Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Структура и функции митохондрий гепатоцитов 13.
1.1.1. Морфологическая характеристика митохондрий 13.
1.1.2. Химический состав митохондрий
1.1.3. Характеристика основных ферментов энергетического обмена
1.1.4. Митохондрии и метаболизм в печени .28
1.2. Взаимоотношения структуры и функции митохондрий гепатоцитов в физиологических и патологических условиях 33
1.3. Характеристика структурно-функционального состояния митохондрий гепатоцитов при различных формах поражения печени 38
1.3.1. Митохондрии гепатоцитов при нарушении кислородного режима в печени .40
1.3.2. Митохондрии гепатоцитов при нарушении оттока желчи .42
1.3.3. Митохондрии гепатоцитов при вирусном гепатите 44
1.3.4. Митохондрии гепатоцитов при токсических поражениях печени .45
1.3.4.1. Митохондрии гепатоцигов при поражении печени че-тыреххлористым углеродом 46
1.3.4.2. Митохондрии гепатоцитов при поражении печени алкоголем 47
1.3.4.3. Митохондрии гепатоцитов при поражении печени алли-ловым спиртом 50
1.3.4.4. Митохондрии гепатоцитов при поражении печени гидразином 51
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 55
2.1. Характеристика исследований в клинических условиях 55
2.2. Экспериментальные модели поражения печени 56.
2.3. Методы биохимических исследований 58.
2.3.1. Техника приготовления гомогенатов печени 58.
2.3.2. Получение митохондрий гепатоцитов .59 .
2.3.3. Получение надосадочной фракции печени .
2.3.4. Методы определения активности мито-хондриальных ферментов 61.
2.3.5. Измерение оптической плотности суспензии митохондрий 64
2.3.6. Измерение флуоресценции тетрацикли-нового зонда в митохондриях гепатоцитов (определение "кальциевой емкости") 64
2.4. Методы исследования структуры ткани печени и митохондрий гепатоцитов 65
ГЛАВА 3. Результаты исследования 66
3.1. Характеристика структурно-функционального состояния митохондрий гепатоцитов при заболеваниях печени человека 66
3.2. Характеристика структурно-функционального состояния митохондрий гепатоцитов при поражении печени в экспериментальных условиях 77
3.2.1. Вирусный гепатит у мышей 77
3.2.2. Подпеченочный холестаз у крыс .82
3.2.3. Поражение печени крыс аллиловым спиртом : 91
3.2.4. Поражение печени крыс гидразином 98
3.3. Влияние антиоксидантов 1,4—дигидропириди- нового ряда на функциональное состояние митохондрий гепатоцитов при токсических поражениях печени крыс 1р2
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 109
Выводы
Список литературы 14?
- Характеристика основных ферментов энергетического обмена
- Митохондрии гепатоцитов при поражении печени алкоголем
- Методы определения активности мито-хондриальных ферментов
- Характеристика структурно-функционального состояния митохондрий гепатоцитов при заболеваниях печени человека
Введение к работе
Актуальность исследования. Современный этап изучения патогенеза заболеваний печени, а также поиск новых лекарственных средств для лечения болезней печени может быть осуществлен на основе исследования молекулярных механизмов развития патологического процесса на уровне субклеточных структур гепатоцитов, их мембранных и ферментных систем /22, 38, 148/.
Известно, что существенное значение для структурно-функционального состояния клеток печени и осуществления ими многочисленных метаболических процессов принадлежит энергообеспечению, а основным путем генерирования энергии посредством синтеза АТФ является сопряженное с дыханием окислительное фосфорили-рование, которое происходит в митохондриях /79, 83, 120/.
Развитие биоэнергетики последних лет выдвигает на первый план мембранные аспекты проблемы биологической трансформации энергии, которые решаются в рамках хемиосмотической теории /204/. Получены убедительные доказательства о существовании кроме энергии АТФ еще одной унифицированной и транспортабельной формы энергии - мембранной, обусловленной разностью электрохимических потенциалов ионов водорода, главной задачей которой является сопряжение процессов окисления и фосфорилирования /122/. Экспериментально доказано взаимопревращение химической энергии АТФ и мембранной, осуществляемое посредством обратимой протонной АТФ-азы. Это обстоятельство определяет центральное положение Н+-АТФ-азы в процессах превращения энергии /67/.
Особая роль в синтезе богатых энергией соединений принадлежит и таким ферментам дыхательной цепи, как сукцинагдегидро-геназе /36, 71, 107/ и цитохромоксидазе /7, 78, 238/, являющих-
ся согласно хемиосмотической теории генераторами мембранной энергии /73, 79/.
