Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 6
Сравнительная генетическая радиочувствительность половых клеток, находящихся на разных стадиях сперматогенеза 16
Влияние ионизирующих излучений на пронуклеарную стадию зиготы 18
Радиочувствительность первичных половых клеток эмбрионов 22
Действие ионизирующих излучений на гоновдты новорожденных самцов- мышей 29
III. Материал и методы исследования 35
IV. Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение 42
1. Генетическая радиочувствительность пронуклеусов 43
2. Мутагенное действие ионизирующих излучений на го-ноцигы и сперматогонии самцов мыши 53
2.1. Генетическое действие ионизирующих излучений на гоноциты эмбрионов 53
2.2. Генетическая радиочувствительность гоноцитов новорожденных самцов 66
2.3. Генетический эффект ионизирующего излучения в сперматогониях половозрелых самцов 79
3. Сравнение генетической радиочувствительности гоно цитов эмбрионов, новорожденных и сперматогониев половозрелых самцов 85
Заключение 105
Выводы
Список литературы 112
- Сравнительная генетическая радиочувствительность половых клеток, находящихся на разных стадиях сперматогенеза
- Радиочувствительность первичных половых клеток эмбрионов
- Генетическая радиочувствительность пронуклеусов
- Генетическое действие ионизирующих излучений на гоноциты эмбрионов
Сравнительная генетическая радиочувствительность половых клеток, находящихся на разных стадиях сперматогенеза
Сравнительный анализ результатов," полученных при изучении последствий облучения половых клеток мыши на разных стадиях сперматогенеза показал, что генетическая радиочувствительность клеток на премейотических стадиях ниже, чем на постмейотических. Выход доминантных летальных мутаций в сперматогониях на I Р на I клетку составил ОДхІСГ3 (по постимплантационной гибели эмбрионов), что в 10-15 раз ниже частоты доминантных леталей, индуцированных в спермиях (1,0x10""), сперматидах и сперматоцитах (1,5x10 ) (Померанцева, Рамайя, 1969), При этом характер дозовой зависимости выхода мутаций, индуцированных излучением в сперматогониях, был другим, чем при облучении поздних стадий половых клеток «Оказалось, что частота возникновения мутаций (доминантные летали) в спермиях, сперматидах и сперматоцитах возрастает с увеличением дозы сверх 400 Р, в то время как в сперматогониях при повышении дозы выше 400 Р, частота доминантных летальных мутаций остается на одном уровне.
Низкий выход индуцированных излучением генетических повреждений в сперматогониях по сравнению с другими стадиями сперматогенеза показан также на дрозофиле по таким показателям, как частота транслокаций ( Catsch, Rudu , 1943 а,в), точковых мутаций и сцепленных с полом леталей (Фриц-Нигли,: 1961).
Если сравнить генетическую радиочувствительность половых клеток,1 находящихся на разных стадиях сперматогенеза, у мышей по частоте появления в первом поколении самцов, гетерозиготных и по -гранслокации, го окажется," что сперматогонии имеют самую низкую
МугабиЛЬНОСГЬ. БЫЛО ПОКазаНО ( Leonard, Deknudt , 1968), ЧТО среди потомков,1 произошедших от отцов,: у которых половые клетки были облучены на стадии сперматогониев в дозе 300 Р, не было обнаружено ни одного гетерозиготного по транслокации самца. В то же время процент самцов,; гетерозиготных по реципрокной гранслокации, произошедших от отцов, у которых в оплодотворении участвовали гаметы, облученные на стадии сперматоцитов, сперматид и спермий составил, соответственно, 6,3%, 22,0% и 5,1%. Другими авторами (Griffen, Bunker, 1967) на том же тесте показано 4-х кратное превышение генетической радиочувствительностью посгмейогических клеток (сперматоциты, сперматиды,.спермин) мутабильности сперматогониев при облучении самцов в дозе 700 Р.
Таким образом,1 анализ данных по различным типам мутаций /индуцированных в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза дрозофилы и мыши, показал,1 что премеиогические половые клегки генетически менее чувствительны к воздействию ионизирующих излучений; чем постмейотические.
Различия в генетической радиочувствительности премейотичес-ких и постмейотических стадий половых клеток можно объяснить следующими причинами: I) различие в метаболических процессах, протекающих в половых клетках в период сперматогенеза; 2) наличие герминативной селекции; 3) истинное различие в темпе мутирования; 4) различие в-вероятности репарации генетических повреждений (Шапиро, I964;! sobeis, 1966).
