Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Роль плоидности в радиочувствительности клеток 11
1.2. Пострадиационное восстановление жизнеспособности клеток 16
1.3. Зависимость выживаемости от условий пострадиационного культивирования клеток 21
1.4. Зависимость выживаемости от вида излучения 25
1.5. Зависимость пострадиационного восстановления клеток,, облученных плотноионизирующей радиацией, от плоидности 28
1.6. Биологическое действие нейтронов 34
1.7. Кислородный эффект 36
1.8. Заключение 39
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Питательные среды и способы культивирования 44
2.3. Источники излучения и процедура облучения 44
2.4. Определение выживаемости клеток после облучения и пострадиационного восстановления 48
2.5. Определение сроков реализации потенциально летальных повреждений 51
2.6. Кривые выживаемости и статистическая обработка экспериментальных данных 52
Глава 3. ПОСТРАДИАЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ВЫЖИВАЕМОСТИ 55
3.1. Радиочувствительность и пострадиационное восстановление жизнеспособности дрожжевых клеток разной плоидности 55
3.2. Определение сроков реализации потенциально летальных повреждений 68
3.3. Влияние хлористого натрия на выживаемость облученных дрожжевых клеток 75
3.4. Заключение 85
Глава 4. ЗАВИСИМОСТЬ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК И ПОСТРАДИАЦИОННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ ОТ ВИДА ИЗЛУЧЕНИЯ 88
4.1. Относительная биологическая эффективность летального действия оі -частиц на дрожжевые клетки разной плоидности 88
4.2. Влияние мутаций радиочувствительности на ОБЭ о-частиц 94
4.3. Комбинированное действие d-частиц и (Г-лучей на дрожжевые клетки 107
4.4. Радиобиологические реакции дрожжевых клеток на облучение быстрыми нейтронами 116
4.5. Кислородный эффект при действии быстрых нейтронов на дрожжевые клетки 131
4.6. Заключение 137
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 141
ВЫВОДЫ 148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 150
- Роль плоидности в радиочувствительности клеток
- Источники излучения и процедура облучения
- Радиочувствительность и пострадиационное восстановление жизнеспособности дрожжевых клеток разной плоидности
- Относительная биологическая эффективность летального действия оі -частиц на дрожжевые клетки разной плоидности
Введение к работе
Актуальность темы.
Известно, что факторы, влияющие на радиочувствительность, могут изменять вероятность образования потенциально летальных повреждений или проявления реализованных повреждений, а также влиять на эффективность восстановления клеток от потенциально летальных повреждений. Изучение действия ионизирующих излучений проводится на биологических тест-системах, к числу которых относятся и дрожжевые клетки, позволяющие изучать летальные эффекты и влияние на их величину модифицирующих факторов.
Широкое применение нейтронов в народном хозяйстве и медицине вызывает необходимость тщательного изучения их биологического действия. Особый интерес представляет изучение способности клеток к пострадиационному восстановлению. Результаты исследований и выявление способности дрожжевых клеток как тест-объекта восстанавливать повреждения, индуцированные нейтронами, возможности модификации летального действия нейтронов могут быть использованы при выборе условий облучения злокачественных
клеток и испытании различных модификаторов. Сейчас ведется ши-
«і
рокий поиск физических и химических факторов, усиливающих или ослабляющих реакции клеток на облучение, а также изучается влияние этих факторов на пострадиационное восстановление. Так как при использовании нейтронов большая или меньшая часть поглощенной дозы обусловлена вкладом /-излучения, то возникает необходимость изучения совместного действия редко- и плотноио-низирующей радиации на клетки. Изучение модификаций выживаемо-
сти клеток и выявление причин, обусловливающих эти модификации, с одной стороны способствует пониманию первичных механизмов радиационного воздействия, а с другой - облегчает целенаправленный поиск модификаторов клеточной радиочувствительности, которые необходимы для повышения эффективности лучевой терапии и стерилизации. Поэтому экспериментальное изучение модификации радиочувствительности клеток дрожжей и влияние ее на пострадиационное восстановление - актуальная задача современной радиобиологии.