Поэтому, информация об активности важнейших звеньев дыхательной цепи и ее структурной организации представляется важной как для выяснения механизмов генерации и использования энергии в печени /31/, так и для раскрытия молекулярных механизмов развития патологического процесса в ткани печени /32, 37, 72/.
Известно, что в развитии некоторых повреждений печени (при ишемии, гипоксии, отравлении четыреххлористым углеродом) значительная роль принадлежит нарушению энергетического метаболизма в митохондриях /32, 37, 72, 99, 168/, Вместе с тем энергетический обмен при патологии печени изучен недостаточно. Нет ясного представления о характере и динамике нарушения биохимических и морфологических параметров энергетического состояния митохондрий гепатоцитов при-вирусном гепатите, подпеченочном хо-лестазе, жировой дистрофии и при токсических поражениях печени, вызванных гепатотропными ядами: аллиловым спиртом и гидразином. Более того, неизвестны причинно-следственные отношения между нарушением энергетического обмена митохондрий и характером поражения ткани печени. Особенно мало подобных исследований в клинических условиях. В частности, практически не изучена степень участия и роль нарушения структуры и функций митохондрий гепатоцитов при важнейших печеночных синдромах: цитолизе и хо-лестазе.
Показано, что существенную роль в развитии патологических изменений клеток печени и повреждении мембран митохондрий играет усиление процессов перекисного окисления липидов /б, 23, 32, 50, 124/ Экспериментально доказана и функциональная связь процессов перекисного окисления липидов с состоянием АТФ-синте-
тазного комплекса и процессами транспорта катионов в митохондриях /80, 96/. В связи с этим важным представляется изучение влияния антиоксидантов на энергетический обмен митохондрий при поражениях печени, в механизме патогенеза которых ведущее место принадлежит активации процессов перекисного окисления липидов /54, III/.
Таким образом, изучение структуры и функции митохондрий при важнейших типах поражения печени представляется актуальным и необходимым для раскрытия возможной их роли в механизме развития в печени патологических процессов различной природы, разработки критериев оценки тканевых повреждений и печеночных синдромов, а также для поиска новых лекарственных средств и регуляторов энергетического обмена из класса природных и синтетических антиоксидантов, обладающих гепатопротекторными свойствами.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение особенностей энергетического метаболизма митохондрий гепатоцигов при различных этиологических типах поражения печени, а также изыскание путей нормализации энергетического обмена митохондрий с помощью синтетических антиоксидантов.
Конкретные задачи исследования:
Исследовать структурно-функциональное состояние митохондрий гепатоцитов в ткани печени при основных типах патологических процессов в клинике (вирусном гепатите, алкогольном гепатите, хроническом гепатите, циррозе печени, жировом гепатозе и подпеченочной желтухе, обусловленной желчно-каменной болезнью).
Исследовать структурно-функциональное состояние митохондрий при важнейших типах патологических процессов в печени в эксперименте (вирусном и токсическом гепатитах,в условиях нарушения оттока желчи и при жировой дистрофии печени).
а) исследовать динамику изменений активности ферментов дыхательной цепи в митохондриях печени опытных животных;
б) исследовать состояние энергозависимого транспорта ионов
кальция в митохондриях, их Са -аккумулирующую способность и струк
туру органелл при токсических поражениях печени и холестазе;
в) провести сравнительный анализ биохимических и морфологи
ческих изменений в митохондриях гепатоцитов при исследованных экс
периментальных типах патологических процессов в печени.
3) Сопоставить и проанализировать результаты изучения структуры и функции митохондрий гепатоцитов при различных типах патологических процессов в печени, полученные в клинике и эксперименте.
4-) Исследовать влияние антиоксидантов - производных 1,4—дигид-ропиридинового ряда (этидина и І,4--ДГїї-І) на функциональную активность митохондрий гепатоцитов в условиях экспериментального поражения печени.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование энергетического обмена митохондрий гепатоцитов (определение активности основных ферментов дыхательной цепи, изучение процессов активного транспорта ионов кальция, набухания и ультраструктуры митохондрий) при различных типах патологии печени, в результате которого выявлен ряд особенностей нарушения энергетического метаболизма митохондрий.
При поражении печени мышей вирусом гепатита МНУд обнаружено существенное нарушение энергетического обмена в митохондриях гепатоцитов, выразившееся в повреждении систем окисления и энергетического сопряжения. Показана отчетливая корреляция между степенью повреждения ткани печени, уровнем циголитического процесса и нарушением энергетического обмена в митохондриях гепатоцитов.
