие процессов окисления, гликозилирования и частичного протеолиза, что, по всей видимости, служит основной причиной усиления агрегации белков хрусталика (Derham and Harding 1997; 2002).
Предотвращение или замедление агрегации цитоплазматических белков в клетках хрусталика является перспективным способом профилактики и консервативного лечения катаракты. В настоящее время в медицине в качестве основного средства используется хирургическое лечение катаракты, которое, несмотря на значительный прогресс в последние годы, имеет ряд существенных недостатков. Теоретическая возможность предупредить помутнение хрусталика путем торможения агрегации его структурных белков делает актуальным поиск веществ, действующих как на процесс агрегации белков, так и на защитную активность ос-кристашшна.
По данным лабораторных и клинических исследований, короткоцепочечные пептиды карнозин, N-ацетилкарнозин и пантетин эффективны при профилактике и лечении катаракты различной этиологии (Аветисов и соавт., 2008; Болдырев, 1999, Babizhaev et al., 2002, Clark et al., 1996, Williams and Munday, 2006). Молекулярные механизмы действия этих препаратов не ясны. Предполагают, что в основе молекулярного действия карнозина и N-ацетилкарнозина лежит способность тормозить процессы свободно-радикального окисления белков и липидов хрусталика, или (и) снижать уровень гликирования белков. Эффекты пантетина, возможно, связаны с ковалентной модификацией и изменением гидрофильности кристаллинов. Не исключено, что эти дипептиды могут воздействовать и на другие стадии процесса катарактогенеза, в частности, денатурацию и агрегацию кристаллинов.
Карнозин и N-ацетилкарнозин относятся к группе гистидин-содержащих дипептид ов (ГСД). Это природные соединения, накапливающиеся в возбудимых тканях позвоночных животных в миллимолярных концентрациях. ГСД in vivo участвуют в регуляции гомеостатических и иммунных процессов. У ГСД выявлен ряд терапевтических свойств, среди которых ранозаживляющие, радиозащитные, противоопухолевые и адаптогенные. Эффекты ГСД связывают с механизмами антирадикальной
активности, буферного действия в нейтральной области рН, антигликирующего действия и ряда других (Boldyrev, 2006). Пантетин -природный тетрапептид, компонент кофермента А. Пантетин способен вызывать ковалентную модификацию сульфгидрильных групп белков, образуя смешанные дисульфиды (Brandwein et al., 1981).
В ряде работ in vitro показано, что короткоцепочечные пептиды способны препятствовать тепловой агрегации белков (La Rosa et al., 2005), усиливать шаперон-подобную активность а-кристаллина (Clark and Huang, 1996) или проявлять собственную шаперон-подобную активность (Sharma et al., 2000; Ghosh et al., 2005; 2007). С другой стороны, обнаружено, что определенные низкомолекулярные пептидные фрагменты кристаллинов могут способствовать агрегации {3- и у-кристаллинов и редуцировать шаперон-подобную активность а-кристаллина (Santhoshkumar et al, 2008; Udupa, P.E and Sharma, 2005). Общие закономерности действия пептидов на агрегацию кристаллинов не установлены.
Мы предположили, что действие короткоцепочечных пептидов in vivo может быть направлено на процесс агрегации белков хрусталика. Настоящая работа посвящена проверке этой гипотезы с помощью специально разработанных нами моделей агрегации белков in vitro. Поскольку в хрусталике млекопитающих преобладает (3-кристаллин, он выбран в качестве белка-субстрата для модельных исследований шаперон-подобного действия а-кристаллина. Выбор ди- и тетрапептидов для экспериментов обусловлен предположительно неодинаковыми механизмами их действия на разные компоненты шаперон-субстратной системы.
