Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние двадцать лет повсеместно проводится исследование внутриклеточных механизмов, ведущих к повреждению и гибели нейронов при разных патологиях и, в частности, при токсическом действии аммиака. Аммиак является важным клеточным метаболитом, участником не менее чем 170 известных ферментативных реакций. Безопасный для организма уровень аммиака обеспечивается циклом мочевины, полный набор ферментов которого локализован исключительно в печени у животных всех видов. В остальных тканях основная роль в обмене этого метаболита принадлежит другим ферментным системам. Избыточное поступление аммиака, равно как и его усиленное образование в результате нарушения ферментных систем утилизации, могут вызвать гипераммонемию - патологическое повышение концентрации аммиака в крови. Токсичность этого соединения была предсказана и в дальнейшем экспериментально подтверждена русским физиологом И. П. Павловым в конце XIX века (Наші et al., 1893). Однако проблемы, связанные с повышенным содержанием аммиака в крови, остаются и сегодня. Гипераммонемия наблюдается при болезнях Альцгеймера, Паркинсона, эпилепсии, радиационном повреждении, алкоголизме, раковом перерождении тканей (Косенко, 1999). Известно, что болезни сердца, связанные с гипоксией, ишемией/реперфузией и инфарктами миокарда, сопровождаются значительным повышением уровня аммиака в крови и кардиомиоцитах. Однако роль аммиака в развитии патологических процессов изучена слабо и не учитывается в практической медицине.
В последнее время при исследовании механизмов клеточной гибели в мозге особое внимание уделяется возбуждающим нейромедиаторам и глутаматным рецепторам. Повышенная концентрация аммиака усиливает выход глутамата в межклеточное пространство. Избыточный уровень внеклеточного нейромедиатора приводит к гиперактивации глутаматных рецепторов, в частности, N-Menui-D-acnapTaTHbix (NMDA) рецепторов. При этом происходит открывание ионного канала рецептора, проницаемого для кальция и натрия, усиленный поток которых в клетку запускает новый механизм патологических реакций и приводит к повреждению, дегенерации и гибели нейронов. Возбудительные аминокислоты становятся экситотоксинами только при нарушении энергетического обмена. Изменение функций митохондрий может быть причиной развития дегенеративных процессов в клетках сердца и мозга и ухудшения функционирования этих органов при гипераммонемии.
Гипотеза об интенсификации перекисных процессов при нарушении энергетического обмена и последующей неотвратимой гибели клетки при гипераммонемии получила многократное подтверждение на препаратах
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ| БИБЛИОТЕКА I
1 *3$ЩІ/\
печени (Hindfelt, 1983; Kosenko, 1999; Kosenko et al, 1991). Имеется ли подобная внутриклеточная сигнализация - от нарушения энергетического обмена, через окислительный стресс к предстоящей гибели клеток мозга и сердца - при токсическом действии аммиака, выяснено не полностью (Kosenko, 1999). Практически ничего не известно о действии аммиака на функциональное состояние сердца.
Проблема токсичности аммиака становится актуальной как для познания фундаментальных основ клеточной гибели, так и для практической медицины и ветеринарии. В настоящей работе проведено исследование внутриклеточных механизмов, ведущих к развитию патологии и к гибели нейронов и кардиомиоцитов при повышении концентрации аммиака, и выяснение роли энергетического обмена и глутаматных рецепторов в токсичности аммиака.
Цель исследования заключается в исследовании роли глутаматных рецепторов и энергетического обмена в токсическом действии аммиака. Задачи исследования:
исследовать влияние аммиачной интоксикации на ферменты, ответственные за детоксикацию аммиака, в мозге и сердце;
изучить влияние острой гипераммонемии на основные энергетические показатели в митохондриях мозга и сердца;
оценить вклад разных источников - митохондриальной дыхательной цепи, цитоплазматических ксантиноксидазы и альдегидоксидазы - в образование супероксидного радикала и перекиси водорода при активации NMDA-рецепторов в мозге вводимым аммиаком;
изучить влияние аммиачной интоксикации на антиокислительные ферменты в мозге и сердце;
исследовать влияние индуцируемой аммиаком гиперактивации NMDA-рецепторов на метаболизм и продукцию супероксидного радикала в ядрах мозга крыс.
Научная новизна работы.
