Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 12
1.1. Клинико-биохимические аспекты ишемического повреждения мозга 12
1.1.2. Роль оксида азота и других свободных радикалов при ишемии мозга 15
1.1.3. Постишемическое воспаление 24
1.2. Ферменты обмена регуляторных пептидов и их роль в патологии мозга 27
1.2.1.Ангиотензинпревращающий фермент: локализация, тканевая специфичность 29
1.2.1.1. Участие ангиотензинпревращающего фермента в обмене регуляторных пептидов 31
1.2.1.2. Роль ангиотензинпревращающего фермента в патологии мозга 32
1.2.2. Карбоксипептидаза N: локализация, тканевая специфичность, участие в обмене регуляторных пептидов, роль в патологии мозга 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Общая характеристика обследованных больных 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента 43
2.2.1.1. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента в крови 43
2.2.1.2. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента в мозге 44
2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы N 45
2.2.3. Метод определения содержания белка 45
2.2.4. Метод определения концентрации С-реактивного белка 45
2.2.5. Метод определения нитрит-аниона 46
2.2.6. Метод определения ТБК-активных продуктов 46
2.2.7. Метод определения функциональной активности нейтрофилов 47
2.2.8. Метод определения хемилюминесценции 47
2.3. Моделирование фокальной ишемии 48
2.4. Методы статистической обработки 49
ГЛАВА 3. Результаты исследования 51
3.1.Активность ферментов обмена регуляторных пептидов и некоторые биохимические показатели у больных ишемическим инсультом 51
3.1.1. Исследование активности ферментов обмена регуляторных пептидов у больных ишемическим инсультом 51
3.1.1.1. Активность ангиотензинпревращающего фермента у больных ишемией головного мозга в остром периоде 52
3.1.1.2. Активность карбоксипептидазы N у больных ишемией головного мозга в остром периоде 54
3.1.2. Свободнорадикальные процессы у больных ишемическим инсультом 55
3.1.2.1. Исследование концентрации нитрит-аниона в остром периоде ишемического инсульта 56
3.1.2.2. Исследование ТБК-активных продуктов у больных ишемическим инсультом 58
3.1.2.3. Исследование показателей кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных ишемическим инсультом 60
3.1.3. Исследование уровня С-реактивного белка у больных
ишемическим инсультом 61
3.2. Исследование активности ангиотензинпревращающего фермента и некоторые биохимические показатели в сыворотке крови при экспериментальной ишемии головного мозга 63
3.2.1. Активность ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови экспериментальных животных на модели неполной ишемии головного мозга крыс 64
3.2.2. Показатели свободнорадикльного окисления при моделировании ишемии головного мозга 65
3.2.2.1. Исследование динамики нитрит-аниона в сыворотке крови экспериментальных животных 65
3.2.2.2. Исследование динамики ТБК-активных продуктов при моделировании ишемии головного мозга 66
3.2.2.3. Исследование динамики показателей хемилюминесценции при моделировании ишемии 67
3.2.2.4. Исследование динамики кислородзависимого метаболизма нейтрофилов 68
3.3. Исследование активности ферментов обмена регуляторных пептидов и некоторых биохимических показателей в мозге экспериментальных животных при ишемическом повреждении головного мозга 69
3.3.1. Исследование активности ангиотензинпревращающего фермента в мозге крыс 70
3.3.2. Исследование динамики нитрит-аниона в мозговой ткани при моделировании неполной ишемии 71
глава 4. Обсуждение результатов исследования 73
Выводы 96
Литература 98
- Постишемическое воспаление
- Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента в крови
- Активность карбоксипептидазы N у больных ишемией головного мозга в остром периоде
- Исследование динамики ТБК-активных продуктов при моделировании ишемии головного мозга
Введение к работе
Сосудистые заболевания головного мозга - одна из ведущих причин заболеваемости, смертности и инвалидизации в России. Ежегодно инсульт развивается более чем у 450 тыс. человек, из которых примерно 35 % умирает в остром периоде заболевания. В России смертность от цереброваскулярных заболеваний одна из самых высоких в мире: в 2000 году она составила 319,8 на 100 000 населения [24, 25, 26, 61, 62]. Инвалидизация вследствие инсульта занимает первое место среди всех причин первичной инвалидности. В последние десять лет в России ежегодно регистрируется около 400 000 тысяч инсультов, практически население большого города, причем на ишемические повреждения мозга приходится 70-80 %. В нашей стране проживает свыше 1 млн. человек, перенесших инсульт, при этом третью часть их составляют лица трудоспособного возраста, к труду же возвращается каждый пятый больной [62]. В связи с этим выяснение биохимических особенностей течения острой церебральной ишемии, разработка на их основе методов диагностики, профилактики и лечения являются одной из главных проблем современной медицины.
