Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотосинтетическое окисление воды происходит в фотосистеме 2 (ФС-2) оксигенных организмов (высших и низших растений, цианобактерий). Пигмент-белковый комплекс ФС-2, погружённый в тилакоидную мембрану, состоит из трёх структурно-функциональных блоков: свето-собирающей антенны, фотохимического реакционного центра (РЦ) (в котором происходит фоторазделение зарядов с генерацией катион-радикала первичного донора электрона, хлорофилла П680+) и водоокисляющего комплекса (ВОК). В состав водоокисляющего комплекса входят: неорганическое ядро, состоящее из ионов Mn и Ca, и три «внешних» водорастворимых белка. У высших растений это белки с молекулярной массой 33 (PsbO), 24 (PsbP) и 17 кДа (PsbQ). Последовательное четырёхкратное одноэлектронное окисление ионов Mn в ВОК реакционным центром приводит к окислению двух молекул воды до кислорода с освобождением четырёх протонов:
2H2O - 4е - 4H+^O2t Скорость этой реакции определяется не только накоплением положительных окислительно-восстановительных эквивалентов, но и скоростью удаления продуктов реакции (протонов) [Haumann et al, 2005]. Известно, что ионы бикарбоната (БК), с pKa в области физиологических рН, необходимы для максимальной фотосинтетической активности на акцепторной и донорной стороне ФС-2 [Wydrzynski and Govindjee, 1975; Klimov and Baranov, 2001; van Rensen and Klimov, 2005; McConnell et al., 2012]. Ион бикарбоната на акцепторной стороне способствует протонированию Qb, а на донорной стороне участвует в сборке, стабилизации и функционировании водоокисляющего комплекса [van Rensen and Klimov, 2005]. Было высказано предположение о том, что для поддержания и регулирования содержания БК в ФС-2 необходима ассоциированная с ней карбоангидраза (КА) - фермент, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа [Stemler, 1997; Moskvin et al., 2004]:
H2O+CO2^H2CO3^HCO3-+H+^CO32-+2H+ Ранее было показано, что ФС-2 обладает карбоангидразной активностью (КА-активностью) [Stemler, 1986; Moskvin et al., 1999, 2004; Пронина с соавт., 2002; Khristin et al., 2004; Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007; McConnell et al., 2007], но до настоящего времени не решен вопрос о носителе КА-активности в ФС-2 высших растений, и о возможной роли КА-активности в функционировании ФС-2.
В некоторых публикациях было показано, что препарат ФС-2, у которого удалены три внешних белка ВОК (PsbO, PsbP и PsbQ) обладает незначительной КА-активностью [Dai et al., 2001; McConnell et al., 2007]. С использованием другого экспериментального подхода было показано наличие двух носителей КА-активности в препаратах ФС-2, один из которых ассоциирован с «ядерным» комплексом, а другой относится к «фракции низкомолекулярных белков» [Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007]. Однако, эти работы не дают ответа на вопрос о том, какие именно белки ФС-2 проявляют КА-активность. Также высказывалось предположение о том, что сам Mn-содержащий водоокисляющий комплекс ФС-2 может обладать КА- активностью [Lu and Stemler, 2007].
Предполагается, что в ФС-2 одним из источников КА-активности мог бы быть так называемый Mn-стабилизирующий белок с молекулярной массой 33 кДа (белок PsbO) [Lu et al., 2005; Lu and Stemler, 2007]. Есть данные о том, что КА-активность белка PsbO зависит от присутствия ионов Мп [Lu and Stemler, 2007]. Белок PsbO не имеет гомологии в аминокислотной последовательности ни с одной из известных карбоангидраз [Lu and Stemler, 2002] и в других работах [Пронина с соавт., 2002; McConnell et al., 2007] было показано, что PsbO не обладает КА-активностью. Таким образом, до сих пор не получено ясных данных об ассоциированной с ФС-2 высших растений карбоангидразе.
Известен только один фотосинтезирующий организм - зелёная одноклеточная водоросль Chlamydomonas reinhardtii, в клетках которого обнаружена КА (названная Сah3), входящая в состав ФС-2 и необходимая для стабилизации и функционирования ВОК ФС-2 [Karlsson et al., 1998; Villarejo et al., 2002]. Были получены данные, свидетельствующие о том, что бикарбонат и Cah3 участвуют в акцептировании протонов в процессе фотосинтетического окисления воды [Shutova et al., 2008]. Однако, роль КА-активности ФС-2 высших растений остаётся неясной. Ранее предпринимались попытки выяснить роль КА-активности в функционировании ФС-2 высших растений [Пронина с соавт., 2002; McConnell et al., 2007]. Однако до сих пор остаются нерешёнными вопросы о природе носителей КА-активности в ФС-2 высших растений, о месте их расположения, чувствительности к ингибиторам и необходимости для фотосинтетического окисления воды, для решения которых необходимы систематические исследования. Ранее исследовалось влияние ингибиторов либо на КА-активность ФС-2 [Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007], либо на фотосинтетическую активность [Swader and Jacobson, 1972; Stemler and Jursinic, 1983], и исследования проводились на разных препаратах. В наших экспериментах исследуется влияние ингибиторов карбоангидраз как на карбоангидразную, так и на фотосинтетическую активность одного и того же препарата. Это - одно из основных преимуществ нашей работы по сравнению с предыдущими.
