Введение к работе
Актуальность проблемы. Фенотип высших организмов формируется в результате сложных взаимодействий многих тысяч генов в онтогенезе. У позвоночных и, в частности, у млекопитающих ключевую роль играют взаимодействия эффектов неаллельных генов, работающих в разных клеточных системах. Сегодня наиболее популярной концепцией, позволяющей систематизировать взаимодействующие гены в онтогенезе, является концепция генных регуляторных сетей (или сигнальных путей) -абстрактных систем, состоящих из генов, кодирующих белки-лиганды (активаторы и ингибиторы), их рецепторы, посредники и факторы транскрипции, непосредственно связывающиеся с ДНК и регулирующие транскрипцию генов-эффекторов. Результатом слаженной работы генной регуляторной сети является протекание того или иного процесса в ходе онтогенеза. Изучение механизмов работы генных регуляторных сетей с одной стороны представляет большой интерес для понимания генетического контроля развития, а с другой открывает широкие возможности для направленного модулирования транскрипционной активности конкретных генов, что находит свое применение в лечении заболеваний различной этиологии, в том числе и онкологических.
Изучение генетических основ регуляции развития шерстного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития. Оно имеет большое значение в контексте фундаментальной науки, а также в прикладном аспекте важно для современной дерматологии и косметической медицины. С точки зрения биологии развития как фундаментальной науки, кожа млекопитающих и волосяной фолликул (ВФ) представляются уникальными объектами исследований, так как кожа в целом является одним из интенсивно обновляемых органов, а морфогенез ВФ продолжается в ходе всего индивидуального развития организма. Поэтому генные регуляторные сети, контролирующие пути дифференцировки и миграции клеток, представлены в этих органах вне зависимости от стадии развития или возраста индивида. Среди генных регуляторных сетей, функционирующих в коже млекопитающих, особое место занимают сети, индуцируемые белковыми молекулами семейств WNT и BMP. Нарушения работы этих сетей приводят к различным аномалиям в развитии кожи и ВФ, от недоразвития определенных компонентов фолликулов до развития злокачественных новообразований.
Несмотря на то, что в общем виде молекулярные механизмы эмбрионального и постнатального морфогенеза ВФ у млекопитающих (на примере мыши) описаны, существуют десятки генов, мутантные аллели которых в гомозиготном состоянии приводят к нарушениям развития шерстного покрова, а роль в контексте молекулярного контроля физиологии ВФ не установлена. Одним из таких генов является ген Нг, мутантные аллели которого в гомозиготе приводят к дезинтеграции ВФ и полному выпадению шерсти после завершения роста волос первой генерации. Известные данные разных авторов подводят к мысли о том, что продукт нормального аллеля этого гена является важным модулятором активности генных регуляторных сетей, участвующих в физиологии ВФ у млекопитающих. Однако, хотя и существует ряд гипотетических молекулярных мишеней белка HR, конкретные сигнальные пути, затрагиваемые в случае мутации в гене Нг, точно не известны. Результаты научных работ на эту тему позволяют выстроить ряд гипотез о существовании связи между геном Нг и WNT- и BMP-зависимыми генными регуляторными сетями в ВФ. В частности, показана отрицательная корреляция между уровнями экспрессии белка HR и SOSTDC1 в ВФ мыши (Beaudoin et al., 2005), а также регуляторная функция белка SOSTDC1 в отношении работы WNT- (Itasaki et al., 2003) и BMP-зависимых генных сетей (Laurikkala et al., 2003).
Так как ген Нг кодирует белок, участвующий в регуляции транскрипции других генов, эффекты, наблюдаемые у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, могут быть зарегистрированы методами оценки транскрипционной активности генов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в реальном времени (ПЦР-РВ). В сочетании с методом обратной транскрипции (ОТ), ПЦР-РВ позволяет достаточно точно измерить количество транскриптов интересующего гена в пробе (Wong, Medrano, 2005).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение молекулярно-генетических механизмов, при помощи которых ген Нг вовлекается в контроль морфогенетического цикла ВФ у мыши. Выполнение исследования предполагало решение следующих задач:
1) охарактеризовать на молекулярном уровне мутантный аллель гена Нг у животных, использованных в работе;
сопоставить динамику экспрессии BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в период развития алопеции с динамикой экспрессии этих же генов в коже фенотипически нормальных сибсов-гетерозигот соответствующего возраста;
сопоставить компетенцию клеток ВФ рандомбредных мышей и клеток производных ВФ мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в отношении травматического повреждения кожи на модели ожога Ша степени субдермальной глубины и вырезанной раны;
исследовать характер влияния экзогенного модулятора ВМР-зависимой генной сети NOGGIN на скорость роста волос у нормальных мышей линии СВА.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые на молекулярном уровне охарактеризован аллель Hrhr -мутантный аллель гена Нг, поддерживающийся в гомозиготной линии в отечественных питомниках лабораторных животных. Впервые показано, что у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю Нг, в составе производных ВФ сохраняются клетки, способные к участию в репаративной регенерации эпидермиса в случае ожоговой и вырезанной раны. С помощью метода ОТ и ПЦР-РВ изучена и продемонстрирована корреляция между изменениями уровней экспрессии WNT- и BMP-зависимых генов в коже мышей. Показано, что угнетение работы BMP-зависимой генной сети в коже мышей путем непосредственного введения белка NOGGIN подавляет рост волос. Показано, что экспрессия гена Нг необходима для своевременного угнетения работы WNT-зависимой генной сети в коже мышей. Полученные данные указали на ключевую роль гена Нг во взаимодействии WNT- и BMP-зависимых генных регуляторных сетей в ВФ мыши и позволили определить место этого гена в генной сети, описывающей эти взаимодействия.
Изучение координированной экспрессии конкретных генов -участников BMP- и WNT-зависимых генных сетей в контексте морфогенеза ВФ вносит существенный вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе нарушений роста волоса у млекопитающих. Новые данные о роли гена Нг в работе этих генных сетей позволяют
рассматривать его как потенциальную терапевтическую мишень в разработке лекарственных средств, направленных на лечение гиперпластических заболеваний кожи и заболеваний волос у человека.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 3-й Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (27 -31 июля 2007 г., Москва, Россия), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2008» (26 - 27 ноября 2008 г., Саратов, Россия), III съезде Российского общества патологоанатомов (26 - 30 мая 2009 г., Самара, Россия), Международной конференции «World Congress Gene 2009» (1-7 декабря 2009 г., Фошан, Китай), на межлабораторном семинаре «Генетика животных» ИОГен РАН 28 декабря 2009 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано и сдано в печать 6 научных работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, состоящий из 3 глав, экспериментальная часть, включающая главу «Материалы и методы», 4 главы, посвященные собственным исследованиям, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список литературы и приложения. Список литературы включает 184 источника, из которых 2 отечественных и 182 иностранных авторов. В работе содержится 11 таблиц (из которых 5 вынесены в приложения) и 27 рисунков.
