Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора G|?bL|?-эндорфина Ковалицкая Юлия Андреевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Ковалицкая Юлия Андреевна. Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора G|?bL|?-эндорфина : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.04 Пущино, 2006 127 с. РГБ ОД, 61:06-3/1215

Содержание к диссертации

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11

Неопиоидное действие р-эндорфина 11

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33

* Глава 1. Материалы и методы 33

1. Реактивы 33

Экспериментальные животные 33
Штамм бактерий 34
Клеточные линии 34
Среды для работы с культурами клеток 35

_t 6. Синтетические пептиды 35

7. Методы выделения и оценки функциональной активности
иммунокомпетентных клеток 36

Получение макрофагов брюшной полости мыши 36
Определение способности макрофагов к адгезии 36
Определение способности макрофагов к распластыванию 37
Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов in vitro 37
Культивирование лейкемических линий человека in vitro 38
Оценка ростовой активности лейкемических клеток по включению [метил-³Н]тимидина в клетки 39
Изучение спонтанной миграции мышиной макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы 39

8. Получение поликлональных антител к молекуле иммунорфина 40

8.1. Получение поликлональной сыворотки 40

* 8.2. Тестирование сывороток мышей на наличие антител к иммунорфину
в иммуноферментном анализ 40

9. Методы культивирования доимплантационных зародышей мыши in vitro
41

10. Определение кинетических характеристик взаимодействия изучаемых
і

пептидов с рецепторами методом радиолигандного анализа 42

Получение мембранных фракций из различных органов крысы. 42
Иодирование пептида пентарфина 43
Получение [³Н]иммунорфина 43

, 10.4. Изучение связывания ¹²⁵1-меченного пентарфина и

[³Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, лейкимическими клетками Jurkat и мембранными фракциями из

различных органов крысы 44

10.5. Анализ ингибирования связывания I-меченного пентарфина и
[ Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, клетками
линии Jurkat и мембранными фракциями из органов крысы немечеными
пептидами и налоксоном 46

11. Изучение функциональной активности надпочечников крысы 47

11.1. Изучение влияния иммунорфина на активность аденилатциклазы в
мембранах коры надпочечников крысы 47

11.2. Исследование влияния иммунорфина на уровень 11-
оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крови крыс 47

12. Статистическая обработка результатов 49

Глава 2. Результаты исследований 50

1. Характеристика пептидов 50

2. Влияние пептидов на функциональную активность перитонеальпых
макрофагов мыши in vitro 51

2.1. Действие пептидов на спонтанную миграцию клеток мышиной
макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы in vitro 51

2.2. Влияние пентарфина и циклопентарфина на адгезию и
распластывание перитонеальных макрофагов мыши in vitro 52

4
2.3. Влияние пентарфина и циклопентарфина на бактерицидную
активность перитонеальных макрофагов 54

3. Влияние пептидов на рост лейкемических клеточных линий человека in
vitro 57

3.1. Действие иммунорфина на рост Т-лимфобластной клеточной линии
человека Jurkat 57

3.2. Влияние циклопентарфина на рост клеток острой промиелоцитарной
лейкемии человека HL-60 58

4. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы.... 60

4.1. Влияние иммунорфина на аденилатциклазную активность мембран
коры надпочечников крысы 60

4.2. Влияние иммунорфина на уровень 11-оксикортикостероидов в
надпочечниках и плазме крови крысы 60

Влияние пептидов на развитие доимплантационных зародышей мышиб 1
Изучение рецепции пептидов 69

6.1. Связывания [³Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами
мыши 69

6.2. Связывания [³Н]иммунорфина с клетками Т-лимфобластной линии
Jurkat 72

6.3. Связывание [ Н]иммунорфина с мембранами выделенными из
различных органов крысы 75

Связывания [ Н]иммунорфина с мембранами коры надпочечников крысы 76
Изучение связывания ^12э1- меченного пентарфина с перитонеальными макрофагами мыши 79

7. Получение поликлональных мышиных антител к молекуле иммунорфина

Глава 3. Обсуждение результатов 85

3.1. Влияние иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на
функциональную активность клеток иммунной системы 87

3.2. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы93

Влияние пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина на развитие доимплантационных зародышей мыши 95
Исследование неопиоидного рецептора Р-эндорфина с помощью Р-эндорфинподобных пептидов 99

ВЫВОДЫ 105

ЛИТЕРАТУРА 106

БЛАГОДАРНОСТИ 127

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

АКТГ - адренокортикотропный гормон

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИФА - иммуноферментный анализ

кДа - килодальтон

Кон А - конканавалин А, лектин Canavalia ensiformes

КС - 11 -оксикортикостероиды

ЛПС - бактериальный липополисахарид

Трис - трис (гидроксиметил) аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

Fc - фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина G, состоящий из доменов Сц2

и СцЗ (от англ. crystallizable fragment- кристаллизующийся фрагмент) HEPES - >}-2-гидроксиэтилпиперазин-ЬР-2-этансульфоновая кислота IgG - иммуноглобулин класса G Н цепь - (heavy) тяжелая цепь иммуноглобулина G ПОМК - проопиомеланокортин IL - интерлейкин

Kd- равновесная константа диссоциации Kj- равновесная константа ингибировнаия п - число мест связывания рецепторов в расчете на одну клетку tween - полиэтиленгликоль сорбитанмонолаурат PMSF - фенилметилсульфонилфторид

Для написания последовательностей пептидов и белков были использованы однобуквенные и трехбуквенные символы аминокислот.

Введение к работе

Актуальность проблемы. Открытие Виктором Найяром в 1970 г эндогенного тетрапептида тафтсина (TKPR, фрагмент 289-292 Сщ-домена тяжелой (Н) цепи иммуноглобулина G человека (IgG)), обладающего одновременно иммуностимулирующей и нейротропной активностями, явилось стимулом для поиска новых биологически активных пептидов в ряду фрагментов и аналогов иммуноглобулинов. Через десять лет Джек Джуллиард обнаружил в составе тяжелой цепи IgG человека [3-эндорфинподобную последовательность (SLTCLVKGFYPSDI, фрагмент 364-377 Снз-домена Н-цепи IgG человека 1-4 подклассов). В нашей лаборатории был синтезирован декапептид SLTCLVKGFY (авторское название -иммунорфин) и показано, что он является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к опиоидному антагонисту налоксону) рецептора (3-эндорфина. Рецепторный аппарат живой клетки - это сложно организованная система, построенная из специализированных рецепторов, которые получают и переводят на язык молекул непрерывный поток информации из внешней и внутренней среды, обеспечивая координацию работы нейроэндокринной, иммунной, сердечно-сосудистой и других систем организма. Понятно, что чем больше мы будем знать о структуре и функции каждого отдельного рецептора, тем более полным и детальным будет наше представление о механизмах функционирования клетки, органа, системы органов и организма в целом. Поэтому открытие и изучение новых неизвестных ранее клеточных рецепторов является актуальным направлением развития современной биохимии. Изучение свойств и механизма действия синтетического пептида иммунорфина и его активных аналогов позволит исследовать распределение и функции неопиоидного рецептора Р-эндорфина в организме человека и млекопитающих.