Исследуемая проблема находится на стыке биохимии и медицины, а поэтому представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для практической лекарственной терапии и профилактики патологических изменений в хрусталике. Поскольку катаракта является самой
распространенной патологией зрения в развитых странах, возможность ее терапевтического лечения весьма актуальна. С другой стороны, изучение процессов агрегации белков и шаперон-подобной активности а-кристаллина будет способствовать выяснению его функций в различных тканях в норме и при патологических нарушениях. Кроме этого, решение проблемы нежелательной агрегации белков важно не только для медицинских задач, связанных с «конформационными заболеваниями», но и биотехнологических задач, связанных с неспецифической агрегацией рекомбинантных белков в клеточных культурах.
Цель и задачи работы Целью настоящей работы было сравнение
шаперон-подобного действия а-кристаллина и природных
короткоцепочечных пептидов (карнозина, N-ацетилкарнозина, анзерина и пантетина) на агрегацию кристаллинов, основанное на анализе кинетики УФ-агрегации (Зь-кристаллина бычьего хрусталика.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие практические задачи:
Разработать модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации [3L-кристаллина и смеси а- и Рь-кристаллинов
Изучить кинетику тепловой и УФ-индуцированной агрегации pL-кристаллина и смесей а- и (Зь-кристаллинов при различных концентрациях белков
Охарактеризовать шаперон-подобную активность УФ-облученного и нативного а-кристаллина
Оценить эффекты короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-индуцированной агрегации pY-кристаллина смесей а- и (Зь-кристаллинов
Охарактеризовать взаимодействие короткоцепочечных пептидов с кристаллинами
Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное исследование, в котором впервые количественно охарактеризовано влияние различных короткоцепочечных пептидов на кинетику агрегации (3L-кристаллина и смесей а- и pL-кристаллинов, и на основании полученных экспериментальных данных предложен механизм их действия. В работе была использована оригинальная установка для регистрации кинетических кривых агрегации белка при УФ-облучении в режиме реального времени. Установлено, что N-ацетилкарнозин и анзерин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-агрегации Рь-кристаллина, что сопровождается уменьшением размеров агрегатов белка. D-пантетин, в отличие от ГСД, дозо-зависимым образом замедляет УФ-агрегацию смеси а- и Рь-кристаллинов, что связано со специфической модуляцией активности а-кристаллина D-пантетином. Показано, что УФ-облучение усиливает шаперон-подобную активность а-кристаллина по отношению к рь-кристаллину в связи с конформационной перестройкой а-кристаллина под действием УФ света.
Практическое значение работы. Изучение молекулярных эффектов
короткоцепочечных пептидов на взаимодействия между кристаллинами in
vitro будет способствовать пониманию тонких механизмов агрегации белков.
Успехи в этом направлении могут стать основой для раскрытия механизмов
катарактогенеза на молекулярном уровне и направленного синтеза
антикатарактальных препаратов пептидной природы, способных блокировать
агрегацию или модулировать шаперон-подобную активность а-кристаллина.
Выяснение структурно-функциональной связи активности
короткоцепочечных пептидов в отношении кинетки агрегации белков может стать отправной точкой для создания препаратов-антиагрегантов.
Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005),
Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), II Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (2008). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 44 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 отечественных и зарубежных источников.
Особенности строения и функции хрусталика
Хрусталик — это часть светопреломляющего аппарата глаза, в состав которого входят также роговица и стекловидное тело. Основной функцией хрусталика является динамическое фокусирование изображения на сетчатке. Хрусталик обеспечивает около трети преломляющей силы глаза (приблизительно 60 диоптрий), и для выполнения своей функции должен сохранять прозрачность.
Хрусталик имеет двояковыпуклую форму и подвешен с помощью цинновой связки между радужкой и стекловидным телом. Хрусталик окружен соединительнотканной капсулой, изнутри спереди покрыт однослойным эпителием, а его ткань состоит из специализированных волоконных клеток (Мальцев, 1988) (рис. 1).