Как уже отмечалось выше, из всех стадий сперматогенеза, генетически наиболее радиочувствительной является стадия сперматид. Большая радиочувствительность сперматид (как это показано на дрозофиле) по сравнению с другими стадиями половых клеток связана, по-видимому, с синтезом нуклеогистона (Dass et ai., 1964 а,б; Абелева, 1966) и высоким содержанием кислорода ( Sobeis , 1965, 1966). Однако, на основании проведенных экспериментов некоторые исследователи (Абелева, Потехина, 1962) приходят к заключению, что эффект кислорода в спермагидах только в некоторой степени может являться причиной их повышенной радиочувствительности.
Следующим важным обстоятельством является существование герминативной селекции. Зародышевый отбор обусловлен тем, что половые клетки, тлеющие генетические повреждения на премейотических стадиях сперматогенеза, более подвержены селективной гибели, чем клетки не несущие хромосомные аберрации (Шапиро, 1964). Однако наличием только герминативного отбора нельзя объяснить различия в выходе видимых мутаций, аутосомных рецессивных леталей и транслокаций в половых клетках на различных стадиях сперматогенеза. Меньший выход транслокаций в сперматогониях чем в сперматозоидах/ вероятно, объясняется относительной удаленностью негомологичных хромосом в этих половых клетках, что препятствует обмену между хромосомами (Шапиро, 1964).
Таким образом, различия в частоте возникновения мутаций в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза определяются как особенностями, присущими наследственным структурам клеток, так и бИОСИНТеТИЧеСКИМИ Процессами, ПрОТеКаЮЩИМИ В НИХ ( Russell, Sayiors , 1963). Вероятно, эти особенности могут влиять на репарационные процессы, происходящие в хромосомах пораженных клеток (Шапиро, 1964).
Радиочувствительность первичных половых клеток эмбрионов
В настоящее время имеется довольно большое количество работ, посвященных вопросу радиочувствительности семенников в период их эмбрионального развития ( Rugh, 1949,1952,1958,I960,1962 а,б,с; 1963 а,б; Rugh, Jackson, 1958 а,б; Rugh et al., 1964; Rugh, Wohlframm, 1964,1965; Lengerova, Wajtiskowa , 1957; Ershoff, Brat, I960; Beaumont, . 1950,1962; Рассел, I960; Ломовская, I960; Pierce,Beais, 1964; Нуждин, Кузнецова, 1962,1965; Кузнецова,- 1963; Пилявская, 1967, 1970).
У эмбрионов млекопитающих, в частности, у мышей, начиная со второй половины пренатального периода (9-12 день - период закладки гонад), вся популяция герминативных элементов представлена первичными половыми клетками - гоноцитами (Теплякова, 1934; Clermont,Perey, 1957; Mintz, Russell, 1957; Mintz, 1958,1960; Beaumont, I960; Monesi, 1962; Erickson et al., 1963; Mandl, 1964). В течение всего позднего эмбриогенеза (до 19 дня беремен носги) гоноциты активно делятся и увеличиваются в количестве. Следует заметить, что большинство женских первичных половых клеток вследствие активной митотической пролиферации входит в профазу
МеЙОЗа И К МОМеНТУ рождения СТаНОВИТСЯ ОВОЦИТаМИ ( Beaumont, Mandl, 1962,1963; Mandl, 1963; Mandl et al., 1964). Первые спер-матогонии типа А у мышей появляются на 3-й день жизни ( Mintz, I960).
Изучение радиочувствительности первичных половых клеток особенно важно в связи с тем, что гоноциты в раннем постнатальном периоде дифференцируются в сперматогонии, за счет которых у самцов в течение всего репродуктивного периода постоянно пополняется запас зрелых половых клеток.
При изучении действия излучений на эмбрионы было установлено, что степень повреждения ткани семенников зависит не только от дозы, но и от стадии, на которой эмбрион подвергся воздействию. Наиболее радиочувствительными семенники мышей оказались в позднем утробном периоде. Так облучение в дозе 200 Р семенников эмбрионов на 16-ый день пренатального развития приводит к почти полному (96,1%) запустению тестикулярних канальцев (Нуждин, Кузнецова, 1965). Показано, что воздействие в этот срок совпадает с моментом закладки и дифференцировки тканей семенника (Ломовская,1950; Нуждин, Кузнецова, 1965). Воздействие ионизирующих излучений на половые железы эмбрионов приводит к задержке созревания гонад и к снижению количества сперматогенных клеток ( Mintz, I960; Кузнецова, 1963; Пилявская, 1967, 1970).Результатом облучения гонад в эмбриогенезе может быть также полная потеря плодовитости самцами в половозрелом возрасте. При облучении герминативной ткани семенников в критический для них период в дозе 200 Р восстановление плодовитости самцов не наблюдалось даже через 6-9 месяцев ( Rugh, Jackson, 1958 а,б; Нуждин, Кузнецова, 1965).