В настоящее время на основе производных природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Ценными качествами

8 пептидов как потенциальных лекарственных средств нового поколения являются высокая активность, быстрая реакция организма на их введение в сочетании с практически полным отсутствием токсичности, иммуногенности и аллергенное. Получение и изучение новых пептидов с простой структурой (состоящих из нескольких аминокислотных остатков), высокой устойчивостью к действию протеаз (долгоживущих) и обладающих ценными фармакологическими свойствами - важнейшая задача современной биохимии. В этой связи, изучение спектра биологической активности и механизма действия иммунорфина и его активных производных является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия синтетического Р-эндорфинподобного пептида иммунорфина и его активных фрагментов и аналогов.

Основные задачи исследования:

1. Изучение влияния иммунорфина, пентарфина (фрагмента иммунорфина 6- 10) и циклопентарфина на активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro.

2. Исследование влияния иммунорфина на активность клеток коры надпочечников крысы in vitro и in vivo.

3. Изучение влияния пентарфина, циклопентарфина и циклодипептарфина на доимплантационное развитие зародышей мыши in vitro.

4. Получение [ Н]иммунорфина и 1-меченного пентарфина и исследование их связывания с перитонеальными макрофагами мыши и мембранными фракциями, выделенными из различных органов крысы.

Работа выполнена в лаборатории "Пептидных биорегуляторов" Филиала Института биоорганической химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым эксперментальным доказательством того, что р-эндорфинподобный пептид иммунорфин, соответствующий аминокислотной последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG человека, является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к налоксону) рецептора |3-эндорфина. Впервые охарактеризовано распределение данного рецептора в организме крысы, и установлена его функция в клетках коры надпочечников.

Приоритетными являются данные о стимулирующем действии иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на фагоцитоз перитонеальными макрофагами мыши вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro.

Впервые показано, что пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин стимулируют деление бластомеров и ускоряют развитие доимплантационных зародышей мыши in vitro.

Практическая ценность результатов работы. Ученые и клиницисты во всем мире рассматривают биологически активные пептиды как потенциальные лекарственные средства нового поколения. С этих позиций ценной может оказаться способность иммунорфина и его фрагментов стимулировать бактерицидную активность макрофагов: вполне вероятно, что использование данных пептидов или их производных совместно с антибиотиками позволит снизить терапевтические дозы, а значит и многочисленные негативные последствия применения последних.

Благодаря ярко выраженному положительному влиянию на доимплантационное развитие зародышей фрагменты иммунорфина -пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин могут найти применение в экспериментальной эмбриологии в качестве средств повышения жизнеспособности ранних эмбрионов.

Поскольку иммунорфин и его фрагменты являются селективными агонистами неопиоидного рецептора (3-эндорфина, они могут быть успешно

10 использованы в качестве инструмента выявления и исследования данного типа рецептора на различных типах клеток.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Синтетические Р-эндорфинподобные пептиды иммунорфин (SLTCLVKGFY), пентарфин (VKGFY) и циклопентарфин [cyclo(VKGFY)] активируют перитонеальные макрофаги мыши in vitro: стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.

2. Иммунорфин ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию 11-оксикортикостероидов из надпочечников в кровь.

3. Пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин [cyclo(VKGFYVKGFY)] увеличивают жизнеспособность, а также стимулируют деление бластомеров и образование нормальных бластоцист из доимплантационных зародышей мыши in vitro.

4. [ Н]иммунорфин и I-меченный пентарфин с высоким сродством и специфичностью связываются с неопиоидным (не чувствительным к опиоидному антагонисту налоксону) рецептором (3-эндорфина на перитонеальных макрофагах мыши, клетках человеческой Т-лимфобластной линии Jurkat, а также на мембранах коры надпочечников, миокарда, селезенки и головного мозга крысы.

Часть I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Неониоидное действие р-эндорфина

Р-Эндорфин принадлежит к группе опиоидных пептидов, т.е. пептидов, связывающихся с морфиновыми (опиоидными) рецепторами. Впервые о существовании в мозге эндогенных соединений, являющихся агонистами опиоидных рецепторов стало известно в 1974 г из работ Терениуса и Хьюгса [61, 144, 145]. В 1975 г Симантов, Снайдер и Хьюгс установили структуру этих веществ и назвали их [Met⁵]- и [Ьеи⁵]энкефалинами (рис.1) [62, 125]. Это событие послужило толчком для исследований в данном направлении. Своим открытием Р-эндорфин обязан исследователям Р-липотропина. р-Липотропин принадлежит к группе белковых гормонов, стимулирующих липолиз в жировой ткани. Этот гормон, состоящий из 91 аминокислотного остатка, впервые был выделен из гипофиза овцы в 1964 г [75], затем из гипофиза свиньи [47], и, наконец, из гипофиза человека [26]. Продолжая работу, первооткрыватели р-липотропина Ли и Чанг в 1976 г хотели выделить исследуемый белок из гипофиза экзотического животного - верблюда, но из-за протеолиза выделить его тогда не удалось, однако, в ходе работы был обнаружен пептид, состоящий из 31 аминокислотного остатка [76]. Анализ аминокислотной последовательности пептида показал, что он полностью идентичен фрагменту 61-91 С-концевой части молекулы Р-липотропина овцы, а от аналогичных фрагментов Р-липотропинов свиньи и человека отличается на один аминокислотный остаток в 83 положении и на два аминокислотных остатка 87 и 91 положениях соответственно. Выделенный пептид практически не обладал липотропной активностью, но было показано, что он обладает значительной опиоидной активностью. Обнаруженный пептид получил свое название немного позже, когда Линг и Джиллемин в июне 1976 г выделили из нейрогипофиза и гипоталамуса свиньи фрагменты Р-липотропина 61-76, 61-91 и 61-77 и назвали их а-, Р- и у-эндорфинами (рис. 1) [49, 82]. В 1976 г Р-эндорфин был выделен из гипофиза человека, установлена его аминокислотная последовательность, и показано, что человеческий р-эндорфин также является С-концевым фрагментом Р-липотропина человека (рис.1) [77]. [Met [энкефалин [Ьеи⁵]энкефалин а-Эндорфин

Р-Эндорфин у-Эндорфин YGGFM YGGFL YGGFMTSEKSQTPLVT YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNVHKKGQ і ю YGGFMTSEKSQTPLVTL

Рис.1. Аминокислотные последовательности а-, Р- и у-эндорфинов и [Met⁵]- и [Ьеи⁵]энкефалинов человека.