Цель работы. Исследование значимости карбоангидразной активности для функционирования фотосистемы 2 высших растений и выявление носителя(ей) этой активности.
В процессе исследования решались следующие задачи:
-
Сравнение действия известных ингибиторов карбоангидраз на карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2 с целью выявления возможной взаимосвязи между ними. Выявление участка ФС-2, для функционирования которого важна карбоангидразная активность.
-
Поиск эффективных ингибиторов карбоангидраз среди новых органических соединений, содержащих сульфанильные и амидные группы. Выявление, среди найденных ингибиторов, веществ, способных подавлять карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2.
-
Исследование карбоангидразной активности разных белковых компонентов, полученных из препаратов ФС-2. Сравнение свойств выявленных носителей карбоангидразной активности и известных карбоангидраз.
Научная новизна работы. Показано, что ингибитор карбоангидраз, ацетазоламид (АА), подавляет как карбоангидразную, так и кислородвыделяющую активность препаратов ФС-2 (BBY-частиц), выделенных из гороха. Впервые показано, что подавление АА фотосинтетической активности ФС-2 устраняется с помощью добавления бикарбоната или искусственных доноров электрона, что свидетельствует о необходимости КА- активности для функционирования донорной стороны ФС-2.
Выявлены новые ингибиторы карбоангидраз, эффективно подавляющие карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС-2.
Впервые показано, что белки PsbO, PsbP и PsbQ проявляют карбоангидразоподобную активность (КП-активность), на которую не действуют классические ингибиторы карбоангидраз, тогда как пигмент- белковый комплекс ФС-2, лишенный этих белков, проявляет КА-активность, чувствительную к действию ингибиторов карбоангидраз.
Обнаружено, что КП-активность фракции белков PsbP и PsbQ возрастает в присутствии Mn2+. Другие двухвалентные катионы, такие как Mg2+, Ca2+, а также Zn2+ (основной неорганический кофактор карбоангидраз) не увеличивают, а даже подавляют КП-активность фракции белков PsbP и PsbQ, что свидетельствует о специфичности Mn в индуцировании КП-активности
этих белков. В то же время, на изолированных очищенных белках PsbP и PsbQ
2+
впервые показано, что в присутствии Mn возрастает КП-активность только PsbP. Активируемая ионами
Mn2+ КП
-активность белка PsbP полностью подавляется ионами Mg . Это свидетельствует о специфичности действия Mn на КП-активность белка PsbP.
Показано, что белок PsbO, очищенный от металлов, проявляет КП- активность только в присутствии экзогенного Mn2+. Выявлено, что в присутствии дитиотрейтола, разрушающего дисульфидную связь в PsbO, белок теряет способность проявлять Mn-индуцируемую КП-активность, это свидетельствует о необходимости нативной конформации белка PsbO для проявления КП-активности. Выявленные свойства КП-активности белков PsbO и PsbP (необходимость присутствия Mn , нечувствительность к классическим ингибиторам карбоангидраз) позволяют предположить, что PsbO и PsbP могут представлять собой новый класс Mn-зависимых карбоангидраз.
Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о механизме функционирования водоокисляющего комплекса ФС-2 и могут быть использованы при создании искусственных систем окисления воды, найдут применение в фундаментальных исследованиях в области физиологии растений, биохимии и биофизики фотосинтеза.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X, XIV и XV международной Пущинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2006, 2010, 2011); XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009); XV международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, 2010); Международной конференции «Исследование фотосинтеза в интересах устойчивого развития» (Баку, 2011); XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012); Международной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012).
Личное участие автора. Большая часть результатов получена автором самостоятельно. Автором проводились биохимические и биофизические исследования, осуществлялся анализ литературных данных, формулировались выводы. Выделения препаратов светособирающего комплекса ФС-2, реакционных центров ФС-2, субмембранных препаратов фотосистемы 1 (ФС- 1), белков PsbO, PsbP и PsbQ, анализ содержания двухвалентных металлов в полученных препаратах автором проводились в совместной работе с к.б.н. М.С. Христиным, к.б.н. О.В. Побегуц, Т.Н. Смоловой, В.В. Терентьевым, к.б.н. К.Г. Тихоновым и к.б.н. С.К. Жармухамедовым. Органические соединения, содержащие сульфанильные и амидные группы, были получены от коллег из Химического департамента университета Гази (Gazi University, город Анкара, Турция) в рамках совместных исследований.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них: 1 в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 8 в тезисах конференций.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 116 страницах текста и включает 4 таблицы и 18 рисунков. Список литературы содержит 129 источников.