Центральная область хрусталика - ядро - формируется на стадии эмбриона из эктодермы и в дальнейшем постепенно окружается более молодыми клетками. Новые волоконные клетки формируются из клеток эпителия хрусталика и образуют кортекс. В зрелом хрусталике удлиненные клетки-волокна гексагонально упакованы и образуют концентрические слои, в которых более старые клетки находятся в центре, а более молодые - на периферии. Клетки смежных концентрических слоев сцеплены десмосомами, что обеспечивает механическую прочность и регулярность структуры ткани, необходимых для поддержания прозрачности органа. В ходе дифференцировки волоконные клетки хрусталика синтезируют специфические белки - кристаллины, и постепенно заполняются ими. Концентрация белков в центральной области хрусталика человека может достигать 450 мг/мл (Horwitz, 2003). Метаболическая активность в волокнах хрусталика уменьшается от периферии к центру. Первоначально волоконные клетки содержат клеточные органеллы, однако на последней стадии дифференцировки волокна теряют митохондрии, рибосомы и ядра, в процессе, сходном с началом апоптоза. Таким образом, цитоплазма клеток центральной области хрусталика становится однородной, и при прохождении через нее свет не рассеивается (Stafford, 2001).
Схема строения хрусталика глаза млекопитающих Лишенные органелл клетки утрачивают способность обеспечивать обмен белков. Таким образом, белки в центре хрусталика, синтезированные в раннем эмбриогенезе, не обновляются в течение жизни индивидуума. Хрусталик лишен кровоснабжения и иннервации, но чувствителен к гуморальным факторам. Обмен веществ между хрусталиком и остальными органами осуществляется путем диффузии через водянистую влагу передней камеры и жидкую фракцию стекловидного тела. Межклеточный обмен в ткани хрусталика осуществляется за счет диффузии через сеть щелевых контактов, целостность которой является ключевым фактором сохранения прозрачности хрусталика (Fleschner, 2006). 1.1.2. Р", у- и а-кристаллины Хрусталик позвоночных содержит около 35 % белков, 1% липидов и 64% воды. Более 90% растворимых белков хрусталика приходится на долю а-, р-, и у-кристаллинов (Bloemendal, 1977). Ассоциация кристаллинов в надмолекулярные комплексы играет ключевую роль в обеспечении прозрачности хрусталика и его светопреломляющей силы (Ponce et al., 2006). (З- и у-Кристаллины структурно близки между собой, и входят в суперсемейство, родственное стрессовым белкам прокариот, в то время как а-кристаллин принадлежит к семейству малых белков теплового шока (Bloemendal et al., 2004). Соотношение ос, р, и у-кристаллинов в ткани хрусталика меняется с возрастом, что обусловлено преобладанием синтеза разных типов белков в онтогенезе (Zigler, 1978). Кроме кристаллинов, клетки хрусталика содержат белки цитоскелета, мембранные белки и цитоплазматические ферменты. Р-Кристаллины - структурные белки, преобладающие по содержанию в хрусталике (до 60% всех кристаллинов) и специфичные для его ткани. Р-Кристаллины - комплексная группа олигомерных белков. В бычьем хрусталике экспрессируются 6 генов р-кристаллинов, кодирующих две группы полипептидов -основные (РВ1, рВ2, РВЗ; Mr =23-28 Ша) и кислые (рА1, рА2, рАЗ, рА4; Mr =22-25kDa) полипептиды (Wistow and Piatigorsky, 1988). РАЇ и РАЗ - продукты одного гена, образованные путем альтернативного сплайсинга. Гетерогенность субъединиц Р-кристаллина увеличивается также в связи с протеолизом первичных полипептидов, фосфорилированием основных субъединиц и накоплением модифицированных полипептидов с возрастом. Гомологичные участки обнаруживают 45-60% идентичности внутри группы Р-кристаллинов и 30% идентичности с у-кристаллинами. Субъединицы р-кристаллинов комбинируются в разных сочетаниях с образованием гомо- и гетероолигомеров. В человеческом и бычьем хрусталиках методом гель-проникающей хроматографии выделяют три фракции Р-кристаллинов: pH(pl), гексамеры и октамеры, с массой около 160 Ша, рь1(тримеры и тетрамеры), и pL2 (димеры) (Zigler et al., 1980). J3H-кристаллины содержат субъединицы рАЗ/pAl, РА4, рВ1, и РВ2, в то время как фракции pL1- и рЬ2-кристаллинов содержат рАЗ/pAl, рА4, pBl, РВ2, и РВЗ (Ma et al., 1998) Таким образом, каждая из трех фракции содержит аналогичные субъединицы, за исключением рн-кристаллинов, не имеющих в составе РВЗ. Субъединичная организация р-кристаллинов in vivo остается неизвестной.