При дробном облучении семенников на 8-12 день эмбриогенеза (общая доза 400 Р) и на протяжении всего эмбрионального периода (суммарная доза 336 Р) число гоноцитов сокращается уже в эмбриональном периоде ( Mintz, I960; Пилявская, 1970). При двухкратном воздействии излучений на герминативную ткань семенников эмбрионов в критический период эффект поражения семенников не ослабляется, а суммируется (Нуждин, Кузнецова, 1965). Гоноциты мужского типа более радиочувствительны, чєм женские (Rugh , I960).
Сведения относительно генетической радиочувствительности половых клеток самцов и самок мышей в эмбриональный период развития, немногочисленны, и получены при изучении частоты мутаций четырех или семи определенных локусов и реципрокных транслокаций.
Изучению воздействия быстрых нейтронов на частоту возникновения мутаций 7 определенных локусов у эмбрионов мышей посвящена работа Сирля и Филипс ( Searie, Phillips, 1971). При хроническом нейтронном воздействии в дозе 108,5 рад на эмбрионы в возрасте 3,5-10 дней частоты возникновения мутаций 7 определенных локусов у самцов и самок составили 5,3x10 на локус и 6,4x10 на локус, то есть генетическая радиочувствительность эмбрионов мужского и женского пола оказалась сходной. Показано также, что при нейтронном воздействии в той же дозе частота возникновения реципрокных транслокапдй у эмбрионов составляла 1,22$. Сравнительный анализ результатов этого эксперимента (1,22$) с данными другого исследования ( searie et ai.,I969) при облучении взрослых самцов мышей (3,3$) показал, что гоноциты генетически менее радиочувствительны, чем сперматогонии.
Генетическая радиочувствительность пронуклеусов
I. Генетическая радиочувствительность пронуклеусов Как упоминалось выше, оплодотворенные самки подвергались воздействию рентгеновского излучения в дозе 0,89 Гр примерно в II часов дня. В этот период зиготы находились на ранней пронук-леарной стадии и к этому времени юоршірование мужского и женского пронуклеусов завершалось (Austin, Bishop,1957; Russell, Saylors, 1963). Если воздействие излучения приводило к возникновению ре-ципрокной транслокации в пронуклеусах, то животные, развившиеся из этих зигот, были гетерозиготными по этой аберрации.
Результаты цитологического анализа сперматоцитов самцов,подвергшихся облучению на статщи ранней зиготы, приведены в таблице I.
Как видно из этой таблицы, из 51 животного, сперматоциты 45 самцов содержали нормальное число бивалентов (20П). В числе про анализированных сперматоцитов двух других самцов было обнаружено по одной мультиваленгной конфигурации хромосом в виде "кольца" (0,08 транслокаций на 100 клеток). Не исключено, что эти реци-прокные транслокации являются результатом спонтанного мутационного процесса. Четыре самца (7,8$) оказались гетерозиготными по ре-ципрокным транслокациям. Ввиду того, что на стадии зиготы воздействию радиации подвергались мужской и женский пронуклеусы, частота реципрокных транслокаций на гамету составила 3,9$ (Фазылов, Померанцева, 1971в). Аналогичные результаты получены другими исследователями (Leonard, Deknudt,I967B). Из экспериментальных данных, приведенных в таблице I также видно, что частота метафаз с мультивалентными конфигурациями хромосом у гетерозиготных самцов значительно варьирует. Так, если частота реципрокных транслокаций в сперматоцитах самцов В I и В 2 составила соответственно 8,0 на 100 клеток и 22,0 на 100 клеток, а у самца J6 4 выход метафаз с мутациями достигал 84 на 100 клеток, то в половых клетках самца 16 3 частота клеток с нарушениями хромосом превышала 94 на 100 клеток. Большие колебания по частоте сперматоцитов с квадривалентами у гетерозигот, по-видимому, определяются в первую очередь размером транслоцированного участка хромосом (Ford, cieeg, 1969). Аналогичную картину наблюдали при анализе сперматоцитов гетерозиготных по транслокации саглцов, полученных от отцов, сперматогоніш которых подвергали облучению (Померанцева, 1969; Ford et ai., 1969; Leonard, 1971).