Вторичная структура молекулы Р-эндорфина была установлена By с помощью спектров кругового дихроизма молекулы гормона в воде [166]. Было показано, что полипептидная цепь гормона формирует а-спираль, Р-лист и р-поворот, разделенные нерегулярными участками (рис. 2).

\ Morphir» binding *rte Eniutptakn boding site * Rondwn eel; ИИ e-Hekx ; ,*sv\ »0-Sheet ; ^> 0-Tuin

Рис. 2. Вторичная структура молекулы р-эндорфина [80].

13 В организме |3-эндорфин образуется из проопиомеланокортина (ПОМК), синтезируемого в передней доле гипофиза [103]. ПОМК также служит источником а, Р- и у-меланоцитстимулирующих гормонов, АКТГ, ос-и Р-липотропинов [55]. При процессинге расщепление происходит почти исключительно по остаткам основных аминокислот (Lys, Arg) и осуществляется трипсиноподобными ферментами (рис. 3). Образование (3-эндорфина регулируется кортикотропин-релизинг гормоном (corticotrophin-releasing hormone, CRH) гипоталамуса. Активация действия CRH происходит в результате любого стресса, как эмоционального, так и физического. Установлено, что индуцированные а-интерфероном лимфоциты человека, а также макрофаги в очаге воспаления, секретируют Р-эндорфин [20, 85, 128].

АКТГ(1-39) Р-ЛІЩ44-134) у-ЛПГ р-эндорфин (44-101) (104-134)

Рис. 3. Процессинг ПОМК в передней и промежуточной доле гипофиза головного мозга крысы [55].

В 1976 г было показано, что р-эндорфин человека является селективным агонистом опиоидных рецепторов [77]. В этом же году Р-эндорфин человека был синтезирован [78]. Синтезированный пептид был использован в экспериментах по изучению ингибирования связывания [³Н]морфина с мембранными фракциями головного мозга немечеными природным и синтезированным р-эндорфином. Было установлено, что сродство к рецептору природного и синтетического пептида одинаково [78]. Было показано, что р-эндорфин при внутримозговом введении мышам

14 оказывает выраженное и длительное анальгетическое действие [84]. Гормон был активнее морфина в 18-33 раза (в зависимости от используемой тест-системы). Действие пептида блокировалось специфическим опиоидным антагонистом - налоксоном [84]. Было обнаружено, что при внутривенном введении р-эндорфина мышам в концентрациях 8,2, 14,5 и 20,1 мкг/кг, животные не реагировали на болевые стимулы. Действие пептида в этом случае также было дозозависимым, предварительное введение мышам налоксона (1 мкг/кг) приводило к исчезновению анальгетического эффекта Р-эндорфина [147-149]. Позже было установлено, что при внутривенном введении кошкам в дозах 25 и 50 мкг/животное р-эндорфин вызывает анальгезию и изменение поведения у кошек, причем появление характерного состояния (настороженность, фиксация взгляда, резкие повороты головы) авторы связывали с возникновением у животных зрительных галлюцинаций. Действие пептида было дозозависимым и блокировалось налоксоном [95]. Кроме того, было показано, что внутримозговое введение р-эндорфина крысам, вызывало ярко выраженное седативное действие и каталепсию [66-68].

Для того, чтобы установить участок молекулы Р-эндорфина, ответственный за анальгетическое действие пептида, были синтезированы фрагменты р-эндорфина (1-5)-(28-31), (6-31), (1-5)-(16-31). Синтезированные пептиды, [Met⁵]-, [Ьеи⁵]энкефалины, а-, Р-, и у-эндорфины вводили в мозг крысам и оценивали их анальгетическое действие. Эксперименты показали, что полное длительное обезболивание обеспечивалось только внутримозговым введением целой молекулы р-эндорфина [79]. Однако, недостатком этой работы может быть достаточно небольшое количество тестируемых фрагментов гормона.

Известно, что р-эндорфин взаимодействует с двумя классами опиоидных рецепторов: и-, открытых Мартином в 1976 г, и 5-, обнаруженных Лордом в 1977 г [12, 86, 91]. Некоторые исследователи полагают, что существует є- тип опиоидных рецепторов, и одной из

15 характеристик этого типа рецепторов является большая селективность к [3-эндорфину, чем к какому-либо другому эндогенному опиоидному пептиду [46, 79, 150]. є-Опиоидньїе рецепторы обнаружены в семявыносящем протоке крыс, в головном мозге и других тканях. Показано, что связывание f3-эндорфина с є-опиоидньїми рецепторами гипофиза вызывает высвобождение [Меґ^знкефалина, который, в свою очередь, воздействует на 82 рецепторы в спинном мозге, обеспечивая анальгезию [46, 150]. Молекулу Р-эндорфина можно условно разделить на три участка: N-концевая часть молекулы отвечает за связывание с 8-рецепторами, центральная часть молекулы является антигенной детерминантой, С-концевая часть молекулы взаимодействует с ц-рецепторами (рис. 2) [80]. Все типы опиоидных рецепторов относятся к семейству рецепторов, связывающих G-белки. Связываясь с 8- и ц-опиоидными рецепторами, Р-эндорфин оказывает обезболивающее действие, участвует в процессах регуляции дыхания, тонуса сердечно-сосудистой системы, пищевого поведения [32]. Через 8-рецепторы опосредовано действие пептида на двигательную активность, обоняние, распознавательные функции, регуляцию настроения и эмоций [32, 39]. Взаимодействуя с ц-опиоидными рецепторами Р-эндорфин регулирует процессы терморегуляции, обучения и памяти [32,153].

В процессе большого числа исследований было обнаружено, что многие пептидные гормоны проявляют активность одновременно в нервной, эндокринной и иммунной системах, осуществляя их взаимосвязь. Механизмы взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем стали одной из актуальных и перспективных проблем, волнующих ученых всего мира. Казалось, что столь хорошо изученный гормон, как р-эндорфин, уже не хранит в себе тайн и загадок. Однако, в ходе целого ряда исследований, выяснилось, что р-эндорфин обладает иммуномодулирующей активностью, механизмы которой не известны.

