Введение к работе
Актуальность работы. Гепатоклеточная карцинома стоит на третьем месте среди причин смертности от рака во всем мире (Shariff et al., 2009). Известно, что гепатоканцерогенез является многоступенчатым процессом, который включает в себя хорошо описанные стадии инициации, промоции и прогрессии опухолей. Однако, молекулярные события, происходящие на этих стадиях, пока еще мало изучены. Для исследования механизмов, лежащих в основе разных этапов развития гепатоклеточной карциномы, применяется стандартный подход, заключающийся в использовании экспериментальных моделей грызунов, у которых осуществляют инициацию опухолей химическими соединениями - инициаторами канцерогенеза с последующей промоцией опухолей с помощью других агентов (промоторов канцерогенеза) (Gold et al., 2001; Heindryckx et al., 2009).
0/?^о-аминоазотолуол (OAT) вызывает опухоли печени у мышей ряда линий, например СВА, SWR, DBA/2, А/Не, DD и C57BL, выступая в качестве и инициатора и промотора (Каледин, Захарова, 1984). ОАТ относится к классу аминоазокрасителей, широко используемых в легкой промышленности, в фармацевтике, и производство которых по всему миру может достигать порядка 0,5 миллионов тонн в год (National Toxicology Program, 2002). За последние несколько десятилетий получено большое количество данных о канцерогенной активности ряда аминоазокрасителей. В частности, ОАТ был оценен Международным агентством по изучению рака (IARC) как возможный канцероген (класса 2В) для человека (IARC, 1975). Механизм действия этого соединения пока мало изучен. Ранее в лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН была обнаружена тесная связь между опухолеиндуцирующим действием ОАТ и увеличением ДНК-связывающей активности конститутивного рецептора андростанов (CAR) в печени мышей. Было показано также, что ОАТ способен конкурировать с известным лигандом CAR - андростенолом за связывание с белками цитозоля клеток печени мышей (Пахарукова и др., 2007). Однако оставалось неисследованным влияние ОАТ на трансактиваторные свойства CAR и на экспрессию его генов-мишеней, для чего требовалось проведение экспериментов in vitro в CAR-репортерной системе и in vivo с использованием CAR-нокаутных мышей.
Одним из широко используемых промоторов опухолей печени у грызунов является фенобарбитал, применяемый в фармацевтике как антиконвульсант, а также как успокаивающее и спазмолитическое средство. Известной моделью для изучения промоции опухолей фенобарбиталом являются линии мышей, чувствительных (СЗН/Не) и относительно устойчивых (C57BL/6J и CC57BR/Mv) к действию данного соединения. Хотя известно, что посредником в промоции опухолей печени
под воздействием фенобарбитала у мышей является CAR (Yamamoto et al., 2004), сравнительный же анализ влияния данного соединения на активность этого транскрипционного фактора у устойчивых и чувствительных линий до сих пор не проводился. Не проводился также сравнительный анализ действия фенобарбитала на экспересиию генов-мишеней CAR, продукты которых могут способствовать развитию опухолей. Среди этих генов особый интерес представляют гены, связанные с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, а также гены, кодирующие ферменты катаболизма тиреоидных гормонов, поскольку известно, что фенобарбитал снижает уровень этих гормонов у чувствительных, но не устойчивых линий мышей (Pakharukova et ah, 2010).
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение роли конститутивного рецептора андростанов (CAR) в механизмах опухолеиндуцирующего действия ор^оаминоазотолуола (ОАТ) и опухолепромотирующего эффекта фенобарбитала (ФБ). Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние ОАТ на трансактивационную активность CAR мыши (mCAR) в его репортерной системе (клетках HepG2, котрансфецированных плазмидой, экспрессирующей mCAR, и репортерной плазмидой, содержащей репортерный ген под контролем CAR-зависимого элемента).
-
Оценить изменение экспрессии под воздействием ОАТ ряда генов-мишеней CAR, включая (1) гены I фазы метаболизма ксенобиотиков -Сур2Ы0, Сур2с29, СурЗаІІ и NADPH CYP450 oxidoreductase; (2) гены II фазы метаболизма ксенобиотиков - Ugtlal и транспортеров - Мгр2 и Мгр4; а также (3) гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и пролиферации - Mdm2, CyclinDl и с-Мус, у мышей дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами.
-
Оценить статус пролиферации гепатоцитов у мышей дикого типа по сравнению с CAR-нокаутными мышами как на ранних, так и на поздних сроках после введения ОАТ.