Исследования последних лет доказали, что гибель нервной ткани при ишемии мозга происходит в результате каскада патобиохимических и патофизиологических процессов [59, 60, 61]. В большинстве случаев инсульту предшествуют сложные и длительные изменения кровоснабжения и метаболизма в головном мозге. Считается, что ключевым звеном в развитии этих реакций является глутамат-кальциевый каскад. Исходом каскадных реакций является формирование инфаркта, происходящим по двум механизмам: некроза и апоптоза.
Современные исследования свидетельствуют о том, что в патогенезе мозговой ишемии задействовано большое количество факторов - гипоксия, дефицит макроэргических соединений, реперфузионные повреждения,
реакция воспаления. Эти процессы имеют динамический характер, что сопровождается вовлечением разнородных механизмов на различных этапах ишемического каскада, их неоднозначностью в различные периоды патологического процесса.
Однако не выясненной остается роль нейропептидов, и в особенности ферментов, участвующих в их синтезе и распаде при ишемических поражениях мозга. Ангиотензинпревращающий фермент (КФ 3.4.15.1, АПФ), участвующий в образовании ангиотензина II и деградации брадикинина, рассматривается как один из основных регуляторов сердечно-сосудистой системы. С его экспрессией связан риск критического повышения уровня артериального давления (АД), нарушения мозгового кровообращения и развитие инсульта. Действие ангиотензина II не ограничивается только вазоконстрикторными эффектами. Доказано, что этот пептид увеличивает образование активных форм кислорода и может усиливать оксидантный стресс [210], участвует в развитии воспалительной реакции [161].
Другой фермент - карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7, КП N) - также как и АПФ, инактивирует брадикинин, который является ключевым компонентом каллекреин-кининовой системы и характеризуется способностью снижать кровяное давление, увеличивать скорость местного кровотока, повышать проницаемость сосудов и гематоэнцефалического барьера [171]. Кроме того, фермент вовлекается в процессинг энкефалинов и эндорфинов, т.е. может влиять на ограничение стрессорной реакции [219, 255]. Роль КП N при острых нарушениях мозгового кровообращения ишемического генеза практически не изучена.
Неоднозначна роль оксида азота (N0) при патологических состояниях, включая и ишемическое повреждение головного мозга. Этот высокореактивное вещество способно оказывать как цитопротективное, так и цитотоксическое действие. N0 представляет собой нестабильный свободный радикал, продуцируемый за счет активации различных ферментов - N0-
синтаз. Протективное действие связано с вазодилатацией, модуляцией активности NMDA-рецепторов (N-метил-О-аспартат). Однако образующийся в повышенных концентрациях N0, оказывает нейротоксическое действие. Несмотря на большую значимость оксида азота в патогенезе острых нарушений мозгового кровообращения, не используются биохимические тесты для его оценки.
Активация свободнорадикальных процессов при ишемии мозга приводит к развитию оксидантного стресса, являющегося одним из универсальных механизмов повреждения тканей. В связи с этим представляет интерес исследование у больных ишемическим инсультом процессов свободнорадикального окисления (СРО).
Количество N0 в свою очередь может зависеть от активности КП N, которая высвобождает аргинин из пептидов, являющихся субстратом N0-синтаз.
Многочисленные экспериментальные исследования показали, что среди механизмов вторичного поражения ткани важное место занимают реакции локального воспаления. Характер этих реакций отражают белки острой фазы, которые позволяет определить выраженность ишемического процесса и прогнозировать восстановление неврологических нарушений. Поскольку локальное воспаление замыкает порочный круг формирования мозговой недостаточности, представляет интерес изучение динамики белков острой фазы у больных ишемическим инсультом.