Индукция ультрафиолетовой и тепловой агрегации pL-кристаллина и смесей ее- и рь-кристаллинов
Индукция агрегации белков ультрафиолетовым светом. Ультрафиолетовое облучение (УФО) растворов кристаллинов проводили на специально сконструированной установке, позволяющей следить за процессом агрегации белков по изменению мутности раствора (рис. 9).
Раствор кристаллинов в фосфатном буфере помещали в кварцевую микрокювету (толщина 4 мм, длина оптического пути 1 см), с прозрачными боковыми стенками. Температура в кювете поддерживалась постоянной с точностью +0,1 С с помощью термостата Julabo F12 (Германия). Непосредственно в кювете находился термодатчик, позволяющий следить за температурой раствора. Раствор белка инкубировали в кювете в течение 10 мин до достижения заданной температуры перед включением УФ-облучателя. термостат . Схема оригинальной установки для УФ-облучения белков и регистрации процесса фотоагрегации in vitro.
Кювету с раствором облучали с помощью ртутной лампы высокого давления ДРШ-1000, мощностью 1000 Вт, снабженной светофильтром УФС-2, пропускающим ультрафиолет в интервале 260-310 нм (рис. 10). В качестве фильтра для инфракрасного света использовали слой деионизованной воды толщиной 15 см. Интенсивность излучения лампы для указанного спектрального интервала была определена актинометрическим методом (Kuhn et al., 2004). В качестве актинометра был использован ферриоксалат калия. Интенсивность составила 8,8±0,2 Вт/м . Энергетическую экспозицию рассчитывали умножением интенсивности на время облучения (для облучения в течение 60 мин получаем энергетическую экспозицию 3,15 Дж/см2).
Уровень светорассеяния раствора кристаллинов регистрировали с помощью светодиода, пронизывающего кювету световым пучком (405 нм) перпендикулярно направлению пучка света УФ-облучателя. Пучок света со светодиода проходил сквозь раствор белка и попадал на детектор, сигнал с которого передавался через логарифмический усилитель на ПК с помощью многоканального АЦП L-154 (Lcard, Россия). Спектр излучения лампы ДРШ-1000. Пунктирной линией отмечена область пропускания фильтра УФС-2 в ультрафиолетовом диапазоне.
Оцифрованные данные светорассеяния при 405 нм и температуры раствора визуализировали в виде графиков (кинетических кривых) с помощью оригинальной программы MultiKin4 для Windows. Тепловая индукция агрегации. Для получения кинетических кривых термоагрегации мы помещали растворы pL-кристаллина или смесей (3L и а-кристаллинов в кювету, инкубируемую при 60С. Кинетические кривые термоагрегации получены методом регистрации интенсивности светорассеяния исследуемого раствора в кювете на вышеописанной установке, при выключенном УФ-облучателе (Рис. 9).
Для изучения влияния короткоцепочечных пептидов на кинетику агрегации (3-кристаллина, карнозин, N-ацетилкарнозин, анзерин или пантетин добавляли к образцам белка в виде концентрированных растворов, приготовленных на фосфатном буфере (рН = 7,0). В контрольный образец белка добавляли соответствующий объем фосфатного буфера. Конечный объем каждой пробы составлял 400 мкл.