Первые данные о неопиоидном рецепторе р-эндорфина были опубликованы в 1979 году. Американский ученый Хазум обнаружил, что специфическое связывание І-меченного P-[D-Ala ]эндорфина с трансформированными Т-лимфоцитами человека ингибируется р-эндорфином и p-[D-Ala ]эндорфином, в то же время на связывание не влияют аналоги энефалина, р-липотропин, инсулин, глюкагон, АКТГ, а-меланоцитстимулирующий гормон, опиоидные агонисты и антагонисты [53]. Это открытие дало основание предположить наличие на лимфоцитах человека неизвестных специфических участков связывания Р-эндорфина неопиоидной природы. Было показано, что для связывания с этим рецептором необходим С-концевой участок молекулы Р-эндорфина, т.к. связывания а-эндорфина с данным рецептором не было обнаружено. Открытие специфических рецепторов р-эндорфина неопиоидной природы позволило предположить, что некоторые центральные и периферические физиологические функции гормона, могут осуществляться при помощи отличных от классических, связанных с опиоидными рецепторами, механизмов [53]. Таким образом, рецепторные исследования доказали существование рецепторов Р-эндорфина неопиоидной природы на Т-лимфоцитах человека, что позволяет объяснить иммуномодулирующее действие гормона. Последующие исследования Гилмана и соавторов подтвердили результаты Хазума. Гилман впервые установил, что Р-эндорфин влияет на функциональную активность клеток иммунной системы [43]. В присутствии Р-эндорфина увеличивалась продукция митогенов Т-лимфоцитами человека. Гормон также способствовал пролиферации Т-клеток in vitro. Поскольку а-эндорфин не влиял на активность Т-лимфоцитов человека, был сделан вывод, что действие гормона осуществляется через рецептор, специфичный к С-концевой части молекулы р-эндорфина [43]. Таким образом, в этой работе авторы отметили неизвестное ранее действие пептидного гормона, а также высказали предположение, что это действие вызвано связыванием пептида с неизвестным рецептором. В этой же работе было установлено, что Р-эндорфин, связываясь с рецептором, нечувствительным к налоксону, увеличивает пролиферацию спленоцитов

17 крысы, индуцированную Кон А. В тоже время, МакКейн в 1982 г, опубликовал данные о том, что гормон снижает пролиферацию Т-лимфоцитов периферической крови человека in vitro, что противоречит данным Гил мана [94]. Однако, в обеих работах выдвигается предположение, что действие р-эндорфина опосредовано связыванием с рецептором неопиоидной природы. Исследования Хейджнена и соавторов внесли некоторую ясность в изучение этой проблемы. Оказалось, что Р-эндорфин оказывает модулирующее действие на Т-лимфоциты. При изучении воздействия гормона на индуцированные Кон А Т-лимфоциты двух доноров оказалось, что действие пептида было прямо противоположным: в одном и том же диапазоне концентраций (10'¹⁴ - 10"⁹ М) гормон увеличивал пролиферацию Т-лимфоцитов одного донора, а на пролиферацию лимфоцитов другого донора оказывал ингибирующее действие. Было изучено влияние различных фрагментов р-эндорфина на пролиферацию активированных Кон А Т-лимфоцитов этих доноров. По данным Хейжнена и соавт. фрагменты р-эндорфина 10-16 и 2-31 обладали такой же активностью, как и целая молекула [54]. Полученные данные позволили предположить, что модулирующее действие р-эндорфина на Т-лимфоциты человека связано с уровнем экспрессии рецептора неопиоидной природы на поверхности клеток.

В дальнейшем было показано, что пролиферацию индуцированных Кон А лимфоцитов человека стимулировал не только р-эндорфин, но и N-Ac-p-эндорфин, фрагменты р-эндорфина 6-31 и 18-31, в то время как фрагмент р-эндорфина 1-27, [Меі^знкефалин, а- и у-эндорфины были не активны [45]. Эти данные свидетельствуют о том, что для связывания с предполагаемым рецептором неопиоидной природы, необходима С-концевая область молекулы гормона.

Для выяснения причины существования столь противоречивых данных о действии р-эндорфина на пролиферацию Т-лимфоцитов Ван Ден Бергом и соавт. было изучено влияние пяти опиоидных пептидов (а-, Р-, у-эндорфинов, [Met⁵]- и [Ьеи⁵]энкефалинов) на индуцированную Кон А

18 пролиферацию Т-клеток селезенки крыс [155]. Оказалось, что постоянное присутствие любого из этих пептидов в среде культивирования спленоцитов не влияет на пролиферативный ответ этих клеток. В то же время 30-минутная преинкубация Т-клеток с Р-эндорфином (но не с другими пептидами) приводила к дозозависимому увеличению уровня пролиферации на 50-100%. Присутствие налоксона не влияло на стимулирующее действие Р-эндорфина. Из этого следовало, что действие Р-эндорфина на пролиферацию Т-клеток опосредовано не через опиоидные рецепторы. Одновременно было показано, что постоянное присутствие р-эндорфина (или а-эндорфина) в культуре Т-клеток, которые были преинкубированы с р-эндорфином, полностью отменяло стимулирующий эффект последнего. Авторы работы предположили, что в отсутствие опиоидных пептидов на поверхности Т-лимфоцитов селезенки крысы доступны для связывания только неопиоидные рецепторы р-эндорфина. Введение в среду р-эндорфина приводило к опосредованному через эти рецепторы увеличению пролиферативного ответа. В условиях постоянного присутствия р-эндорфина (или другого опиоидного пептида) в среде культивирования Т-клеток на их поверхности появляются опиоидные рецепторы, связываясь с которыми Р-эндорфин ингибирует собственный стимулирующий эффект [155].

Для доказательства гипотезы о том, что молекула р-эндорфина содержит два различных участка, один из которых служит для связывания с опиоидными, а другой с неопиоидными рецепторами, Ван Ден Бергом и соавт. было изучено влияние на пролиферацию Т-лимфоцитов синтетических фрагментов Р-эндорфина - 6-31, 18-31, 24-31, 28-31 и 1-27 (пептиды вносили в среду культивирования до стимуляции их митогеном) [156]. В результате проведенных исследований было установлено, что фрагменты р-эндорфина 6-31 и 18-31 увеличивали пролиферацию Т-клеток, причем первый был значительно активнее второго. В то же время фрагменты р-эндорфина 1-27, 24-31 и 28-31 оказались неактивными. На основании полученных результатов авторы предположили, что для реализации действия Р-эндорфина на Т-

19 лимфоциты, а значит и для взаимодействия с налоксон-нечувствительными рецепторами, важен участок молекулы Р-эндорфина (6-23). При этом, ключевую роль в связывании, по мнению авторов работы, играет фрагмент (3-эндорфина 18-23. Одновременно эти же авторы показали, что р-эндорфин (18-23) увеличивает продукцию IL-2 и IL-4 CD4⁺ Т-клетками [156].