Сложность и противоречивость процессов ишемического повреждения требует комплексной оценки показателей, отражающих метаболические процессы у больных с острой недостаточностью мозгового кровообращения, поскольку биохимические изменения предшествуют клиническим. Такой подход позволит выявить зависимость изучаемых показателей от тяжести ишемического процесса у больных с острым нарушением мозгового кровообращения.
В связи с вышеизложенным, нами была проведены исследования по изучению комплекса биохимических параметров: исследование активности ферментов обмена регуляторних пептидов (АПФ и КП N), показателей нитроксидэргической, оксидантной систем и воспалительной реакции.
Для сравнения полученных данных в клинических условиях и более глубокого изучения компонентов метаболического каскада последние изучены на модели фокальной ишемии в эксперименте на животных. Полученные данные позволяют определить взаимосвязь между изучаемыми показателями в крови и ткани мозга и выявить роль отдельных его звеньев в развитии ишемии головного мозга, что может служить основой для разработки методов адекватной и точной диагностики, а также коррекции обменных процессов.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью настоящего исследования явилась комплексная оценка биохимических показателей в прогнозе течения и исхода ишемического инсульта.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи.
Оценить динамику активности ферментов обмена регуляторных пептидов у больных ишемическим инсультом.
Изучить динамику биохимических показателей, характеризующих отдельные этапы метаболического каскада (нитроксидэргическую, оксидантную системы, воспалительную реакцию) у больных ишемическим инсультом.
Оценить исследуемые показатели при моделировании фокальной ишемии у крыс и сопоставить их с изменениями в мозговой ткани у экспериментальных животных.
Определить биохимические параметры, наиболее четко характеризующие тяжесть ишемического процесса.
Выявить корреляционные связи тяжести заболевания с биохимическими показателями больных ишемическим инсультом.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые изучена активность ферментов обмена регуляторных пептидов - АПФ и КП N - у больных ишемическим инсультом в остром периоде заболевания. Обнаружено, что в группе пациентов с тяжелым и крайне тяжелым вариантом течения заболевания активность АПФ повышалась в начале развития инсульта и резкое снижалась в 1 сутки. При отсутствии положительной динамики в восстановлении неврологических функций активность фермента оставалась повышенной.
Проведено исследование показателей, характеризующих процессы свободнорадикального окисления в режиме мониторинга. Показано, что ишемия головного мозга характеризуется активацией СРО и зависит от тяжести заболевания. Установлена разнонаправленная динамика содержания нитрит-аниона в зависимости от восстановления неврологических нарушений; у пациентов с отсутствием положительной динамики концентрация показателя не превышала значения группы контроля на протяжении всего периода наблюдения. Выявлена корреляционная зависимость между активностью КП N и уровнем нитрит-аниона.
Полученные результаты представляют интерес в понимании механизмов неврологических нарушений и роли ферментов обмена регуляторных пептидов в этом процессе, а также позволили определить тесты, отражающие отдельные этапы метаболического каскада развития ишемии головного мозга. Практическое применение полученных данных может способствовать повышению качества диагностики и разработки условий для совершенствования терапевтической тактики. Применение метода хемилюминесценции для оценки процессов СРО в эксперименте
показало возможность его использования в практическом здравоохранении: в качестве теста для оценки активности свободнорадикальных процессов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на I Всероссийской конференции по проблемам цереброваскулярной патологии и инсульта (Москва, сентябрь, 2003), на итоговых конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского государственного педагогического университета (2003, 2004, 2005), «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2006), «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы», (Пенза, 2006).
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Ишемия головного мозга сопровождается изменением активности ферментов обмена регуляторных пептидов как в сыворотке крови, так и в мозговой ткани.
Наибольшую значимость при ишемической патологии головного мозга имеет определение активности АПФ в сыворотке крови.
Снижение концентрации нитрит-аниона как ближайшего стабильного метаболита оксида азота у больных ишемическим инсультом свидетельствует о тяжести заболевания.
Тестами, наиболее четко отражающие отдельные этапы метаболического каскада, являются определение ТБК-активных продуктов, люминолзависимая хемилюминесценция, СРБ.