Цель и основные задачи исследования.
В связи с этим целью настоящей работы явилось выявление роли пострадиационного восстановления в модификации радиочувствительности дрожжевых клеток в зависимости от их плоидности, условий культивирования и облучения.
Для этого потребовалось:
Изучить радиочувствительность и эффективность пострадиационного восстановления в воде ( Liquid holding recovery, LBR ) дрожжевых клеток разной плоидности.
Уточнить сроки реализации потенциально летальных повреждений при инкубации дрожжевых клеток на питательной среде и определить роль пострадиационного восстановления в модификации выживаемости, наблюдаемой при культивировании облученных дрожжевых клеток на средах с повышенным содержанием хлористого натрия.
Исследовать связь ОБЭ сі -частиц с плоидностью клеток и их способностью к восстановлению.
Изучить особенности комбинированного действия oL-частиц и /'-излучения на дрожжевые клетки.
Изучить действие быстрых нейтронов на выживаемость дрожжевых клеток и способность к пострадиационному восстановле-
нию; определить величину кислородного эффекта.
Научная новизна.
С использованием изогенных коллекций полиплоидных штаммов дрожжей впервые показано, что с увеличением числа хромосомных наборов в клетке повышается эффективность пострадиационного восстановления.
Разработана методика изучения реализации потенциально летальных повреждений с применением арсената натрия, блокирующего в целом клеточное деление, но не оказывающего влияния на процесс пострадиационного восстановления диплоидных дрожжевых клеток. Эта методика позволила количественно определить сроки завершения реализации потенциально летальных повреждений и выявить их зависимость от дозы облучения: при облучении в дозах 170-220 Гр реализация завершается за II часов, а при дозе 320 Гр за 7-8 часов.
Впервые показано, что снижение выживаемости на полноценных средах с повышенным содержанием НаС1 (6$) не связано с подавлением восстановления, поскольку величина модификации выживаемости одинакова для клеток, способных к пострадиационному восстановлению и для клеток, завершивших пострадиационное восстановление. Более того,НаС1 в среде с пониженной концентрацией питательных веществ (2 Балл сусла) приводит к существенному повышению выживаемости. Это означает, чтоШаСІ в повышенной концентрации не подавляет пострадиационное восстановление клеток
от потенциально летальных повреждений, а повышает вероятность проявления реализованных повреждений.
- На изогенных полиплоидных штаммах дрожжей установлено,
что с ростом плоидности возрастает величина ОБЭ cL-частиц.
_ 7 -
С использованием большой коллекции радиочувствительных мутантов гаплоидных и диплоидных дрожжей установлено, что мутации радиочувствительности снижают величину ОБЭ
Получены новые данные по комбинированному действию плотно и редкоионизирующей радиации на клетки. Показано, что предварительное облучение диплоидных клеток oi-частицами в малых дозах повышает их чувствительность к последующему облучению /-квантами. Малые дозы о -радиации снижают чувствительность клеток к U -частицам в зависимости от способности клеток к пострадиационному восстановлению; чем выше способность клеток к восстановлению, тем сильнее снижается их чувствительность к d-частицам; у мутанта, утратившего способность к восстановлению, этот эффект отсутствует .
Исследованы закономерности летального действия быстрых нейтронов реактора БР-10 на дрожжевые клетки разной плоидности, определены значения ОБЭ нейтронов и впервые показано, что полиплоидные дрожжевые клетки способны восстанавливаться после облучения быстрыми нейтронами. У диплоидных клеток облученных быстрыми нейтронами формы инактивации (2-4 клетки) встречаются чаще, чем после облучения 4 -квантами. Таким образом, высокая ОБЭ нейтронов является следствием более глубокого повреж-
- 8 -дения нейтронами клеточных структур. Установлено, что повреждающее действие нейтронов на биообъект можно ослабить уменьшением давления кислорода в момент облучения. (Коэффициент кислородного усиления ККУ = 1,3).