В нашей работе был использован метод анализа кинетики агрегации белка, разработанный Б.И. Кургановым (2002). Анализ кинетических кривых тепловой агрегации различных белков, проведенный Кургановым, показал, что в большинстве случаев завершающая фаза агрегации следует кинетике реакции псевдопервого порядка. Согласно этому завершающая фаза процесса агрегации описывается уравнением:
Время, мин 60 S Рис. 11. Кинетическая кривая фотоагрегации pL-кристаллина и теоретическая зависимость, соответствующая уравнению (1). Уравнение (1) выведено из классического уравнения Вант-Гоффа для химических реакций n-ного порядка v=-dX/dt=nk[X]n, где [X] - это концентрация субстрата реакции (в данном случае - неагрегированного белка) при допущении, что значение светорассеяния белкового раствора пропорционально количеству агрегированного белка. Экспериментально был установлен первый порядок реакции, а также было показано, что ki зависит от концентрации белка. Механизм реакции агрегации, следовательно, не является мономолекулярным, и величина kj представляет собой псевдоконстанту, зависящую от концентрации белка в растворе.
Кинетические кривые агрегации (Зь-кристаллина получали методом регистрации зависимости светорассеяния (мутности) раствора белка (к=405 нм) от времени при нагревании или УФ-облучении раствора. Участки S-образных кривых агрегации после перегиба аппроксимировали уравнением реакции первого порядка (1), что позволяло получить следующие параметры, описывающие процесс агрегации: (1) t0 - время лаг-фазы процесса, которое отражает скорость денатурации (Зь-кристаллина; (2) А -константа скорости реакции, описывающая скорость взаимодействия частиц друг с другом; (3) Ац,„ - максимальная мутность инкубационной смеси, отражающая размер образовавшихся агрегатов (рис. 11).
Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc, США). Значения коэффициента корреляции для исходных графиков данных и аппроксимированных кривых больше 0.998 при Р 0.0001, это свидетельствует о высоком качестве приближения. Для каждого варианта опыта регистрировали кинетические кривые в повторності! не менее трех раз. Полученные параметры Alim, к, t0 представлены в виде среднее + стандартная ошибка среднего. Для оценки статистической значимости различий использовали U-критерий Манна-Уитни (достоверность различий при р 0.0001). II.6. Определение количества карбонильных групп в pL-кристаллине
Определение количества карбонильных групп, образующихся при УФ-облучении кристаллинов, проводили методом Levine et al. (1994), в основе которого лежит реакция взаимодействия 2,4-динитрофенилгидразина (H2N-NH-2.4DNP) с карбонильными группами белка:
Раствор Рь-кристаллина облучали УФ-светом 2 часа в присутствии и отсутствие ГСД, отбирая каждые 15-30 мин аликвоты, содержащие 2-3 мг белка. Пробы (Зь-кристаллина осаждали равным объемом ТХУ, центрифугировали при 11000 g 3 минуты, растворяли осадок в 0,5 мл раствора 10 мМ ДНФГ и инкубировали при комнатной температуре 1 час, встряхивая каждые 10 минут на шейкере. После этого переосаждали белки 20% ТХУ (0,5 мл), центрифугировали и трижды промывали осадок смесью этанол-этилацетат (1:1), после чего осадок растворяли в 8 М гуанидингидрохлориде и инкубировали при 37С 15 мин. После этого измеряли поглощение проб при 375 нм против слепой пробы, содержащей 8 М гуанидингидрохлорид. Содержание карбонильных групп вычисляли, используя молярный коэффициент экстинкции 22 мМ см"1. Данные представлены в виде среднее + стандартная ошибка для трех независимых экспериментов и трех повторностей в каждом из них. Для оценки достоверности изменений применяли U-критерий Манна-Уитни (достоверность различий при р 0.05).