Постишемическое воспаление
При развитии патологического процесса в мозге, в том числе ишемии, происходит формирование иммунного ответа и предшествующей ему неспецифической острофазной реакции, которая характеризуется изменением биосинтеза белков [143, 169].
Особенностью большинства белков острой фазы (БОФ) является их неспецифичность и высокая корреляция концентрация в крови со стадией процесса [151]. Острофазные белки характеризуются многообразием функций: опсонизация и активация комплемента [229], антипротеазная активность, связывание свободных радикалов, бактериостатическое действие, усиление коагуляции [90, 91].
Одним из наиболее изученных БОФ является С-реактивный белок -уникальный маркер острофазного ответа организма на воспаление и степень его выраженности, т.к. является очень чувствительным (увеличение концентрации в 10-100 раз, в определенных случаях до 1000 раз) и самым быстрым (в первые 6-8 часов) показателем повреждения [78, 96, 97, 102, 126, 127]. Транскрипция гена СРБ индуцируется в основном ИЛ-6 [150].
В биологических жидкостях СРБ может существовать в 3 формах: 1) пентамер; 2) мономер; 3) промежуточные формы [126, 127]. Молекулы непентамерной структуры называют модифицированным СРБ (мСРБ). Титов В.И. считает, что, возможно, именно гетерогенность молекулы СРБ является одним из условий его многостороннего физиологического и патофизиологического действия [127].
Так, СРБ поглощается нейтрофилами. В результате ограниченного протеолиза в фагосомах нейтрофилов выделяются иммуноактивные пептиды, модулирующие различные функции нейтрофилов и макрофагов [130]. Добавление СРБ в культуру эндотелия человека понижает продукцию окиси азота и уровень мРНК NO-синтазы, а также активирует синтез молекул клеточной адгезии эндотелием [231, 284].
Установлено повышение концентрации СРБ в цереброспинальной жидкости у больных ишемическим инсультом в первые часы заболевания и третьи сутки. Увеличение содержания этого белка наблюдалось до 3-х суток. При этом выявлена отрицательная корреляция с приростом суммарного клинического балла к 21 суткам (концу острого периода ишемического инсульта). Наибольший прирост наблюдался у больных с тяжелой инвалидизацией Авторами установлено, что значительное повышение концентрации СРБ у больных является достоверным критерием неблагоприятного прогноза в восстановлении неврологических функций [61, 184].
По современным представлениям даже небольшое повышение (менее 3 мг/л) концентрации СРБ может отражать хроническое воспаление сосудистой стенки и служить фактором риска для развития острой недостаточности мозгового кровообращения [168, 169]. В этой связи большое значение имеют высокочувствительные методы определения СРБ (на основе биотинилированного СРБ и меченого пероксидазой авидин-биотинового комплекса [2, 126].
В остром периоде ишемического инсульта в ЦНС увеличивается выработка провоспалительных цитокинов. В ряде экспериментальных работ показано повышение не только СРБ, но и других БОФ: фибриногена, оср антитрипсина, щ-кислого гликопротеина (орозомукоида) [151], растворимого р-селектина - растворимой формы белка клеточной адгезии [112], сывороточного амилоида А, ИЛ-6 [237]. Воспалительные реакции в ответ на острую ишемию сопровождаются также повреждением мозговой ткани и нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера с высвобождением в кровь нейроспецифических антигенов, среди которых лучше всего изучены глияспецифический белок S-100, глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) и нейронспецифическая енолаза (НСЕ) [61,112,223].
Помимо изменения синтеза острофазных белков, неспецифической реакцией на повреждение является активация, миграция и адгезия нейтрофилов, стимуляция которых приводит к активации оксидаз в их плазматической мембране и запускается каскад метаболических реакций, т.н. респираторный взрыв [90, 91]. В результате этих процессов возрастает потребление и окисление клетками глюкозы в реакциях гексозомонофосфатного шунта, увеличивается потребление кислорода и продукция АФК (супероксиданиона, гидроксильного радикала, перекиси водорода и др.) [89, 185]. Стимулированная NADF-оксидаза катализирует реакцию:
NADFH + 2 02 - NADF+ + 2 О2" + 2Н\ в результате которой происходит перенос электронов на молекулы кислорода. При этом образуется высокотоксичный супероксидный анион-радикал, который быстро дисмутирует до перекиси водорода. Из перекиси водорода в свою очередь образуется гидроксильный анион-радикал, синглетный кислород и хлорноватистая кислота, которые реализуют функцию защиты в системе полиморфно-ядерных нейтрофилов [195, 259].