Анализ результатов цитологического изучения частоты мульти-валентных конфигураций у саглцов, гетерозиготных по транслокации, показал, что сперматоциты мышей Ш I и J& 2 несут соответственно по 14 (74$) и 24 (80$) квадривалентов в виде "кольца" и по 5 (26$) и 6 (20$) хромосомных аберраций в виде "цепи". В метафазах самца $ было обнаружено 62 (56$) мулътивалентных образований хромосом в виде "кольца" и 49 (44$) квадривалентов в виде "цепи". В половых клетках мыши \ї 3 из-за технических причин удалось проанализировать всего 19 метафаз; из них 18 (95$) несли мультивалентные конфигурации хромосом в виде "цепи".
На рисунке I приведены типы мулътивалентных конфигурации хромосом, цитологически выявленные у самцов, гетерозиготных по транслокации. В половых клетках самцов гомологичные хромосомы в период синапсиса образуют биваленты. На стадии диакинеза - мета-фазы первого мейогического деления, хромосомы с гранслоцированны-№і участками могут образовывать после терминализации хиазм мультивалентные конфигурации в виде "кольца" или "цепи". Квадривалент в виде "кольца" является наиболее частой встречаемой формой из 4-х хромосом. Встречаемость мулътивалентных образований, иных нежели "кольцо", можно отнести за счет отсутствия образований хиазм в одном или более плечах пахигенового креста. ВыхоД гамет со сбалансированным хромосомным набором у гетерозиготных по гранслока-ции животных определяется типом ориентации мулътивалентных конфигураций, величиной хромосом и сегментов, вовлеченных в транслокацию и положением центромер относительно точки разрыва ( Russell, 1962).
В половых клетках самца $ 3 была обнаружена своеобразная мультивалентная конфигурация хромосом (см.рис.1). При этом в метафазах самца В 3 не доставало Х -У пары. Все квадриваленгы включали терминальный элемент, опознаваемый как У-хромосома. Квадривалент в виде цепи почти во всех изученных метафазах состоял из отдельных элементов, которые отличались друг от друга и располагались в одинаковом порядке. Описываемая мультивалентная конфигурация хромосом в виде цепи является следствием транслокации между хромосомой и аутосомои. Возникновение аналогичных транслокаций между половой хромосомой и аутосомои в сперматогониях мыши были описаны ранее ( Lyon et al., 1964; Ford, Evans, 1964; Ohno, Cattanach, 1962). Появление таких транслокаций сравнительно редкое явление ( Lyon et al.,I970). При облучении зиготы на пронук-леарной стадии развития в дозе 100 Р (Lyon et al., 1964) было обнаружено, что у гетерозиготных особей аллель Та« (ген полосатости волосяного покрова, сцепленный;;с полом) при инактивации одной из Х-хромосом не проявляет свое действие вследствие транслокаций Х-хромосомы с аутосомои. Присутствие данной транслокации подтверждено цитологическигли исследованиями.
В исследованиях, проведенных на мышах, показано, что зигота на протяжении всей пронуклеарной стадии обладает неодинаковой радиочувствительностью ( Russell, Saylors, 1963; Russell, Montgomery, 1966; Rugh et al., 1969). Причем высокая радиочувствительность зиготы падает на ранние сроки пронуклеарной стадии (Russell, Montgomery, 1966). Как показал сравнительный анализ данных настоящего исследования и результатов исследований других авторов, по частоте появления самцов, гетерозиготных по транслокации, в первом поколении, при облучении половых клеток на разных стадиях гаметогенеза, пронуклеусы оказались генетически менее радиочувствительными, чем ранние сперматиды и гораздо радиочувсгви-тельнее половых клеток, находящихся на других стадиях сперматогенеза. Высокая радиочувствительность пронуклеусов объясняется, по-видимому, тем, что на раннюю пронуклеарную стадию зиготы приходится СИНТез ДНК ( Sirlin, Edwards , 1959).
Генетическое действие ионизирующих излучений на гоноциты эмбрионов
Генетический эффект ионизирующих излучений у эмбрионов в последние шесть дней их внутриутробного развития изучен при воздействии в дозе I Гр. Данные цитологического анализа самцов (табл.5), облученных 14,5, 15,5, 16,5, 17,5, 18,5 и 19,5 дневными эмбрионами показывает, что частота реципрокных транслокаций индуцированных в гоноцитах плодов при воздействии на них в одной и той же дозе в зависимости от сроков их развития не одинакова. В гоноцитах 14,5 дневных эмбрионов, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений, частота транслокаций оказалась более низкой, чем в половых клетках самцов мышей, облученных в 15,5-19,5 дни эмбриогенеза.