. Анализ кинетических кривых тепловой агрегации Д-кристаллина
Тепловая денатурация pY-кристаллина по данным дифференциальной сканирующей калориметрии начинается после 42С, а основной пик теплоемкости приходится на 62,5С (Markossian et al., 2006). Денатурация pY-кристаллина при 60С является необратимой и сопровождается агрегацией и преципитацией белка.
Кинетические кривые зависимости светорассеяния (А,=405 нм) раствора белка от времени получены нами при тепловой агрегации (Зь-кристаллина. Типичная кривая агрегации имеет S-образную форму, и характеризуется лаг-фазой, логарифмической фазой и фазой плато. Для описания кинетики процессов агрегации мы анализировали кривые агрегации на завершающей стадии процесса (исключая лаг-период). Участок S-образной кривой агрегации после перегиба описывается кинетическим уравнением реакции псевдопервого порядка A=Alim(l-e"ki(t"to)), содержащим три параметра AIim, kj, t0 .
Параметр t0 описывает длительность лаг-фазы процесса, ki - константа скорости реакции, описывает скорость взаимодействия агрегатов белка друг с другом; Ацт - максимальная мутность инкубационной смеси, отражает конечный размер образовавшихся агрегатов. Физический смысл графика состоит в отображении процесса формирования и роста белковых агрегатов в растворе. Во время лаг-фазы происходит денатурация белка, и образуются стартовые агрегаты pL-кристаллина, во время логарифмической фазы происходит их быстрый рост, происходящий вследствие слипания стартовых агрегатов, а на фазе плато размеры агрегатов достигают максимума и начинают осаждаться, о чем свидетельствует загиб кривой. Определенные нами параметры Ант, k;, t0 были использованы для количественной характеристики процессов агрегации белка 2.0 Кинетика тепловой агрегации Рі,-кристаллина при 60С, зарегистрированной по увеличению светорассеяния раствора при 405 нм Концентрация белка: 0,2 (1), 0,4 (2), 1,0(3) и 2,0 мг/мл (4).
Кинетику тепловой агрегации pY-кристаллина мы исследовали в интервале концентраций 0,2-2 мг/мл. На рис. 12 показаны кинетические кривые агрегации (Зь-кристаллина при разных концентрациях белка. Зависимости параметров теоретических кривых агрегации от концентрации приведены на рис. 13. Параметры к, и А1ш1 линейно зависят от концентрации (рис. 13 (А и Б)), что согласуется с данными по тепловой агрегации других белков, например люциферазы светлячка и белка оболочки вируса табачной мозаики (Курганов, 2002; Wang, Kurganov, 2003). Зависимость константы скорости от концентрации белка позволяет рассматривать порядок реакции как псевдопервый. Значения параметра t0 уменьшается с ростом концентрации белка. Длительность лаг-периода может быть описана логарифмической зависимостью от концентрации (рис.12 (В)).
Анализ кинетики тепловой агрегации р\-кристаллина. Зависимости параметров термоагрегации Р-кристаллина Ацт (A), kj(B), t0 (В) от концентрации белка На основе этих данных нами была выбрана рабочая концентрация pL-кристаллина 0,5 мг/мл для анализа процесса тепловой агрегации в присутствии а-кристаллина и пептидов, при которой средняя скорость агрегации и лаг-период точно определяются в минутной шкале времени Кинетика тепловой агрегации рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина
Тепловая денатурация Рь-кристаллина в отсутствие а-кристаллина сопровождается быстрой агрегацией развернутых молекул и осаждением крупных агрегатов из раствора. В присутствии а-кристаллина происходит его взаимодействие с ненативными молекулами рь-кристаллина, приводящее к замедлению агрегации вплоть до полного ее подавления. Данное явление известно как шаперон-подобная активность а-кристаллина (Horwitz, 1992; Wang & Spector, 1994; Das, et al. 1999). Подавление агрегации происходит вследствие образования стабильных водорастворимых комплексов а-кристаллина с рь-кристаллином в широком диапазоне концентраций белков (Putilina et al., 2003).