Респираторный взрыв неспецифичен и не зависит от этиологии воспаления [90,91].
В последнее время в литературе значительное внимание уделяется зависимости реакции воспаления и ПОЛ [125, 128, 129]. По мнению авторов, ПОЛ - физиологичный этап воспаления, предшествующий поглощению эндогенных патогенов макрофагами интимы. Наработка и секреция АФК -этап синдрома системного воспалительного ответа. Реализация единой биологической функции этих процессов отражена в положительной корреляции тестов ПОЛ с маркерами воспаления [128, 129]. На возможность участия в воспалении ангиотензина II указывает Suzuki Y. и соавт (2003) [262]. Показано, что этот пептид усиливает локальный синтез хемиаттрактантов, миграцию лейкоцитов из крови в интиму и медию, ускоряет в тканях дифференцировку моноцитов в макрофаги. В больших концентрациях А II усиливает эндогенное воспаление, вызывает дисфункцию эндотелия, секрецию активных форм кислорода, цитокинов и молекул адгезии. Однако механизмы этих процессов пока не изучены.
Несмотря на обширный экспериментальный материал и различные подходы к изучению ишемического воспаления, в литературе практически не встречаются исследования, изучающие этот вопрос комплексно. Между тем эта проблема является достаточно актуальной для понимания механизмов развития ишемии головного мозга и разработки новых подходов для диагностики и лечения.
Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента в крови
Активность АПФ в сыворотке крови определяли по образованию Gly-Arg из карбобензокси-Gly-Gly-Arg при рН=8,2, как активность, ингибируемую каптоприлом. К сыворотке крови (40 мкл) прибавляли 20 мкл каптоприла, растворенного в 100 мМ трис-HCl. Смесь инкубировали в течение 10 мин при 37. Реакцию начинли добавление 10 мкл субстрата, через 60 мин реакцию останавливали 45 мкл 10 % ТХУ. Пробы центрифугировали 20 мин при 5 000 об/мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли прирост нингидринположительных продуктов реакции - Gly-Arg. Пробы фотометрировали при 590 нм в кювете толщиной 5 мм. Активность АПФ определяли как разность оптической плотности проб, содержащих и не содержащих каптоприл, и выражали в нМоль продукта реакции, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка.
2.2.1.2. Определение активности ангиотензинпревращающего фермента в гомогенате мозга крыс
Активность АПФ в 1 % гомогенате мозга экспериментальных животных определяли флюориметрическим методом по отщеплению аргинина от 210 мкМ субстрата дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в пробе - 42 мкМ). Гомогенат ткани из различных отделов мозга (гиппокамп и большие полушария) готовили на 20 мМ натрий ацетатном буфере.
В качестве ингибитора использовали каптоприл. Контрольная проба содержала 100 мкл 200 мМ трис-HCl, рН 7,6 и 100 мкл гомогената. В опытную пробу вносили 90 мкл указанного буфера, 10 мкл 250 мкМ раствора каптоприла (концентрация в пробе - 10 мкМ) и 100 мкл гомогената. Пробы преинкубировали в течение 8 мин при 37С, затем в каждую пробу прибавляли предварительно нагретый субстрат в объеме 50 мкл. Смесь инкубировали 30 мин при 37 С. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 н НС1. Далее к пробе приливали хлороформ в объеме 1,5 мл и тщательно встряхивали 1 мин. При этом продукт реакции переходил в хлороформную фазу, а субстрат, не растворимый в хлороформе, оставался в водной фазе. Для разделения хлороформной и водной фаз пробы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при Хех=360 нм и ет=530 нм. В качестве стандарта использовали раствор 1 мкМ раствора дансил-фен-ала в хлороформе. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробе содержащих и не содержащих ингибитор АПФ -каптоприл и выражали в нмоль продукта реакции, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка. Белок определяли по методу Лоури [212].
