Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время все большее внимание привлекают короткие пептиды, аминокислотные последовательности которых состоят только из остатков глицина и пролина. Было обнаружено, что такие пептиды, получившие название глипролины, образуются в организме в результате внутри- и экстраклеточного катаболизма коллагена, эластина и родственных белков, а также в процессе протеолитического расщепления белков, поступающих с пищей (Ашмарин И.П., 2002). В настоящее время также получены различные синтетические аналоги этих природных пептидов. Глипролины обладают рядом биологических активностей, представляющих большой практический интерес. В частности, они влияют на систему свертывания крови, модулируют работу иммунной и нервной систем, обладают противоязвенным действием (Гудашева Т.А., 1999; Samonina G.E., 2000; Пасторова В.Е., 2003).
Создан также целый ряд комбинированных пептидов путем сочленения биологически активных фрагментов пептидов/белков и коротких пептидов-глипролинов. Образующиеся в результате пептиды, как правило, обладают высокой устойчивостью к протеазам и сохраняют активности предшественников. Одним из таких пептидов является семакс - AKiT(4-7)-Pro-Gly-Pro (Ашмарин И.П., 2001). Установлено, что семакс обладает ярко выраженным ноотропным и нейропротективным действием. Созданные на основе семакса препараты применяются для лечения последствий гипоксии и ишемии головного мозга, инсультов и черепно-мозговых травм.
В настоящее время механизмы действия глипролинов и их мишени мало изучены. Важной задачей также является создание синтетических аналогов глипролинов с высокой стабильностью, эффективностью и селективностью действия. В связи с этим актуальным представляется проведение структурно-функциональных исследований глипролинов и их синтетических аналогов на модельных системах. Такие исследования целесообразно проводить на моделях in vitro с использованием клеточных культур.
Ранее было показано, что пептид Pro-Gly-Pro оказывал цитопротективное действие на нейронально дифференцированные клетки феохромоцитомы крысы PC 12 при окислительном стрессе (ОС ) (Сафарова Э.Р., 2003), а также препятствовал развитию отсроченной Са -дизрегуляции, индуцированной глутаминовой кислотой (Сторожевых
1 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: АТФБК - и-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота, АТФБ - и-азидо-тетрафторбензоил, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ОС - окислительный стресс, ТФМАД -(трифторметил)арилдиазирин, DCC - дициклокарбодиимид, DMF - N,N-диметилформамид, НОВТ - гидроксибензотриазол, HOSu - JV-гидроксисукцинимид, TEA - триэтиламин, THF - тетрагидрофуран.
Т.П., 2007). Эти данные дают основание рассматривать глипролины в качестве потенциальных нейропротекторов. Однако систематических исследований нейропротективных свойств глипролинов ранее не проводилось.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было выявление характерных особенностей строения коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов, проявляющих нейропротективное действие на моделях повреждения нейронов in vitro, а также получение фотоаффинных зондов, пригодных для поиска специфических мишеней таких пептидов.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культивируемых недифференцированных и нейронально дифференцированных клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и фибробластов из эмбрионов крысы Rat-2 в условиях окислительного стресса.
Исследовать зависимость цитопротективной активности ряда синтетических глипролинов от их структуры.
Исследовать связывание радиоактивномеченных пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с культивируемыми клетками PC 12.
Получить и охарактеризовать фотоактивные арилазидные и диазириновые производные Pro-Gly-Pro и семакса.
Сравнить биологические активности Pro-Gly-Pro, семакса и их фотоактивных производных на клеточной модели окислительного стресса.
Научная новизна и приктическая значимость работы. Выполненная работа существенно расширяет имеющиеся сведения о глипролинах как потенциальных нейропротекторах. Получены новые сведения о взаимосвязи между структурой коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов и их биологической активностью. Показано, что эндогенные пептиды Pro-Gly-Pro и іУ-ацетил-Рго-ОІу-Рго в условиях ОС оказывают цитопротективное действие на перевиваемые культуры клеток крысы вне зависимости от их происхождения. Установлено, что наличие С-концевой последовательности Gly-Pro является необходимым условием для проявления цитопротективного действия коротких синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов на культуру клеток PC 12 в условиях ОС. Впервые получены фотоактивные производные пептидов Pro-Gly-Pro и семакса. Показано, что по своим фотохимическим и биологическим свойствам синтезированные фотоактивные соединения и их радиоактивномеченные аналоги могут быть использованы в качестве зондов для поиска мишеней глипролинов.
Апробация диссертации. По результатам работы опубликовано две статьи в научных рецензируемых журналах. Материалы исследования были представлены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006, 2008), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 30-ом Европейском пептидном симпозиуме (Хельсинки, 2008), Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 12-ой Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008), и на семинаре Отдела химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, содержит 38 рисунков, 3 схемы и 13 таблиц. Список литературы включает 138 ссылок.