Научно-практическая значимость работы.
Обнаруженные закономерности летального действия ионизирующих излучений на дрожжевые клетки представляют большой интерес в чисто научном плане. Так, увеличение эффективности восстановления при повьшении плоидности клеток служит веским аргументом в пользу представлений, согласно которым наличие гомологичных хромосом является необходимой предпосылкой для осуществления пострадиационного восстановления клеток в непитательной среде. Подтвержденная на большом числе штаммов корреляция между способностью клеток к восстановлению и величиной ОБЭ t^-частиц может быть использована при разработке теоретических моделей действия излучений с различными ЛПЭ на клетки. Представленные в диссертации экспериментальные данные, подтверждающие возможность модификации выживаемости клеток без влияния на пострадиационное восстановление, явились одним из отправных пунктов для создания вероятностной модели лучевого поражения клеток (Ю.Г. Капульцевич, 1978). Использованные в опытах методические приемы послужили основой для обнаружения нового "быстрого" восстановления жизнеспособности клеток (А.В.Глазунов, Ю.Г.Капульцевич, 1982).
Особое значение имеют изученные характеристики действия быстрых нейтронов на дрожжевые клетки в связи с перспективой применения нейтронов реактора БР-10 в клинической практике. Обнаруженная модификация выживаемости клеток, обусловленная влия-
- 9 -ниєм кислорода во время облучения, хоть и мала по сравнению с таковой для /-облучения, но все же существенна для прогнозирования действия быстрых нейтронов на биологические объекты. Эффект снижения чувствительности клеток к плотноионизирующей радиации за счет облучения их малыми дозами редкоионизирующей радиации и связь этого эффекта с пострадиационным восстановлением следует учитывать при разработке методов радиотерапии с использованием плотноионизирующей радиации.
Выявленные связи пострадиационного восстановления с модификациями выживаемости клеток можно использовать для целенаправленного поиска модификаторов радиочувствительности. В частности, обнаруженная в работе повышенная способность полиплоидных дрожжевых клеток к пострадиационному восстановлению позволяет рекомендовать эти клетки в качестве тест-объектов для отбора модификаторов, влияющих на пострадиационное восстановление.
На защиту выносятся следующие положения:
Полиплоидные дрожжевые клетки,облученные быстрыми нейтронами, способны к пострадиационному восстановлению; способность дрожжевых клеток к восстановлению от повреждений после облучения как плотно-, так и редкоионизирующим излучением,и значение ОБЭ oL-частиц и нейтронов коррелирует с плоидностью клеток.
Реализация потенциально летальных повреждений в зависимости от дозы завершается за 7-12 часов; модификация выживаемости различной концентрацией КаСІ в питательной среде не связана с пострадиационным восстановлением, а обусловлена усилением летального действия ионизирующего излучения.
Личный вклад соискателя.
Все экспериментальные исследования выполнены автором, при его непосредственном участии в планировании, проведении экспериментов, анализе и описании полученных результатов. Работа является итогом многолетних плановых исследований, проведенных автором в лабораториях радиобиологии клетки и экспериментальной дозиметрии отдела медицинской физики НИИМР АМН СССР. В научных статьях по теме диссертационной работы, опубликованных совместно с другими авторами, использованы материалы, полученные автором диссертации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на различных Всесоюзных научных конференциях.
Полученные радиобиологические характеристики дрожжевых клеток используются в новых исследованиях биологической эффективности нейтронов и тяжелых заряженных частиц в рамках обобщенной научной темы "Теоретические и экспериментальные исследования биологических эффектов ("Бионейтрон") НИИМР АМН СССР.
- II -
Роль плоидности в радиочувствительности клеток
Дрожжи-сахаромицеты являются уникальным объектом, у которого наряду с гаплоидными и диплоидными культурами можно искусственно получать и полиплоидные штаммы.