Впервые проведено комплексное исследование структуры и функций митохондрий гепатоцитов при токсическом поражении печени крыс
аллиловым спиртом, показавшее, что значительное нарушение энергетического обмена и повреждение ультраструктуры митохондрий предшествует формированию очагов некроза в ткани печени.
Установлено, что при подпеченочном холестазе крыс важным звеном в нарушении энергетического обмена митохондрий гепатоцитов является снижение активности протонной АТФ-азы.
Показано, что умеренно выраженная жировая дистрофия печени крыс, вызванная гидразином (доза яда 28 мг/кг), не сопровождается нарушениями энергетического обмена в митохондриях гепатоцитов.
Применение флуоресцентного метода Са -тетрациклинового зонда позволило выявить существенное нарушение энергозависимого процесса активного транспорта Са + в митохондриях и их Са -аккумулирующей способности при токсических поражениях печени крыс гепатотропными ядами: аллиловым спиртом и гидразином (доза яда 56 мг/кг) и при подпеченочном холестазе крыс.
Впервые исследованы гепатопротекторные свойства антиоксидантов 1,4-дигидропиридинового ряда и показано их положительное действие на энергетический обмен в митохондриях гепатоцитов при токсических поражениях печени крыс.
Практическая ценность работы. Полученные данные, касающиеся закономерностей нарушения структуры и функции митохондрий при патологии печени, могут быть использованы для разработки механизма патогенеза важнейших нозологических форм современной гепатологии и для объяснения механизма действия различных патогенных агентов на митохондрии печени.
Поскольку характер и степень нарушения структуры и функции митохондрий гепатоцитов различаются в зависимости от типа патологического процесса в печени и соответствуют степени и
- II -
характеру повреждения ткани печени, обнаруженное в настоящей работе изменение показателей структурно-функционального состояния митохондрий, может служить основой для изыскания функциональных (и диагностических)тестов, отражающих жизнеспособность печени, а также для разработки критериев глубины и обратимости повреждений печени.
Выявленное положительное действие антиоксидантов 1,4-ди-гидропиридинового ряда на энергетический обмен митохондрий в условиях экспериментального поражения печени гепатотропными ядами открывает возможность исследования и использования данных соединений в целях регуляции, профилактики и коррекции разнообразных повреждений печени.
Результаты настоящей работы могут быть использованы в исследованиях, проводимых в Латвийском гепатологическом центре, Институте органического синтеза АН ЛатвССР, Научно-исследовательском институте по биологическим испытаниям химических соединений, а также в различных клинических институтах, занимающихся вопросами патогенеза, профилактики и лечения заболеваний печени.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ученых советах Латвийского гепатологического центра МЗ ЛатвССР 1976-1982 гг., на Всесоюзной конференции по клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционных болезней, Рига, 19 октября 1977 г., Всесоюзном симпозиуме "Окислительные ферменты и регуляция их активности", Горький, 1978 г., Пленуме правления Всесоюзного общества инфекционистов "Патогенез и патогенетическая терапия инфекционных болезней',' Ростов-на-Дону, 1976 г., Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии, Астрахань, 1979 г., 4-м Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград,
г., Всесоюзном симпозиуме "Биохимия алкоголизма", Гродно,
г., Всесоюзной конференции по токсикологии, Москва, 1980 г., Всесоюзной конференции "Биологическая характеристика лабораторных животных и экстраполяция на человеке полученных в эксперименте данных", Москва, 1980 г», 6-й Всесоюзной конференции по клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционных болезней, Рига, 1983 г.
В соответствии с целью и задачами исследования, а также полученными результатами на защиту выдвигаются следующие основные положения:
I),Нарушение энергетического'обмена митохондрий гепатоцитов является неспецифической ответной реакцией на различные патогенные факторы: яды, вирусы, нарушение оттока желчи. Однако, характер, степень и динамика изменений структурно-функционального состояния поврежденных митохондрий гепатоцитов различны в зависимости от особенностей патогенного агента (этиологии поражения печени) и печеночного синдрома (цитолиз, холестаз, жировая дистрофия).
Повреждение структуры и функций митохондрий гепатоцитов имеет существенное значение в патогенезе некробиотического процесса в печени и является одним из механизмов развития цитоли-тического синдрома.
Среди антиоксидантов 1,4-дигидропиридинового ряда целесообразен поиск гепатопротекторов, действие которых связано с регуляцией и нормализацией энергетического обмена митохондрий
печени.