Самый высокий выход клеток с повреждениями хромосом (2,41 на 100 клеток) установлен в сперматоцитах самцов, облученных на 15,5 день внутриутробного развития. Средние частоты реципрокных транслокаций, обнаруженных в сперматоцитах самцов облученных на 16,5-18,5 дни эмбрионального развития колебалось в пределах от 0,53 на 100 клеток до 1,25 на 100 клеток. Однако следует отметить, что повышение уровня транслокаций у самцов, подвергшихся воздействию на 15,5 день эмбриогенеза определяется тем, что в одном семеннике у одного из животных этой группы обнаружен клон клеток с транс-локациями (22 транслокации на 312 проанализированных сперматоцитов). Подробно этот вопрос будет рассмотрен ниже.
Если данные по этому самцу исключить, то средняя частота ре-.ципрокных транслокаций по этой группе существенно не отличается от среднего выхода транслокаций у самцов, облученных на 16,5-19,5 дни эмбриогенеза.
Таким образом, на 5808 проанализированных спермагоцитов самцов, облученных на 15,5-19,5 дни эмбриогенеза, обнаружено 69 ре-ципрокных транслокаций, что составляет 1,19 0,13 на 100 клеток.
Средняя частота транслокаций для данной группы животных составляем ет 11,9x10"" с Гр на клетку. В половых клетках мышей контрольной группы хромосомные транс-локации не обнаружены.
При цитологическом анализе 15008 сперматоцитов самцов из двух серий, подвергшихся облучению на 14,5-19,5 дни эмбриогенеза, обнаружено 102 реципрокных транслокации. Из них 82 (80$) составили мультивалентные конфигурации хромосом в виде колец и 20 (20%) -квадриваленты в виде цепи.
В таблице 6 приведены более подробно результаты цитологического анализа частоты возникновения генетических нарушений в первичных сперматоцитах отдельных самцов, подвергшихся облучению в последней четверти эмбриогенеза.
При цитологическом изучении сперматоцитов 14-ти животных, облученных на 15,5 день эмбриогенеза в дозе 0,18 Гр, на исследованном материале было обнаружено, что спермагоциты пяти самцов свободны от реципрокных транслокаций, а половые клетки 9-ти животных несли хромосомные аберрации. При этом мегафазы пяти самцов имели ло одной мулътивалентной конфигурации хромосом в виде кольца. У .двух животных наблюдали по два квадривалента также в форме кольца. В сперматоцитах одного самца обнаружено три мультивалентные конфигурации хромосом в виде кольца (одно) и в форме цепи (.два). В мета-фазных пластинках другого самца зарегистрировано по одному квадри-валенту в форме кольца и цепи. Всего проанализировано 2877 метафаз, в которых выявлено 14 реципрокных транслокаций. Частота мутаций между отдельными самцами варьировала от 0 до I на 100 клеток.
Частота возникновения реципрокных транслокаций при воздействии ионизирующего излучения в дозе 0,45 Гр оказалась в три раза ниже таковой при облучении эмбрионов в дозе 0,18 Гр (р 0,05). Так при цитологическом анализе сперматоцитов 16-ти самцов мета-фазы 12-ти животных не имели ни одной транслокации. Из 4-х самцов, у которых были обнаружены хромосомные аберрации, половые клетки двух животных имели по одной мультивалентной конфигурации хромосом в виде кольца, метафазные пластинки другого самца несли по одному квадриваленту в форме цепи. Сперматоциты четвертого самца несли две мультивалентные конфигурации в виде кольца. Индивидуальные колебания по частоте транслокации между отдельными самцами при данной дозе составили от 0 до 0,94 на 100 клеток.
При дозе воздействия 0,89 Гр число самцов, в сперматоцитах которых обнаружены реципрокные транслокации, сильно возрастает по сравнению с количеством животных,облученных в дозе 0,45 Гр. Так,из 10-ти облученных эмбрионов, хромосомные аберрации присутствуют в половых клетках 8 самцов. В сперматоцитах двух животных обнаружено по одной мультивалентной конфигурации хромосом в виде кольца, такое же число квадривалентов, но в форме цепи, имеют два других животных. В метафазах трех самцов присутствуют по две мультивалентные конфигурации хромосом в форме кольца и в мегафаз-ных пластинках одного самца выявлено два квадривалента в виде цепи. Различия по минимальному и максимальному выходу транслокаций по отдельным самцам при воздействии в дозе 0,89 Гр составляет от 0 до 1,0 на 100 клеток.