Активность фермента выражали как разность в приросте флюоресценции в пробах содержащих и не содержащих каптоприл.
2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы N
Для определения активности КП N к сыворотке крови (40 мкл) прибавляли 20 мкл 3,5 мМ сульфата кобальта, приготовленного на 100 мМ трис-HCl (рН=7,6), реакцию начинали добавлением 10 мкл гиппурил-аргинина. Останавливали ее через 60 мин добавлением 45 мкл 10 % ТХУ. Пробы центрифугировали 20 мин при 5 000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли продукт реакции нингидриновым методом. Оптическую плотность измеряли при 590 нм в кювете толщиной 5 мм. Активность КП N определяли по разности оптической плотности проб, содержащих и не содержащих ионы кобальта, и выражали в нМоль продукта реакции, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка.
2.2.3. Метод определения содержания белка
Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури [212]. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин. 2.2.4. Метод определения С-реактивного белка
Концентрацию С-реактивного белка определяли иммунотурбидиметрическим методом реактивами фирмы «Diasis». Принцип метода состоит в следующем: СРБ реагирует с антителами (козьими) к СРБ человека. Образующийся иммунопреципитат вызывает увеличение мутности реактива, которая пропорциональна концентрации белка. Количество белка определяли по калибровочной кривой.
2.2.5. Метод определения нитрит-аниона
Концентрацию нитрит-аниона как стабильного метаболита оксида азота определяли по реакции Грисса. Суть метода состоит в способности нитрита диазотировать сульфаниловую кислоту и образовывать красно-фиолетовое диазосоединение с а-нафтиламином. 0,5 мл сыворотки (гомогената) депротеинизировали добавлением 1 мл 0,5 н раствора NaOH и 10 % раствора ZnSC 4 Пробы центрифугировали при 5 000 об/мин 30 мин. К 1 мл надосадочной жидкости добавляли равное количество 1 % раствора реактива Грисса [46]. Инкубировали в течении 10 мин при 25С. Спектрофотометрировали при 450 нм. Концентрацию нитрит-аниона рассчитывали по калибровочной кривой с использованием нитрита натрия.
2.2.6. Метод определения ТБК-активных продуктов
Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли по методу Uchiyama М., Mihara М. [267]. К 3 мл 1,4 % ортофосфорной кислоты добавляли 0,25 мл сыворотки крови, затем приливали 1 мл 0,5 % раствора тиобарбитуровой кислоты и помешали в кипящую водяную баню на 45 мин. Пробы охлаждали, добавляли 4 мл бутанола и встряхивали в течение 1 мин до образования суспензии. После центрифугирования супернатант фотометрировали при двух длинах волн А=535 нм и 1=570 нм против холостой пробы в кювете с длинной оптического пути 1 см. Расчет содержания ТБК-активных продуктов проводили по формуле: С = (D535 -D570)xl6/0,156, где: С - концентрация ТБК-активных продуктов в опытной пробе; D535 -оптическая плотность пробы при 535 нм; D570- оптическая плотность при 570 нм; 0,156 - коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый альдегид-ТБК в л/мкмоль/см; 16 - коэффициент разведения сыворотки.
Активность карбоксипептидазы N у больных ишемией головного мозга в остром периоде
Активность КП N в различные сроки наблюдения у больных ишемиче-ским инсультом представлена в таблице 6.
У пациентов 1 группы выявлено повышение активности фермента в первые часы развития заболевания, которое сохранялось и в 1 сутки, однако статистически достоверно эти изменения не отличались от группы контроля. Снижение активности КП N отмечено у больных с тяжелой формой ишеми-ческого инсульта в первые часы исследования. В первые сутки заболевания в этой группе пациентов активность КП N также имела тенденцию к снижению. Однако статистически достоверными эти показатели были лишь в первые часы исследования.
Корреляционный анализ всей выборки показал положительную зависимость между тяжестью заболевания по шкале Оргогозо и активностью фермента в первые часы заболевания (R=0,4, р=0,049). Также выявлена корреляционная зависимость между активностью АПФ и КП N на 7 сутки исследования (R=0,88, р=0,019).