- ІЗ -
Характеристика основных ферментов энергетического обмена
Элементарный состав Мх характеризуется содержанием азота, углерода, фосфора и водорода - составных частей липопротеидов органелл /17/.
В состав дыхательных ферментов Мх входят железо, медь, сера. Последняя содержится в составе сульфгидрильных групп многих энзимов Мх.
Основными биохимическими компонентами органелл являются белки и липиды, а также небольшое количество ДНК и РНК. По данным Н.Р.Елаева /57/ в Мх гепатоцитов содержится 10-12 рг РНК и 0,6-1,4 (дг ДНК на мг белка. Около 80-90% мигохондриальной РНК в печеночных паренхиматозных клетках обладает свойствами рибонук-леопротеидных частиц, расположенных в матриксе и в морфологическом и функциональном отношении не отличающихся от рибосом /56/. Кроме того, в Мх содержится гликоген, витамины (А, В2, Вб, Bj2, К, фолиевая и пантотеновая кислоты) и различные кофермен-ты /132,171/.
Липиды митохондрий, митохондриальные липиды составляют примерно 25-30$ сухого вещества и представлены главным образом фосфолипидами: фосфатидилхолином - 41$, фосфатидилэтаноламином -33$, дифосфатидилглицерином (кардиолипином) - 15$ и фосфатидил-инозитом - 8$ /НО/. Фосфолипиды играют важную роль в осуществлении практически всех функций Мх: дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием, гидролиза АТФ, трансгидрогеназ-ной реакции, переноса адениловых нуклеотидов и т.д. /83/. Относительное содержание фосфолипидов во внешней мембране Мх в 1,8-3,0 раза выше, чем во внутренней. Так, изучение распределения и содержания фосфолипидов в Мх гепатоцитов показало, что в наружной мембране органелл содержится до 37$ фосфолипидов, во внутренней - до 25$, а в матриксе не более 1,4$ /47/.
Существенные различия имеются и в составе фосфолипидов для мембран Мх. Например, характерным признаком внутренней мембраны является высокое содержание кардиолипина, в то время как внешняя мембрана обогащена холестерином и фосфатидилинозитом /208/. Следует отметить, что среди митохондриальных фосфолипидов обнаружены и лизофосфатиды: лизофосфатидилхолин, лизофосфатидил-этаноламин и лизофосфатидилсерин. В мембранах Мх гепатоцитов присутствует гораздо больше слабосвязанных, чем прочно связанных с мембраной фосфолипидов. Особенно прочная связь с внутренней мембраной органелл характерна для кардиолипина, участвующего в поддержании ее структуры /83/. Структура мембран Мх, как известно /33/, в большей степени определяется остатками жирных кислот в молекулах фосфолипи-дов. Так, в фосфолипидах наружной мембраны содержание насыщенных жирных кислот выше, чем во внутренней, обуславливая значительную ригидность первой /47/. Белки митохондрий. Белки составляют 65-70% от сухого веса органелл; часть из них является структурными компонентами Мх, а другая быстро выделяется в раствор при разрушении органелл. Имеются данные о распределении белка в Мх гепатоцитов крысы: во внешней мембране - 4%, межмембранном пространстве - 6%, внутренней мембране - 21% и матриксе - 69% /224/. Основную часть белков Мх составляют ферменты. К настоящему времени в Мх обнаружено более 100 ферментов /83/. Однако точные сведения о местах локализации многих из них пока отсутствуют. Кроме того, не вполне понятно и отношение- некоторых из них к основным метаболическим процессам, протекающим в Мх. Поэтому имеет смысл ограничиться рассмотрением основных закономерностей в распределении ключевых ферментных систем между отдельными частями Мх. Ферменты внешней мембраны Мх можно условно разделить на две группы. К первой относятся специфические окислительные ферменты: моноаминооксидазы, кинуренингидроксилаза, чувствительная к ротенону НАДН: цитохром-с-редуктаза; ко второй группе - многочисленные ферменты метаболизма липидов: ацил-коэнзим А-синте-таза, ферменты, осуществляющие элонгацию жирных кислот и их синтез с/е novo, ферменты ацилирования глицерофосфата и лизо-фосфатидиловой кислоты. Внешняя мембрана Мх содержит также фос-фатидатфосфатазу, фосфолипазу А2 и гексокиназу. Характерной чертой многих из перечисленных энзимов является го, что для их функционирования необходим АТФ /115/. Ферменты межмембранного пространства легко солюбилизируют-ся при избирательном разрушении внешней мембраны Мх. При этом не исключено, что некоторые из них в интактных