Исследование свойств тетрапептида Lys-Lys-Gly-Gln, представляющего собой С-концевой фрагмент Р-эндорфина 28-31, показало, что он стимулирует пролиферацию индуцированных Кон А Т-лимфоцитов человека в 1,2 - 7,5 раз в диапазоне концентраций пептида 10"^п - 10"⁴ М [108]. Максимальная активность пептида проявлялась при концентрации ~ 1 нМ. Протестированные параллельно опиоидные пептиды - [Met⁵]-, [Ьеи⁵]энкефалины, р-эндорфин и более короткие фрагменты исследуемого пептида были менее активны. Авторы также выдвинули предположение, что действие тетрапептида осуществляется через неопиоидные рецепторы Р" эндорфина. Однако, в этой работе не хватает рецепторных исследований, чтобы подтвердить данное предположение.

Было установлено наличие неопиоидных участков связывания на двух комплексах системы комплемента человека: на цитолитическом мембранном комплексе C5b-9(m), и на цитолитически неактивном сывороточном комплексе SC5b-9 [115]. На взаимодействие 1-меченого Р-эндорфина с рецептором на C5b-9(m) не влияли АКТГ, инсулин, релизинг фактор лютеинизирующего гормона, динорфин (1-13), р-казоморфин.

Следующим этапом исследований было получение кинетических характеристик неопиоидного рецептора Р-эндорфина. В 1985 г Шейгерер обнаружил неопиоидные рецепторы Р-эндорфина на нескольких клеточных линиях мышиной тимомы [116]. На клетках линии EL4 показано, что связывание 1-меченного Р-эндорфина с неопиоидным рецептором ингибировалось немеченым Р-эндорфином, оно зависело от температуры (в дальнейшем все эксперименты проводили при 4С) и рН, характеризовалось насыщаемостью и обратимостью. Связывание 1-меченного р-эндорфина не

20 ингибировалось [Leu⁵]- и [Ме1⁵]энкефалинами, а также N-концевыми фрагментами р-эндорфина - (3-эндорфином (1-16) (а-эндорфин) и Р-эндорфином (1-27) [116]. Эти исследования еще раз подтверждают предположение о том, что за связывание с неопиоидным рецептором ответственна С-концевая часть молекулы (3-эндорфина. Установлено, что после связывания I-меченного Р-эндорфина с неопиоидным рецептором на поверхности клеток EL4 при 37С наблюдалась интернализация лиганд-рецепторного комплекса в клетку посредством эндоцитоза [116]. Большинство пептидных гормонов и ростовых факторов попадает в клетки-мишени именно таким путем, но их дальнейшая судьба внутри клетки не известна. Шейгерер и соавт., опираясь на результаты Кинга [73] по исследованию интернализации эпидермального ростового фактора, предположили, что Р-эндорфин способен модулировать клеточные функции, такие как пролиферация Т-лимфоцитов, взаимодействуя с специфическими внутриклеточными участками связывания. Вскоре было показано, что гормон способен связываться с внутриклеточным белком кальмодулином и влиять на активность фосфодиэстеразы, причем связывание наблюдалась как в случае N-Ac-p-эндорфина, так и фрагмента р-эндорфина 14-31 [42, 87]. Однако, пока для утверждения о внутриклеточных участках связывания гормона недостаточно аргументов.

Неопиоидные рецепторы р-эндорфина были обнаружены также у компонентов плазмы и сыворотки крови человека в присутствии гепарина [58]. При этом взаимодействие гормона с неопиоидными рецепторами зависело от температуры и не наблюдалось в присутствии других антикоагулянтов. Связывание I-меченного Р-эндорфина характеризовалось насыщаемостью и обратимостью и не ингибировалось налоксоном, морфином и рядом других опиоидных пептидов, являющихся фрагментами N-концевой части молекулы Р-эндорфина. Связывание ингибировалось С-концевым фрагментом р-эндорфина, что подтверждает неопиоидную природу этих рецепторов.

Шахаби и соавт. обнаружили существование неопиоидного рецептора В-эндорфина на интактных спленоцитах мыши, культивируемых in vitro [118]. Было, установлено, что связывание I-меченного В-эндорфина со спленоцитами насыщаемо, график Скэтчарда имел вид прямой линии, что говорило о наличии одного типа рецепторов на поверхности клеток, Kj = 4,1 нМ. Кроме того, связывание 1-меченного р-эндорфина со спленоцитами в равной степени ингибировалось N-Ac-p-эндорфином и Р-эндорфином, в то время как фрагменты Р-эндорфина 6-31 и 28-31 были менее активны, чем Р-эндорфин в 10 и 1000 раз соответственно. Налоксон и фрагмент Р-эндорфина 1-27 были не активны. Таким образом, характеристики неопиоидного рецептора р-эндорфина на спленоцитах мыши совпадали с ранее полученными для других клеток-мишеней.

Этой же группой ученых было изучено связывание 1-меченного Р" эндорфина с клетками моноцитарной клеточной линии человека U-937 [119]. Результаты экспериментов показали, что связывание гормона с рецептором было насыщаемым и характеризовалось высокой аффинностью (Kd= (1,2 ± 0,5) х Ю' М). Связывание '"I -меченного Р-эндорфина с клетками моноцитарной клеточной линии человека U-937 ингибировалось Р-эндорфином и N-Ac-P-эндорфином, а налоксон, морфин, и другие селективные опиоидные агонисты были не активны. Впервые было изучено влияние ионов (Na⁺, К⁺, Са⁺², Mg⁺², Мп⁺²) и гуанозинтрифосфата на связывание 1-меченного Р-эндорфина с мембранами клеток U-937. Оказалось, что увеличение концентрации перечисленных ионов приводило к уменьшению связывания. Присутствие гуанозинтрифосфата (10"⁴ М) также уменьшало связывание на 25 %.

Шахаби и соавт. [118, 119] предприняли первую попытку изучить данный рецептор на молекулярном уровне. Из мембран спленоцитов был выделен комплекс - рецептор, химически сшитый с ⁵1-меченным Р" эндорфином, и определена молекулярная масса белков этого комплекса методом электрофореза в SDS полиакриламидном геле. Оказалось, что

22 гормон связывался с белками с молекулярной массой 66 и 57 кДа. Подобные исследования были проведены и с моноцитарной клеточной линией U-937, получены следующие значения: I-меченный Р-эндорфин связывался с белками массой 66 и 44 кДа [119]. В обоих случаях связывание характеризовалось высокой специфичностью и нечувствительностью к налоксону. Другая группа авторов, [116], изучая связывание Р-эндорфина с налоксон-нечувствительным рецептором клеток мышиной тимомы EL4, показала, что гормон в присутствии налоксона взаимодействует с двумя участками связывания, различающихся по аффинности и молекулярной массе белков рецепторного комплекса. Молекулярная масса белков высокоаффишюго рецепторного комплекса равна 72 кДа, низкоаффинного -40 кДа. Дальнейшие исследования показали, что игибируют связывание I-меченного р-эндорфина с высокоаффинным участком связывания на клетках EL4 р-эндорфин и его С-концевые фрагменты, что подтверждает неопиоидную природу рецептора. Некоторе несоответствие молекулярной массы белков рецепторного комплекса, скорее всего, может быть связано с применением различных методов анализа рецепторного комплекса при проведении эксперимента.