-
Изучить влияние фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR в печени мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии СЗН/Не и устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/Mv.
-
Изучить влияние фенобарбитала на уровень мРНК генов-мишеней CAR Sult2al, Ugtlal и Mdm2 в печени мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии СЗН/Не и устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/MV.
Научная новизна. В экспериментах in vitro впервые выявлено усиление трансактивационной активности CAR мыши под действием ОАТ, гепатокацерогенного для мышей, но не З'-МеДАБ, неканцерогенного для этих животных. Данные по усилению трансактиваторной способности
mCAR in vitro согласуются с результатами экспериментов по введению ОАТ и З'-МеДАБ животным, у которых было показано увеличение только под действием ОАТ экспрессии ряда генов-мишеней CAR, участвующих как в регуляции метаболизма ксенобиотиков (гены ферментов метаболизма и транспортеров ксенобиотиков), так и в пролиферативных процессах клеток печени (с-Мус). Роль CAR в этих процессах доказана с использованием нокаутных мышей, у которых ОАТ не влиял на уровень экспрессии данных генов. Впервые получены данные об участии CAR в пролиферативных процессах в печени, запускаемых ОАТ.
Впервые показано, что известный опухолевый промотор фенобарбитал увеличивает ДНК-связывающую активность CAR в печени чувствительных мышей СЗН/Не, но не устойчивых C57BL/6J и CC57BR/Mv. Такой эффект оказался сопряженным с действием фенобарбитала на экспрессию генов-мишеней CAR, продукты которых могут способствовать развитию опухолей. А именно, выявлено, что только у мышей чувствительной линии под действием фенобарбитала происходит значительное усиление экспрессии Sult2al - основного фермента катаболизма тиреоидных гормонов (выполняющих опухолесупрессорную функцию) и Mdm2 - важного регулятора пролиферации и апоптоза.
Теоретическая и практическая значимость.
Настоящая работа вносит существенный вклад в понимание молекулярных механизмов гепатоканцерогенеза. Показано, что важную роль в этих механизмах играет конститутивный рецептор андростанов -CAR. Полученные данные дополняют современные представления о механизмах инициации и промоции опухолей печени негенотоксическими канцерогенами, а также способствуют выяснению молекулярно-генетических основ предрасположенности организма к возникновению химически индуцированных опухолей печени.
Информацию об активации CAR, полученную в тестах in vitro, можно использовать при выяснении показателей биологической активности, токсичности и потенциальной канцерогенности разнообразных веществ. Модель с использованием CAR-нокаутных мышей может быть актуальной для выяснения механизма действия других соединений - активаторов CAR. Кроме того, эти данные могут послужить стимулом для изучения механизмов отсроченного канцерогенного действия химических соединений, что имеет большое значение при оценке рисков для человека. Разработанный подход может быть использован как диагностический инструмент для выявления предрасположенности животных к промоции опухолей печени химическими соединениями - активаторами CAR.
В целом, решение фундаментальных вопросов о роли CAR в канцерогенных эффектах химических соединений (как инициаторов, так и
промоторов опухолей) может стать ступенью к решению практических задач по установлению мишеней для лекарственных средств, направленных на борьбу с развитием рака печени.
Положения, выносимые на защиту.
-
Гепатокагцерогенный для мышей аминоазокраситель орто-аминоазотолуол (ОАТ) является активатором транскрипционного фактора CAR. Активация CAR под действием ОАТ приводит к усилению экспрессии генов Сур2Ы0, Сур2с29, СурЗаП, Ugtlal, Мгр2, Мгр4 и с-Мус в печени мышей.
-
CAR необходим для реализации эффектов ОАТ в активации пролиферации гепатоцитов у мышей.
-
Межлинейные различия в опухолепромотирующем действии фенобарбитала связаны с активацией CAR и увеличением экспрессии в печени его генов-мишеней Sult2al и Mdm2 у мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии СЗН/Не, но не у мышей устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/MV.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II Съезде общества клеточной биологии (Цитология. 2007. Т. 49. С. 781-782.), а также на международной конференции FASEB Summer Research Conference "Liver Growth, Development and Desease" (США, шт. Колорадо, Сноумасс, 3-8 августа 2008). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора. Основные результаты настоящего исследования
получены автором самостоятельно. Эксперименты по
иммуногистохимическому окрашиванию срезов печени проводились совместно с Ph.D СМ. Куринной.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (236 наименований). Работа изложена на 147 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 19 рисунков.