Мх связаны с мембраной. К таким энзимам относятся аденилаткиназа, АТФ-нук-леозиддифосфаг-фосфотрансфераза и креатинфосфокиназа /83, 176/. Ферменты внутренней мембраны Мх, осуществляющие генерацию электрохимического потенциала Нойонов и сопряженное с ней фос-форилирование АДФ, представляют компоненты дыхательной цепи: НАДН-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, железо-серные белки, цитохромы группы Ь, Cj, с, а, и а3, система трансформации энергии - ІЇ -АТФ-азньїй комплекс /79/. С внутренней мембраной Мх связаны электронтранспортные флавопротеиды, принимающие участие в окислении жирных кислот, дегидрогеназы холина и fe-оксимасляной кислоты, а также трансгидрогеназа пиридиновых нуклеотидов. Есть основания полагать, что внутренняя мембрана органелл содержит специфические переносчики для (орто) фосфата, Са , орнитина, /чгглутамата, о -кетоглутарата, адениновых нуклеотидов, ди- и трикарбоновых кислот и других метаболитов /І7ІД Считают, что такие переносчики имеют ряд свойств, присущих ферментам: специфичность к субстрату и насыщаемость по нему, наличие ингибиторов и сравнительно высокую (в сравнении с диффузионными процессами) энергию активации /171/. Недавно установлено, что ферменты внутренней мембраны органелл способны катализировать синтез Ые novo is. элонгацию некоторых жирных кислот, гидролиз фосфолипидов и ацилирование ли-зофосфатидов /83/. К числу ферментов матрикса Мх следует отнести в первую очередь ферменты цикла трикарбоновых кислот: цитрат-синтетазу, ако-нитазу, изоцитратдегидрогеназу, фумаразу, малатдегидрогеназу и ряд энзимов, регулирующих работу цикла: глутаматдегидрогеназу, аспартатаминотрансферазу, пируваткарбоксилазу, фосфопируват-карбоксилазу и др. Известно, что в матриксе Мх осуществляется активация жирных кислот с участием ГТФ и АТФ-зависимых ацил-конэнзим-А-синтетаз и некоторые стадии -окисления жирных кислот /79, 175/. Таким образом, Мх представляют собой строго организованную в функциональном плане систему, характеризующуюся определенным расположением ферментных систем.
Митохондрии гепатоцитов при поражении печени алкоголем
В силу чрезвычайно широкой распространенности алкоголизма во всем мире алкогольные поражения печени являются актуальной проблемой всей медицинской науки и гепатологии в частности. Во всех своих аспектах она еще далека от разрешения и требуется большой клинический материал и глубокие экспериментально-теоретические исследования.
Клинические и экспериментальные результаты многих исследователей /21, 27, 106, 129, 197, 198, 237/ рассматривают алкоголь как гепатоцеллюлярный яд. Убедительным аргументом этой гипотезы являются данные, показавшие, что этанол наряду с накоплением жира часто вызывает дистрофию и некроз гепатоцитов /21/. А патофизиологические механизмы алкогольного поражения гепатоцитов, как известно, во многом обусловлены путями метаболизма самого этанола /199/.
Несмотря на широкие экспериментальные исследования ферментных систем, участвующих в окислении экзогенного этанола и доказательства адаптационных их изменений при острой и хронической интоксикации алкоголем, подчеркивается неизученность данных путей в превращениях "эндогенного" этанола /27/.
В настоящее время установлено, что этапом, лимитирующим скорость окисления этанола в печени является активность субстратных шунтов в Мх (в условиях предварительного голодания) или скорость утилизации АДФ для окислительного фосфорилирования (в условиях нормального питания) /237/. Аргументируется это избытком ионов водорода, поступающих из алкоголя на митохондриальный НАД /197/. Увеличенный уровень НАДН в свою очередь усиливает превращение пирувата в лактат, оказывая при этом ингибирующий эффект на цикл Кребса, а следовательно и на окисление жирных кислот и окислительное фосфорилирование в Мх /151/.
Уже при первой, обычно обратимой стадии алкогольного поражения печени - ожирении наблюдаются изменения в ультраструктуре гепатоцитов, особенно микросом и Мх-органелл, связанных с метаболизмом этанола /106/. Показано поражение субклеточных структур гепатоцитов крыс при парентеральном введении энергетических смесей, содержащих этанол; при этом отмечалась лабилизация и активация лизосом, солюбилизация СД и усиленное накопление продуктов переокисления липидов /90/.