. Усиление шаперон-подобного действия or-кристаллина под влиянием УФ- облучения
Для изучения эффекта УФ-облучения на шаперон-подобную активность а-кристаллина, а-кристаллин облучали УФ светом в течение 120 мин при температуре 37С (энергия облучения 6.34 Дж/см") и регистрировали кривые УФ-агрегации смесей pL- и а-кристаллинов в разных концентрациях.
На рис. 30 представлены кривые агрегации рь-кристаллина в присутствии УФ-облученного и интактного а-кристаллина. Для каждой агрегационной кривой был проведен анализ завершающей фазы процесса агрегации и рассчитаны следующие параметры: предельное значение интенсивности светорассеяния (Aiim), время лаг-фазы (t0) и константа скорости реакции псевдопервого порядка (ki) (табл. 4). Рассчитанные параметры скорости и лаг-периода указывают на то, что защитные свойства облученного а-кристаллина в отношении (Зь-кристаллина остаются неизменными при соотношении белков 16:1 ((3:а).
Кинетические кривые УФ-агрегации при 37С Рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина. 1 - в массовом соотношении 16:1 (Р:а), необлученный сс-кристаллин, 2 - 16:1 р\сс, облученый 120 мин а-кристаллин, 3-4:1 (Р:а), необлученный а-кристаллин, 4-4:1 Р:а, облученый 120 мин а-кристаллин.
При соотношении 4:1(р:а) становится явным усиление защитной активности облученного а-кристаллина по сравнению с необлученным белком. Как показано в предыдущем разделе, при соотношении белков 16:1 ((3:а) доминирующая роль в защите от агрегации принадлежит «экранирующему эффекту» а-кристаллина. Усиление защитной активности облученного а-кристаллина становится явным при возрастании связывающей роли а-кристаллина по отношению к р\-кристаллину (р:а) 4:1, т.е. собственно шаперон-подобной активности. Следовательно, УФ-облучение в примененных нами дозах (энергия облучения 6.34 Дж/см2) активирует шаперон-подобные свойства а-кристаллина.
Параметры кривых УФ-агрегации (Зь-кристаллина в присутствии необлученного и УФ-облученного в течение 120 мин а-кристаллина Инкубационная смесь Параметры кривых агрегации Kj, мин"1 t0, мин Alim, ОЕ р\-кристаллин и нативный ос-кристалл ин (16:1) 0,084 ± 0,003 18,24 ±0,3 1,37 ±0,08 pY-кристаллин и УФ-облученный ос-кристаллин (16:1) 0,077 ± 0,001 16,88 ±0,2 1,41 ±0,07 PL-кристалл и н и нативный ос-кристалл ин (4:1) 0,056 ± 0,002 24,74 ± 0,2 1,43 ±0,03 pL-кристаллин и УФ-облученный ос-кристалл ин (4:1) 0,033 ± 0,002 26,10 ±0,1 1,64 ±0,03 различия достоверны при р 0,0001, сравнение с параметрами агрегации смеси нативного а кристаллина и рь-кристаллина. Способность а-кристаллина защищать белки от УФ-индуцированной агрегации показана ранее во многих исследованиях (Borkman et al., 1996; Lee et al., 1997). Представлено много доказательств, что а-кристаллин постепенно теряет активность в условиях in vivo с течением времени (Horwitz, 1992; Augusteyn et al., 2002; Derham and Harding, 1997) и при экспериментальных модификациях, моделирующих повреждения а-кристаллина in vitro (Cherian and Abraham, 1995; van Boekel et al., 1996, Kumar et al., 2007). В большинстве работ показано, что УФ-облученный а-кристаллин демонстрирует меньшую защитную активность в отношении дестабилизированных белков, чем интактный (Borkman and McLaughlin, 1995; Ellozy et al., 1996; Schauerte and Gafni, 1995). Причинами ухудшения активности, как предполагают, является фотоокисление белка, и как следствие, изменения в его вторичной, третичной и четвертичной структурах. Например, в работе Schauerte и Gafni (1995) показано, что степень фотодеградации триптофановых остатков в а-кристаллине в результате УФ-Б облучения