Изучение корреляционных связей между активностью КП N и уровнем нитрита аниона у всех обследованных больных выявило определенную зависимость. Эти данные представлены в таблице 7. Таблица 7. Корреляционные зависимости между уровнем нитрит анио на (НА) и активностью КП N
Изучаемые показатели Коэффициент Спирмена Достоверность (р)
Активность КП N в первые часы/ концентрация НА на 7 сутки -0,359124 0,047
Активность КП N в первые часы / концентрация НА на 14 сутки -0,411169 0,05
Активность КП N на 3 сутки/ концентрация НА на 3 сутки -0,359519 0,016
Активность КП N на 3 сутки/ концентрация НА на 7 сутки -0,432262 0,006
Активность КП N на 7 сутки / концентрация НА в первые часы -0,433580 0,021
Таким образом, изучение динамики активности КП N у больных ише мическим инсультом в остром периоде выявило повышение в группе пациентов с инсультом легкой и средней тяжести и снижение в группе с тяжелой формой заболевания лишь в первые часы заболевания..
Ишемия мозга сопровождается развитием сложного каскада патобио-химических реакций. Согласно современным представлениям, взаимодействие избыточных концентраций возбуждающих нейромедиаторов (глутамата) с ТЧ-метил-О-аспартатными рецепторами приводит к увеличению концентрации свободного кальция в цитоплазме нервных клеток. Содержание свободного Са2+ возрастает и в результате открытия потенциалзависимых ионных каналов при деполяризации нейронов, а также выхода кальция из внутриклеточных депо (эндоплазматического ретикулума, митохондрий). Последующая активация кальцийзависимых ферментов, в т.ч. и конститутивной NOS, приводит к усилению синтеза NO и формированию других свободных радикалов (супероксида, гидроксирадикалов, перекиси водорода).
Т.о., оксидантный стресс выступает как один из ведущих факторов повреждения мозга при ишемии. В нашей работе оценка показателей, характе ризующих свободнорадикальной окисление, осуществлялась по определению концентрации нитрит-аниона, ТБК-активных продуктов - малонового диаль-дегида (МДА), показателям люминолзависимой хемилюминесценции и ки-слородзависимым показателям метаболизма нейтрофилов (НСТ-тест).
Данные по исследованию нитрит-аниона у больных ишемическим инсультом представлены в таблице 8.
Таблица 8. Динамика содержания нитрит-аниона у больных ишемическим инсультом (в мкг/мл)
Группа Время после инсульта
Первые часы 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки
1 группа (п=51) 0,436 (0,362-0,472) 0,434 (0,348-0,5) 0,419 (0,389-0,430) 0,404 (0,355-0,495) 0,368 (0,305-0,422)
2а группа (п=15) 0,418 (0,333-0,553) 0,485 (0,426-0,566) 0,506 (0,435-0,643) 0,542 (0,473-0,590) 0,496 (0,430-0,470)
26 группа (п=П) 0,400 (0,329-0,502) 0,389 (0,343-0,480) 0,386 (0,250-0,425) 0,359 (0,276-0,476) 0,440 (0,390-0,420)
Группаконтроля(п=30) 0,405 (0,359-0,435)
- достоверно по сравнению с контролем, р 0,05;
- достоверно по сравнению с группой 2а в тот же период исследования, р 0,05.
Как следует из данных таблицы, показатели нитрит-аниона у пациентов 1 группы статистически не отличались от значений контроля.
Изучение нитрита в сыворотке крови пациентов 2-ой группы позволило выявить 2 типа динамики. Первый тип соответствовал восстановлению неврологических нарушений (группа 2а), второй тип - отсутствие положительной динамики (группа 26). Эти данные представлены на рисунке 2.
Т.о., выявлены различные типы динамики нитрит-аниона в сыворотке крови больных ишемическим инсультом в зависимости от восстановления неврологических нарушений. Повышенная концентрация этого вещества соответствовала улучшению состояния пациентов, а сниженная - отсутствию положительной динамики или ухудшению.