Отмечаются сдвиги и в фосфопипидном составе мембран Мх, возможно, связанные с интенсификацией пероксидации липидов, хотя имеющиеся на сегодня факты не позволяют со всей очевидностью признать прооксидантное действие алкоголя /50, 76, 186/.
Гистологические и электронномикроскопические исследования биопсийных препаратов печени больных, страдающих хроническим алкоголизмом и фракции Мх гепатоцитов крыс, отравленных этанолом выявляют увеличенное количество аномальных Мх в перипортальных зонах печеночных- клеток /199/. Характерным признаком алкогольного поражения печени считается появление гигантских Мх ("мега-митохондрий") /145/. Часто при алкогольной интоксикации наблюдаются агрегация кристч и изменение конфигурации органелл /182, 188, 203, 227/.
В последнее время все чаще обсуждается гепатотоксичность продукта метаболизма этанола - ацетальдегида, окисление которого осуществляется главным образом в Мх гепатоцитов /152/.
Известно, что у алкоголиков наблюдается повышенный уровень ацетальдегида в крови, причина появления его неясна, но доказательства разрушительного действия на Мх имеются /14-2/. Предполагается, что аккумуляция ацетальдегида в Мх может индуцировать некоторые ферменты /237/, ингибировать J3-окисление жирных кислот, блокировать активность цикла Кребса /129/. В опытах т vitro ацегальдегид ннгибирует большинство функций Мх, связанных с ВД-зависимыми субстратами /196/, высокие концентрации его тормозят окисление сукцината, разобщают окислительное фосфорилирование /123, 152/.
Следует отметить, что хроническое употребление алкоголя вызывает индукцию микросомальных ферментов, которая сопровождается увеличением потребления кислорода, что в свою очередь приводит к относительной гипоксии в районе центральной вены и к развитию ишемического некроза /21/. Кстати, обнаружено, что выраженность некроза гепатоцитов при алкогольном гепатите больных коррелирует с повышением активности митохондриальных ферментов: аспартат-аминотрансферазы и глутаматдегидрогеназы в биопсийных препаратах печени /196, 227/.
Таким образом, анализируя имеющиеся данные, можно заключить, что Мх гепатоцитов очень чувствительны к токсическому действию этанола, но имеются расхождения в точках зрения авторов относительно характера и степени нарушения структурно-функционального состояния Мх гепатоцитов при алкогольном гепатите больных и при отравлении животных этанолом, которые обусловлены различиями в условиях проведения экспериментов, т.е. тем, какие дозы алкоголя и какие субстраты использовались. Кроме того, во многих работах отсутствуют данные морфологии, касающиеся характера и степени поражения ткани печени при интоксикации организма алкоголем. Вместе с тем, знания о соответствии функциональной активности Мх уровню структурной организации их при алкогольных поранениях печени в клинике и эксперименте пока что недостаточны.
Методы определения активности мито-хондриальных ферментов
Как показывают работы многих авторов, синтетические антиоксиданти уменьшают токсичность различных гепатотропных ядов и снижают степень функциональных и морфологических изменений, вызванных этими агентами /23, 141, 155, 163/.
Протекторные свойства антиоксидантов Г4-дигидропиридино-вого ряда: этидина и 1,4-ДПГ-1 исследовались на модели белковой дистрофии печени, вызванной аллиловым спиртом и жировой дистрофии печени, вызванной солянокислым гидразином (см.главу 2). Критериями оценки эффекта указанных препаратов на энергетический обмен Мх были активность маркерного фермента органелл СД и состояние процесса активного транспорта ионов кальция. Параллельно проводилось светооптическое изучение ткани печени контрольных и опытных животных. Следует подчеркнуть, что при данных типах поражения печени введение этидина приводит к снижению в печени уровня продуктов перекисного окисления липидов, и в ряде случаев оказывает нормализующее действие на морфологическое состояние ткани печени /88, 92, 94/.
На модели белковой дистрофии печени, вызванной интоксикацией аллиловым спиртом, введение антиоксидантов нормализует активность СД, определяемую в гомогенате печени крыс (табл. 14). Причем, более эффективным оказался этидин. Под влиянием изучаемых препаратов наблюдается повышение интенсивности флуоресценции тетрациклинового зонда. Как видно из табл. 16 через 24 часа после введения яда, интенсивность флуоресценции антибиотика в Мх падает почти в два раза, составляя в среднем 105,6 ед.фл., а при введении этидина и 1,4-ДГП-1 данный показатель возрастает соответственно до 170 ед.фл. и 151,4 ед. фл.