Установлена неизвестная ранее закономерность, по которой токсическая доза аммиака повышает активность глутаминсинтетазы в мозге, но не в сердце. Острая гипераммонемия не изменяет активность глутаматдегидрогеназы, аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в изучаемых органах.
Острая гипераммонемия вызывает нарушение основных показателей окислительного фосфорилирования в несинаптических митохондриях мозга; в митохондриях сердца изменяется только скорость окислительного фосфорилирования.
Выявлен ряд митохондриальных, цитоплазматических и ядерных источников активных кислородных метаболитов и оценена их важность в развитии окислительного стресса в мозге при
_ гипераммонемии.
Гиперактивация NMDA-рецепторов, вызванная аммиаком, приводит к увеличению скорости образования супероксидного радикала и снижению активности антиокислительных ферментов в мозге; активность ферментов-антиоксидантов в сердце повышается при гипераммонемии.
Скорость образования перекиси водорода в сердце при гипераммонемии увеличивается, тогда как в мозге она снижается.
Развитие индуцируемого аммиаком окислительного стресса в мозге предотвращается нитроаргинином и МК-801, что подтверждает участие NO-радикала и NMDA-рецепторов в токсическом действии аммиака и открывает новые возможности в регуляции антиокислительного состояния клетки.
Практическая ценность работы заключается в обнаружении новых клеточных механизмов токсического действия аммиака, а также в поиске путей и способов лечения при различных заболеваниях, связанных с гипераммонемией. Получены количественные данные, до настоящего времени отсутствующие в литературе, по каталитической активности и кинетическим свойствам ксантиноксидазы, альдегидоксидазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, каталазы, поли(АДФ-рибозо)полимеразы, НАД-синтетазы, НАД-гликогидролазы, скоростям образования перекиси водорода и супероксидного аниона-радикала в отделах клетки (цитоплазме, митохондриях, ядрах). Разработаны, применены и описаны в публикациях новые методики выделения несинаптических митохондрий мозга, ядер из клеток мозга, определения активности ряда ферментов в этих препаратах. Изучена и выявлена роль нарушений в энергетическом обмене и активации NMDA-рецепторов в токсическом действии аммиака в мозге и сердце. Полученный объем информации расширяет представления о внутриклеточных процессах и их регуляции, открывает возможность управления ими. Данные могут быть применены в разработке новых подходов в профилактике, диагностике и терапии нейродегенеративных и многих иных болезней. Основные положения, выносимые на защиту:
Аммиак является мощным регулятором окислительного и энергетического обмена в нейронах и мышечных клетках сердца.
Ряд митохондриальных и цитоплазматических источников активных кислородных метаболитов вносит вклад в развитие окислительного стресса в мозге; оценен этот вклад при гипераммонемии.
Продукция перекиси водорода и активность ферментов-антиоксидантов в сердце повышаются, а в мозге - снижаются в условиях гипераммонемии.
Развитие индуцируемого аммиаком окислительного стресса в мозге предотвращается введением нитроаргинина и МК-801, что подтверждает участие NO-радикала и NMDA-рецепторов в
токсическом действии аммиака и открывает новые возможности в регуляции антиокислительного состояния клетки.
Летальная доза аммиака, вводимая внутрибрюшинно, не является токсичной для сердца. При сравнении с мозгом сердце является более адаптивным органом.
Разработаны новые методики выделения несинаптических митохондрий мозга, очищенных ядер мозга и измерения активности ряда ферментов и процессов в этих препаратах.
Апробация. Основные материалы и положения диссертационной работы докладывались, обсуждались и утверждены на совместном заседании секций Ученого совета ИТЭБ РАН «Мышечное сокращение и немышечные формы подвижности» и «Биоэнергетика и активные формы кислорода в регуляции жизнедеятельности» (Выписка из протокола от 22 октября 2003 г). Результаты исследования были представлены на: VII Российский национальный конгресс (Москва, 2000 г); 2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle/Saale, 2000; Всерос. раб. совегд. (Пущино, 2001 г); Конф. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001 и< 2002 г); 6-ю Путинскую школу-конф. молодых ученых (Пущино, 2002 г); П Всерос. конф. "Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)" (Москва, 2002 г); I Всерос. конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002 г); Конф. «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2002 и 2003 г); 10 междунар. конф. «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2003 г); Междунар. конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из обзора литературы, методической части, описания результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 101 страницах, содержит 19 рисунков и 16 таблиц.