На перитонеальных макрофагах мыши неопиоидные рецепторы Р-эндорфина были охарактеризованы в 1997 году [165]. Анализ связывания I-меченного Р-эндорфина с перитонеальными макрофагами мыши в координатах Скэтчарда показал, что график Скэтчарда имеел вид прямой линии, что говорило о наличии одного типа рецепторов на поверхности клеток. Были определены K_d= 9,75 + 2,6 нМ и количество сайтов связывания в расчете на одну клетку (8218 + 2360). Связывание 1-меченного Р-эндорфина с перитонеальными макрофагами мыши ингибировалось немеченым р-эндорфином, а опиоидные лиганды и налоксон были не активны.

Для дальнейшего исследования неопиоидного рецептора Р-эндорфина необходимы были лиганды, взаимодействующие только с данным типом

23 рецептора. Возможность работы с такими соединениями была получена после того как, американский ученый Джулиард обнаружил в экстракте плаценты человека пептид SLTCLVKGFYPSDI, представляющий собой фрагмент 364-379 тяжелой цепи IgG, гомологичный центральной части молекулы Р-эндорфина SQTPLVTLFKNAII на 60% [70]. Хоук синтезировал этот пептид и показал, что он связывается с рецепторами Р-эндорфина на мембранах головного мозга крысы [60]. В дальнейшем было показано, что эти рецепторы являются неопиоидными.

Для дальнейших исследований Завьяловым и соавт. был синтезирован Р-эндорфинподобный пептид SLTCLVKGFY - иммунорфин, соответствующий последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG. Проведены сравнительные исследования связывания р-эндорфина и иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши. Оказалось, что на макрофагах существует два типа рецепторов для Р-эндорфина (K_di = 6,1 ± 0,6 нМ и K_d2 = 0,31 ± 0,02 нМ), и иммунорфин конкурирует с Р-эндорфином за связывание с высокоаффинным рецептором (K_f = 2,5 ± 0,9 нМ). Этот тип рецепторов не блокируется налоксоном и не взаимодействует с [Leu⁵]- и [Меі⁵]знкефалинами [171]. Данные, полученные годом позже Вудсом и соавтрами сообщали о наличии только одного типа рецепторов (неопиоидного) для Р-эндорфина на поверхности макрофагов, хотя Kj также лежит в области наномолярных концентраций: Kd= 9,75 ± 2,6 нМ по данным Вудса [165] и Kd = 6,1 ± 0,6 нМ [171].

Солидный вклад в изучение данной проблемы внесли исследования, проведенные в Филиале Института биоорганической химии им. академиков Шемякина М.М и Овчинникова Ю.А. в лаборатории пептидных биорегуляторов, заведующая лабораторией Наволоцкая Е.В. С помощью иммунорфина были обнаружены и охарактеризованы налоксон-нечувствительные рецепторы р-эндорфина на Т-лимфоцитах человека и синаптических мембранах головного мозга крысы [104, 105]. На Т-лимфоцитах человека было показано наличие одного типа рецепторов к р-

24 эндорфину и отсутствие ингибирования налоксоном связывания гормона с этим рецептором. Установлено, что константа диссоциации лиганд -рецепторного комплекса находится в области наномолярных концентраций ( = 0,25 ± 0,03 нМ), что совпадает с литературными данными. В аналогичных экспериментах с иммунорфином на Т-лимфоцитах человека Kd равнялось 7,0 ± 0,3 нМ [104]. На мембранах головного мозга крысы также было показано наличие одного типа рецепторов для Р-эндорфина и иммунорфина, связывание пептидов не блокировалось налоксоном, K_d для (3-эндорфина было равно 1,87 ± 0,13 нМ, для иммунорфина - 2,93 ± 0,27 нМ [105]. Было проведено исследование по изучению связывания фрагментов иммунорфина с мембранами головного мозга крысы и Т-лимфоцитами человека. Установлено, что самым коротким активным фрагментом иммунорфина является пептид VKGFY - фрагмент иммунорфина 6-Ю. Пептид с высоким сродством связывался с нечувствительным к налоксону рецептором В-эндорфина: Kd в исследованных тест-системах равнялось 3,17 ± 0,29 нМ и 36,3 ± 0,5 нМ на мембранах головного мозга крысы и Т-лимфоцитах человека соответственно. Это открытие позволило использовать фрагмент иммунорфина 6-Ю в дальнейших исследованиях [104, 105].

Было изучено влияние Р-эндорфина и иммунорфина на рост различных клеточных линий человека, чтобы установить наличие неопиоидных рецепторов гормона на их поверхности. Оказалось, что исследуемые пептиды стимулировали рост клеток Т-лимфобластных линий Jurkat (на 50-70%) и МТ-4 (на 30%), причем действие пептидов на рост клеточной линии Jurkat не блокировалось налоксоном. Р-эндорфин и иммунорфин в диапазоне физиологических концентраций не оказывали влияния на рост В-лимфобластной линии человека RPMI-1788, острой промиелоцитарной лейкемии HL-60 и хронической миелоидной лейкемии К-562. Было обнаружено, что иммунорфин в концентрации 10" - 10" М увеличивал скорость деления клеток диффузной гистиоцитарной лимфомы U-937 на 30%. В тоже время Р-эндорфин в дозе 10"⁸- 10"⁷ М вызывал 40% увеличение

25 роста данной клеточной линии. Таким образом, в ходе этих исследований была разработана удобная модель для изучения неопиоидного рецептора с помощью пептида иммунорфина [89].

Поскольку синтетические р-эндорфинподобные пептиды с высоким сродством связываются с нечувствительным к налоксону рецептором, их можно использовать в качестве селективнных агонистов для изучения данного типа рецептора. По сравнению с р-эндорфином пептиды имеют преимущества, т.к. связываются только с неопиоидным рецептором, тогда как Р-эндорфин помимо нечувствительного к налоксону рецептора связывается с ц-, б- и є-опиоидньши рецепторами.