На модели жирового гепатоза, вызванного внутрибрюшинным введением солянокислого гидразина морфологически обнаружены выраженная жировая дистрофия гепатоцитов и нерезкая внутридолько-вая клеточная инфильтрация. Введение этидина уменьшает в некоторой степени жировую инфильтрацию печени.
В группе животных, получивших 1,4-ДГП 1 через 24 часа от начала опыта сохранялось межокапельное диффузное ожирение печеночных клеток. После 48-ми часового воздействия гидразина и 1,4-ДПЫуодной трети крыс светооптически не выявлялось поражение печени; у остальных животных наблюдалось мелкокапельное ожирение.
Ультраструктурный анализ гепатоцитов крыс при введении гидразина выявил неоднородный характер изменений Мх: наблюдались Мх без каких-либо изменений, часть органелл были сильно набук-шие, у других набухание менее выражено. В некоторых гепатоцитах Мх имели просветленный матрико, уменьшенное количество крист или последние были укороченными.
Снижение активности СД при жировой дистрофии печени наблюдалось только в Мх гепатоцитов через 48 часов после воздействия яда, в гомогенате же печени крыс активность СД была повышена через 72 часа после интоксикации (табл. 15). ведение антиоксиданте не отразилось на активности СД. Но эффективными оказались антиоксиданты в нормализации энергозависимого транспорта ионов кальция. Так, из табл. 16 видно, что гидразин вызывает снижение флуоресценции антибиотика в среднем до 109,7 ед.фл.; введение этидина повышает флуоресценцию до 171,7 ед.фл., а 1,4-ДГП-1 до 148,2 ед. фл.
Таким образом, используемые антиоксиданты оказывают положительные эффекты на биохимические показатели энергетического обмена Мх, причем более благоприятное действие оказывает этидин. Морфологическая картина пораженных гепатоцитов при этом нормализуется в меньшей степени.
Изменение структуры и функции Мх гепатоцитов является важным звеном многих патологических процессов в ткани печени, а также одним из основных критериев жизнеспособности органа /70/. Исходя из этих предпосылок перед работой были поставлены задачи изучить характер, динамику и степень нарушения структурно-функционального состояния Мх гепатоцитов при различных типах патологических процессов в печени.
Обнаружено нарушение ультраструктуры Мх гепатоцитов и снижение активности СД в ткани печени больных при основных типах-патологических процессов в печени (рис. 20). Эти данные свидетельствуют о том, что повреждение энергетической функции Мх является закономерной и неспецифической реакцией гепатоцита, независящей от природы этиологического фактора, вызывающего поражение печеночной ткани. Однако, анализ степени снижения активности СД при различных типах патологических процессов в печени позволяет прийти к заключению, что более выраженное снижение активности данного фермента закономерно наблюдается во всех тех случаях, когда в достаточной мере повреждена паренхима печени, например, при ВГ, ОАГ и др., когда наблюдаются дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, или же при уменьшении числа паренхиматозных клеток, как это имеет место при циррозе печени. Наиболее демонстративно это видно из сравнения острых гепатитов, при которых имеются выраженные изменения паренхимы печени, с ХПГ, для которого характерна относительная сохранность структурно-функционального состояния гепатоцитов.
Характеристика структурно-функционального состояния митохондрий гепатоцитов при заболеваниях печени человека
Возрастание активности дыхательных ферментов, наблюдаемое на начальных стадиях снижения энергизации дыхательной цепи, может играть роль компенсаторного приспособления энергетического обмена к неблагоприятным условиям, которое в зависимости от взаимоотношения повреждающих и компенсаторных реакций может перейти в ингибирование, либо активирование /72/. Такая направленность изменения активности оксиредуктаз особенно характерна для СД и связана она как со специфическим путем окисления сукцината, так и с наличием системы множественного контроля регуляции активности данного фермента /36, 107/.
Надо полагать, что наблюдаемое в ранние сроки холестаза вовлечение Мх гепатоцитов в патологический процесс носит компенсаторно-приспособительный характер в ответ на стрессовую ситуацию (резкое нарушение оттока желчи) и направлено на улучшение энергообеспечения печени для восстановления процессов образования и секреции желчи, нуждающихся в АТФ /40, 81/.
Следует указать, что и при лапаротомии в первые три часа наблюдается тенденция к повышению активности СД и ЦО, которая затем сменяется снижением активности СД и восстановлением активности ЦО до контрольного значения. Такой характер изменения активности дыхательных ферментов Мх у ложнооперированных животных, по-видимому, обусловлен операционным стрессом и сопутствующим ему увеличением в крови содержания катехоламинов и глюкокортико-идов /97/, которые, как известно, способствуют субстратной активации окислительно-восстановительных ферментов Мх печени /69/, и, в частности, увеличивают проницаемость мембран органелл для сукцината /137/.