К числу наиболее изученных показателей активации ПОЛ при ишемии мозга относятся ТБК-АП (МДА). В нашей работе исследован этот показатель в сыворотке крови больных ишемическим инсультом в динамике. Эти данные представлены в таблице 9.
Исследование динамики ТБК-активных продуктов при моделировании ишемии головного мозга
Образование свободных радикалов является одним из механизмов, посредством которых фагоцитарные клетки проявляют свою активность. Добавление в систему люминола увеличивает квантовый выход реакции, которая адекватно отражает динамику функциональной активности лейкоцитов.
Поэтому одним из перспективных методов исследования свободнорадикаль-I ных процессов является хемилюминесценция, отражающая сверхслабое биологическое свечение [133,134].
Данные по исследованию этого показателя отражены в таблице 18.
Максимальные изменения ХМЛ наблюдались после 2-часовой окклюзии и 2-часовой реперфузии. Повышенными эти значения сохранялись и в последующих сроках эксперимента. Статистически не достоверными эти показатели по сравнению с контролем были лишь на 3 сутки после окклюзии.
Таким образом, изучение люминолзависимой хемилюминесценции при моделировании ишемии головного мозга подтверждает роль свободноради-кальных процессов в развитии этой патологии. Наибольшие изменения были зарегистрированы после 2-х часовой окклюзии и окклюзии с последующей реперфузией.
3.2.2.4. Исследование динамики кислородзависимого метаболизма нейтрофилов
Полученные данные по изучение показателей, характеризующих функциональную активность нейтрофилов в крови экспериментальных животных, представлены в таблице 19. В ходе эксперимента отмечены изменения в показателе, характеризующем «респираторный взрыв» нейтрофилов, т.н. НСТ-тесте. Статистически значимые изменения выявлены практически во всех сериях эксперимента. Исключение составили результаты эксперимента на 3 сутки после окклюзии.
Таким образом, проведенные эксперименты продемонстрировали активацию процессов СРО при моделировании ишемии головного мозга крыс. В большинстве случаев наибольшие изменения выявлены в группах после 2-часовой окклюзии и окклюзии+реперфузия.
3.3. Исследование активности ферментов обмена регуляторных пептидов и некоторых биохимических показателей в мозге экспериментальных животных при ишемическом повреждении головного мозга
Непосредственные изменения, происходящие в мозге при ишемических процессах, возможно оценить лишь изучая их на экспериментальных животных. Моделирование фокальной ишемии сводится к прекращению кровотока в определенном русле мозга, т.е. окклюзии. В нашей работе проведено исследование активности АПФ в мозге крыс линии Вистар, а также показатели, характеризующие активность нитроксидэргической системы на модели неполной ишемии головного мозга. 3.3.1. Изучение активности ангиотензинпревращающего фермента в мозге крыс
Учитывая значительную роль ангиотензина II в центральной регуляции гемодинамики, его взаимодействия с оксидом азота, влияние на процессы свободнорадикального окисления, в нашей работе изучена активность АПФ гиппокампе и больших полушариях головного мозга крыс при моделировании экспериментальной ишемии. Полученные данные представлены в табл. 20.
Как следует из таблицы, уменьшение активности фермента выявлено в гиппокампе после окклюзии во все сроки исследования. Однако статистически значимое отличие отмечено на 1 и 3 сутки после окклюзии. Аналогичная динамика активности АПФ наблюдается и после 2-х часовой реперфузии, 1 и 3 сутки эксперимента.
Окклюзия ВСА в течение 2 ч не влияла на активности АПФ в больших полушариях мозга крыс. На первые сутки после окклюзии активность фермента достоверно превышала показатели группы контроля, а на третьи сутки эксперимента достигала максимальных значений. Реперфузионные процессы, происходящие в больших полушариях после 2 ч окклюзии и на I сутки, приводили к увеличению активности фермента. К 3-м суткам эксперимента активность АПФ в исследуемом отделе мозга снижалась и статистически не отличалась от значений группы контроля.
Таким образом, определение активности АПФ в мозге экспериментальных животных при моделировании фокальной ишемии показало его разнонаправленную динамику в зависимости от изучаемого отдела мозга. В гиппокампе активность АПФ была снижена, в то время как в больших полушариях - повышена.