Таким образом, опиоидный пептид Р-эндорфин оказывает неопиоидное действие. Гормон влияет на активность клеток иммунной системы. Неопиоидное действие р-эндорфина осуществляется через рецептор нечувствительный к налоксону, блокатору опиоидных рецепторов. Проанализировав литературные данные, можно сделать вывод, что участок молекулы гормона, ответственный за связывание с неопиоидным рецептором, находится в пределах фрагмента (6-23) молекулы р-эндорфина. На данном этапе исследований недостаточно информации о структуре неопиоидного рецептора Р-эндорфина.

В настоящее время не ясно, является ли неопиоидный рецептор Р" эндорфина новым рецептором Р-эндорфина или это уже известный рецептор, способный наряду с собственным эндогенным лигандом связывать Р-эндорфин. Волеманн и Бенухе [164] высказали предположение о том, что неопиоидное действие Р-эндорфина может быть объяснено образованием рецепторных гетеродимеров. В последние годы были опубликованы данные о способности опиоидных рецепторов взаимодействовать друг с другом и образовывать новые функциональные структуры, самой простой из которых является димер. Более того, описана гетеродимеризация двух функционально активных опиоидных рецепторов, к- и 8-, что привело к образованию нового рецептора с функциональными свойствами несколько отличными от

26 исходных рецепторов [69]. В качестве критерия активности гетеродимера оценивалось специфическое связывание селективных агонистов и антагонистов с гетеродимером к-8 и отдельно с каждым исходным типом опиоидного рецептора на мембранах клеток, экспрессирующих либо к-, либо 8-, или оба типа этих рецепторов. Показано, что с высоким сродством (Kd ~ 1 нМ) происходило связывание гетеродимера как с отдельными агонистами исходных рецепторов, так и с комбинацией двух селективных агонистов или двух селективных антагонистов. Связывания агониста в присутствии антагониста не наблюдалось. Однако, у гетеродимера к-5 не наблюдалось высокого сродства к некоторым агонистам и антагонистам исходных рецепторов [69]. Вероятно, гетеродимеризация приводила к образованию нового участка связывания, способного избирательно связываться с селективными лигандами. Однако, идея того что этот гетеродимер является неопиоидным рецептором [3-эндорфина сомнительна. В статье Джордана и Деви (1999) отмечено, что и- и 8-классы опио.идных рецепторов не образовывали гетеродимера, в тоже время было показано, что (3-эндофин может связываться только с ц- и 8-опиоидными рецепторами [12]. Отличительной особенностью связывания Р-эндорфина с неопиоидным рецептором является взаимодействие с рецептором в присутствии антагониста опиоидных рецепторов налоксона [53]. Показано, что данный, нечувствительный к налоксону, рецептор с высоким сродством связывается с Р-эндорфином, С-концевыми фрагментами (3-эндорфина (С-конец молекулы, ответственный за связывание с ц-опиоидными рецепторами), с N-Ac-p-эндорфином и Р-эндорфинподобным пептидом иммунорфином, а с другим опиоидными пептидами он не взаимодействует [104, 118, 119, 165]. В статье Джордана и Деви приведен широкий спектр агонистов и антагонистов 8- и к-рецепторов, связывающихся с высоким сродством с гетеродимером, однако, в присутствии антагониста связывания опиоидного пептида с гетеродимером не наблюдалось.

Группа исследователей под руководством Уалдхоера (2005) [158], с помощью опиоидного агониста б'-гуанидиноналтриндола (6'-GNTI), обладающего уникальным свойством селективно активировать только гетеродимеры опиоидных рецепторов, показала, что функционально активные гетеродимеры опиоидных рецепторов действительно существуют in vivo. Оказалось, что существуют гетеродимеры, образованные рецепторами, сопряженными с G-белками, но их образование ткане-специфично. Наблюдалась анальгезия, вызванная действием б'-GNTI при введении в спинной мозг крысы, но при введении в головной мозг анальгезия не наблюдалась. Эти данные свидетельствуют о том, что гетеродимеры не образуются в головном мозге, а существование неопиоидного рецептора р-эндорфина доказано на мембранах головного мозга крысы [53].

Подводя итог, можно сделать вывод, что четко показано существование рецептора нечувствительного к налоксону, с высоким сродством связывающего р-эндорфин, С-концевые фрагменты р-эндорфина, N-Ac-P-эндорфин и р-эндорфинподобный пептид иммунорфин. Этот рецептор обнаружен на мембранах головного мозга крысы, перитонеальных макрофагах мыши, на Т-лимфоцитах человека, спленоцитах мыши, трансформированных клеточных линиях человека и мыши. K

Согласно литературным данным последних лет, не только Р-эндорфин, но и целый ряд опиоидных пептидов обладает неопиоидной активностью. Пептиды взаимодействуют с рецепторами, отличными от опиоидных, и связывание с этими рецептрами не блокируется налоксоном. Аминокислотные последовательности некоторых из этих пептидов приведены на рис. 4. Наибольшее количество публикаций посвящено неопиоидному действию эндогенного опиоидного пептида динорфина А.

28 Динорфин А, взаимодействуя с к-опиоидными рецепторами, оказывает анальгетическое действие, питьевую и пищевую мотивацию, взаимодействие нервной и эндокринной систем. Было установлено, что для связывания динорфина с опиоидными рецепторами необходима последовательность Туг-Gly-Gly-Phe, так называемый адресный фрагмент, поэтому для исследования неопиоидного действия пептида использовали его фрагменты без N-концевого Туг [117]. Установлено, что в большинстве случаев неопиоидное действие динорфина А и его производных связано с взаимодействием с подтипом глутаматных рецепторов N-метил-О-аспартат, представляющих собой рецепторные каналы (NMDA рецепторы). Было установлено, что, связываясь с NMDA рецепторами, динорфин ослабляет развитие привыкания к обезболивающему действию морфина. Динорфин А и фрагмент динорфина А 2-17 подавляют абстинентный синдром, вызванный налоксоном, и ингибируют развитие привыкания у морфин-зависимых мышей, а также дозозависимо увеличивают внутриклеточный уровень глутамата и аспартата в гиппокампе крыс [34,137, 146].

Динорфин A YGGFLRRIRPKLKWDNQ [Ме(⁵]энкефалин YGGFM MERF YGGFMRF

ВАМ22 YGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYG VV-геморфин 7 VVYPWTQRF

Ноцицептин FGGFTGARKSARKLANQ

Эндоморфин-1 YPWF- NH₂

Эндоморфин-2 YPFF-NH2

Рис. 4. Аминокислотные последовательности динорфина А, [Ме1:⁵]энкефалина, MERF, ВАМ22, геморфина, ноцицептина и эндоморфинов-1 и -2.

Было показано, что I-меченный фрагмент динорфина А 2-17 с высоким сродством связывается с NMDA рецепторами на мембранах коры головного мозга крысы (K_d = 9,4 + 1,6 нМ), в субъединице NR1 NMDA рецептора определена аминокислотная последовательность, с которой взаимодействуют динорфин А и фрагмент динорфина А 2-17 [123, 138].