Влияние вышеупомянутых факторов на активность дыхательных ферментов Мх не исключается и в раннем периоде холестаза, но в последнем случае преобладающее значение в развитии нарушения структуры и функции Мх, по-видимому, оказывает накопление билирубина и желчных кислот, наблюдаемое уже в первые часы после перевязки желчного протока /4-8, 132/. Ко всему сказанному присоединяется и тканевая гипоксия, вызывающая различные нарушения в метаболизме Мх и гепатоцитов в целом /I3V»
Становится очевидным тот факт, что указанные выше факторы на ранних стадиях холестаза могут привести к срыву компенсаторных реакций или снижению их эффективности и способствовать развитию дистрофических изменений паренхимы печени.
В силу того, что причина стаза желчи в условиях нашего эксперимента сохраняется, дальнейшее развитие патологического процесса характеризуется усилением выраженности холестатических изменений гепатоцитов, достигающих максимума на седьмые сутки после перевязки общего желчного протока. Об этом свидетельствуют данные морфологического исследования ткани печени и функциональные биохимические критерии холестаза: уровень билирубина, активность щелочной фосфатазы, содержание холестерина и липо-протеидов /28, 64-, 87/.
Следует указать, что эволюция холестаза у крыс, вызванного перевязкой общего желчного протока, сопровождается ранней активацией лизосомальных ферментов /28/ и усилением лерекисно-го окисления липидов мембран гепатоцитов /25/, играющих важную роль в развитии цитолитического процесса, в частности, при ВГМ. Однако, синдром цитолиза на нашей модели холестаза выражен крайне незначительно даже тогда, когда светооптически выявляются очаговые дегенеративно-дистрофические изменения единичных гепатоцитов. Здесь уместно подчеркнуть, что для холестаза, особенно для его раннего периода, характерен анаболический тип метаболизма печени, возникающий в результате гиперфункционирования гепатоцитов за счет напряжения функции экскреторного аппарата и усиления синтеза желчных кислот, холестерина, липопротеидов и белка /26/.
Как известно, /129/ холестерин является обязательным компонентом мембран клеток печени и изменение его содержания влияет на структуру последних /14, 82/. Поэтому, нарастание синтеза и повышение содержания холестерина в печени при холестазе может приводить к стабилизации ("уплотнению") мембранных структур ге-патоцитов и уменьшению их проницаемости, то есть к ослаблению цитолитического процесса /95/. Учитывая способность лизосом к экзоцитозу, начальную лабилизацию их мембран можно рассматривать в качестве адаптационного сдвига, направленного на выведение из гепатоцита токсических продуктов, образующихся в нем при застое желчи /22/.
Что касается предполагаемого участия процессов перекисно-го окисления липидов в патогенезе холестаза, то доступные литературные сообщения по этому вопросу весьма малочисленны и противоречивы /22, 59, 86/.
Следует отметить, что проблема холестаза при развитии экспериментальной подпеченочной желтухи у крыс привлекает к себе внимание и своеобразием нарушения печеночнокишечной циркуляции желчных кислот, а также возможным побочным влиянием их на многие обменные процессы мембранных систем гепатоцитов /102/. Известно также, что нарушение печеночно-кишечной циркуляции приводит к изменению обмена желчных кислот уже в ранние периоды после начала стаза желчи, вызывающему при прогрессировании патологического процесса в печени снижение секреции и синтеза этих биологически активных соединений, что может быть причиной нарушения метаболизма липидов. В этой связи вопрос о состоянии энергетического обмена Мх гепатоцитов в динамике развития холестаза, особенно на ранних его стадиях, представляется недостаточно изученным.
Согласно полученным данным, в течение первых трех суток после перевязки желчного протока крыс функциональные нарушения Мх выражаются в увеличении активности СД, снижении активности Н+-АТФ-азы и незначительном снижении активности ЦО на третьи сутки опыта. Кроме того, наблюдается отчетливое снижение оптической плотности митохондриальной суспензии, свидетельствующее о развитии набухания органелл т бііц ,торможении индуцированного неорганическим фосфатом набухания и нарушение энергозависимого транспорта ионов кальция (табл. 7, 8). Проведенное элек-тронномикроскопическое изучение также свидетельствует о функциональном напряжении Мх гепатоцитов, выразившемся в увеличении числа нерегулярных форм, набухании и дезорганизации крист в отдельных оряанеллах.