коррелирует со снижением шаперон-подобной активности ос-кристаллина при защите фосфоглицераткиназы от тепловой агрегации (52С). В детальном исследовании Fujimori (1982) показано, что падение флуоресценции в облучаемом а-кристаллине коррелирует с ростом количества ковалентных сшивок полипептидов в димеры, тримеры и агрегаты высшего порядка. Ковалентные сшивки, дисульфидные и прочие, также ухудшают активность а-кристаллина в эксперименте (Sharma and Ortwerth, 1995). Противоречие полученных нами результатов с этими данными можно объяснить: 1) различными спектрально-энергетическими характеристиками используемого УФ-облучения и 2) различием в тест-системах для оценки шаперон-подобной активности а-кристаллина. В перечисленных работах отсутствует единая методика получения УФ-окисленного а-кристаллина. Например, в работе Ellozy et al. (1996) а-кристаллин ухудшает защитные свойства после 16 часов облучения УФ светом 295 нм, а в работе Schauerte и Gafni, 1995 - уже через 5 мин прямого фотоокисления при 280 нм. Очевидно, коротковолновое излучение более эффективно, поскольку имеет большую энергию. В статье Dhir et al., 1999 был описан феномен улучшения шаперон-подобной активности у облученного рекомбинантного аА-кристаллина после облучения в течение 16 ч при 300 нм, что согласуется с нашими результатами. Усиление активности по сравнению с необлученным контролем коррелировало с увеличением экспозиции гидрофобных участков, регистрируемой по росту интенсивности bis-ANS-флуоресценции. Однако эти данные нельзя корректно сравнить с нашими данными в связи с отсутствием значений интенсивности или дозы облучения, примененного в эксперименте Dhir et al.
При детальном анализе работ выяснилось, что ухудшение свойств облученного а-кристаллина показано, как правило, на тест-системах тепловой агрегации субстратов (Borkman and McLaughlin, 1995; Ellozy et al., 1996; Schauerte and Gafni, 1995). В указанных работах индуктором агрегации служит повышенная температура (52-70С), при которой, как известно, ос-кристаллин подвергается конформационному переходу (Das et al., 1997). Наблюдаются изменения во вторичной и третичной структуре и увеличивается подвижность субъединиц. (Burgio et al., 2001; Putilina et al., 2003). В работе Кривандина и соавт. (2004) показано с использованием метода малоуглового рассеяния, что при инкубации а-кристаллина при 60С его молекулярная масса двукратно возрастает. Поскольку защита дестабилизированных белков а-кристаллином от агрегации осуществляется через образование комплекса, структурные изменения в а-кристаллине должны влиять на его шаперон-подобные свойства. Известно из литературы, что а-кристаллин становится более эффективным шапероном при воздействиях, приводящих к его частичной денатурации, то есть переводу его в состояние расплавленной глобулы (Das and Liang, 1997). Такими воздействиями являются повышение температуры (Das and Surewicz, 1995; Raman and Rao, 1997; Reddy et al., 2000), давления (Bode et al., 2002), высокие концентрации денатурирующих веществ, например, мочевины или аргинингидрохлорида (Saha and Das, 2007, Srinivas et al., 2005). При таких сильных воздействиях ковалентные сшивки, образовавшиеся в а-кристаллине при УФО, вероятно, будут препятствовать принятию белком наиболее эффективной конформации и/или обмену субъединиц, поэтому облученный белок «работает» хуже контрольного. В пользу этого предположения свидетельствует и факт, что при физиологической температуре ковалентно сшитый а-кристаллин демонстрирует такой же уровень активности, как интактный белок (Augusteyn, 2004).