Однако, имеются данные о неопиоидном действии динорфина А, не связанном с NMDA рецепторами. Было установлено, что введение динорфина А и его фрагментов в спинной мозг крысы приводило к увеличению частоты сердечных сокращений и артериального давления, что говорит о неопиоидном действии пептидов на вегетативную нервную систему [112].

Было обнаружено, что [³Н]динорфин А связывается с неопиоидными рецепторами на клетках гипофизарной клеточной линии мыши AtT 20, не экспрессирующих опиоидные рецепторы. [168]. Кроме того, по данным Танга, возбуждающее действие динорфина А в спинном мозге, связанное с увеличением притока ионов кальция через потенциалзависимые кальциевые каналы, может быть опосредовано не только взаимодействием с NMDA рецепторами, но и взаимодействием с неустановленным типом неопиоидных рецепторов [139].

Интересно отметить, что динорфин А может проникать как в нейрональную клетку, так и в клетки других тканей. Динорфин А с помощью не установленных механизмов быстро проходит через плазматическую мембрану. Установлено, что прохождение пептида через плазматическую мембрану не связано с аппаратом Гольджи или с традиционным эндоцитозом [90]. С помощью иммунофлуоресценции показана низкая концентрация динорфина в ядре и на плазматической мембране. Возможность проникновения динорфина в клетку может быть связана с его неопиоидным действием [90].

Таким образом, неопиоидное действие динорфина А и его фрагментов может быть опосредовано связыванием с NMDA-рецепторами, а также взаимодействием с неизвестными неопиоидными рецепторами.

Хорошо изученным опиоидным пептидом, обладающим неопиоидной активностью, является [Мег^энкефалин. Известно, что пептид взаимодействует с ц- и 5-опиоидными рецепторами. Однако, было показано, что [Met ]энкефалин также взаимодействует с еще одним типом рецепторов, названных ^-рецепторами (другое название - opioid grow factor (OGF) -рецепторы) [169]. Связываясь с OGF - рецепторами, пептид выступает в качестве опиоидного ростового фактора клеток [52, 59]. Затем было осуществлено клонирование и определена нуклеотидная последовательность кодирующей ДНК OGF-рецептора крысы и человека [170]. Как оказалось, структуры этих и классических опиоидных рецепторов не гомологичны.

До сих пор не установлено существование неопиоидного рецептора для эндогенного опиоидного пептида [Met ]энкефалин-А^ -Phe (MERF) производного проэнкефалина А. Фрагмент MERF 4-7, пептид Phe-Met-Arg-Phe (FMRF), оказывает возбуждающее действие на нейроны продолговатого мозга, причем, налоксон не влиял на эту активность [40]. Изучение связывания меченного тритием MERF с мембранами головного мозга крысы, лягушки и свиньи дало противоречивые характеристики рецептора. По сведениям одних авторов, рецептор частично устойчив к действию налоксона или подобен рецептору а₂ [15, 160, 161]. Данные других авторов свидетельствуют о наличии неопиоидного компонента в участке связывания [15, 16]. Воллеманн и Бенухе полагают, что это опиоидный рецептор частично устойчивый к действию налоксона [163]. Причин для сомнения множество, для их разрешения необходимы дальнейшие исследования в данном направлении.

Опиоидный пептид ВАМ22 (рис. 4), образующийся из проэнкефалина А путем посттрансляционного ферментативного расщепления, активирует семейство сенсорных нейрон-специфичных рецепторов, сопряженных с G-

31 белками (SNSR) [74, 126]. В пептиде присутствует аминокислотная последовательность [Мег^энкефалина, поэтому он также взаимодействует с классическими опиоидными рецепторами. Известно, что за связывание с SNSR отвечает фрагмент 8-22 пептида ВАМ22. SNSR-рецепторы расположены на поверхности малых спинных корешков и на сенсорных нейронах тройничного нерва у человека и крысы, они нечувствительны к налоксону и слабо активируются опиоидными лигандами. Физиологическая роль связывания ВАМ22 с этими рецепторами пока остается неизвестной, однако, неопиоидная природа рецепторов несомненна [33, 50].

Геморфины - не типичные опиоидные пептиды, образующиеся из структурных белков. Показано, что ЬУУ-геморфин-4 в диапазоне наномолярных концентраций влияет на активность фосфатазы в лимфоцитах человека, причем действие пептида связано с взаимодействием с кальмодулином, и ключевым ферментом, лежащим в основе молекулярных механизмов действия пептида, является кальцинейрин [14]. Геморфины оказывают опиоидное и неопиоидное действие на LC нейроны [167]. Однако, изучение связывания меченых тритием геморфинов с мембранами головного мозга крысы показало лишь слабое сродство к опиоидным рецепторам [19, 99, 135]. Эти данные позволяют предположить, что для этого семейства пептидов должны существовать другие рецепторы, отличные от опиоидных.

Эндоморфин-1 и -2 являются селективными агонистами ц-опиоидных рецепторов и обладают характерным для |і-агонистов действием, исключая анальгезию. Было показано, что [ Н]эндоморфин-1 и -2 специфично связываются не только с высокоаффинными д-опиоидными рецепторами, но и взаимодействует с налоксон-нечувствительными участками связывания на мембранах головного мозга крысы. Неопиоидные рецепторы эндоморфина-1 отличаются более низкой аффинностью, за связывание с ними конкурируют различные эндогенные агонисты опиоидных рецепторов [18, 37].

И наконец, ноцицептин, или орфанин FQ, пептид, обладающий наибольшей гомологией с опиоидным пептидом динорфином А, относится к

32 классу опиоидных пептидов. Его фармакологическое действие весьма разнообразно: стимулирует активность нейронов, обеспечивает анальгезию в спинном мозге, регулирует высвобождение гормонов гипофиза в покое и при стрессе [98]. Пептид является природным лигандом нечувствительных к налоксону orphan-рецепторов, сопряженных с G-белками, этот тип рецепторов имеет высокую степень гомологии с к-опиоидными рецепторами [97, 100, 101]. Другие опиоидные лиганды не способны активировать orphan-рецепторы, не считая нескольких исключений - это динорфин А, налоксон-бензоилгидразон и лофентанил.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что многие опиоидные пептиды, взаимодействующие с классическими опиоидными рецепторами, связываются также с рецепторами неопиоидной природы. На данном этапе исследований, достоверно установлено, что у опиоидных пептидов [Ме^энкефалина, ВАМ22, ноцицептина, эндоморфинов-1 и -2 существуют собственные неопиоидные рецепторы.

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