Повышенная радиочувствительность гаплоидных дрожжей по сравнению с диплоидными была обнаружена еще в 30-е годы ( Lacas-sagne , 1930; Holweck, Lacassagne, 1931). Latarjet, Ephrus-si (1949) первыми определили зависимость выживаемости гаплоидных и диплоидных дрожжей от дозы рентгеновского излучения и установили, что гаплоиды имеют экспоненциальную кривую выживания, а диплоиды - сигмоидную. Эти авторы предположили, что инактивация дрожжевых клеток обусловлена возникновением при облучении рецессивных летальных мутаций. Для инактивации гаплоидной клетки достаточно одного повреждения, поэтому их кривая выживания экспоненциальна, и они обладают высокой радиочувствительностью. Для гибели же диплоидной клетки необходимы два таких повреждения, поэтому их кривая выживания сигмоидна, и они менее радиочувствительны.
Попытки использовать фактор плоидности в радиобиологии касались главным образом взаимосвязи радиочувствительности клеток с числом хромосомных наборов в клетке. Высокая радиочувствительность и экспоненциальность кривых выживания гаплоидов была позже подтверждена многими исследованиями ( Zirkel, Tobias, 1953; Lucke, Sarachek, 1953; Тобиас К., 1955; Uretz, 1955; Mortimer, 1955, 1958; Magni, 1956, 1959; Корогодин В.И., Лю-Айшень, 12 -1959; baskowski , I960; Laskowski et al., I960; Барсуков B.C. и др., Ї963а; James, Werner, 1965; Averbeck, Ebert, 1973; Co-курова E.H., 1975; Глазунов А.В. и др., 1982; Saeki et al., 1980).
Если рецессивные летальные мутации действительно играют ведущую роль в лучевой инактивации дрожжей, то следовало ожидать дальнейшего повышения радиорезистентности по мере увеличения плоидности от 2 до 4. Однако Lucke, Saracnek (1953), Sarachek (1954), Sarachek et al. (1954) показали, что три-плоид действительно более радиоустойчив, чем диплоид, но тет-раплоид оказался чувствительнее триплоида. Mortimer (1958) получил серию полиплоидных штаммов от гаплоида до гексаплоида и изучил их радиобиологические характеристики. Самыми чувствительными оказались гаплоиды, и для них были получены экспоненциальные кривые выживаемости. Для всех штаммов с плоидностью 2 и вьше кривые выживаемости были сигмоидные.
Источники излучения и процедура облучения
Рентгеновское излучение. Источником рентгеновских лучей служила терапевтическая установка "ТУр-60" (напряжение бОкВ, сила тока 22 мА, фильтр 0,3 мм Al , мощность дозы 200 Гр/мин).
Нейтроны. Источником нейтронов служил канал Б-3 исследовательского реактора БР-10 (мощность дозы 3,5 Гр/мин, ЛПЭ около 80 кэВ/мкм, средняя энергия нейтронов около 0,85 МэВ). Физические характеристики нейтронных пучков реактора БР-10 были использованы для обоснования условий радиобиологических экспериментов (Жербин Е.А., 1975). Поглощенные дозы определяли ферро-сульфатным дозиметром, объем которого точно соответствовал объему облучаемой дрожжевой суспензии. В показания дозиметра вносили поправку на вклад Г-излучения в поглощенную дозу, который по данным Капчигашева СП. и др. (1977) так мал, что его биологическим эффектом при облучении объектов малого объема практически можно пренебречь.
(/.-частицы. В качестве источника «(-частиц использован радиоактивный изотоп плутония-239 с энергией « -частиц 3,5 МэВ, мощность дозы 17 Гр/мин, ЛПЭ 125 кэВ/мкм. Ошибка дозиметрии составляла +10% (Петин В.Г., 1969).
Процедура облучения. Непосредственно перед облучением дрожжевые клетки смывали с поверхности агара небольшим объемом стерильной водопроводной воды и доводили концентрацию суспензии до 10 клеток/мл. 2-3 мл такой суспензий наливали в пробирки, кото рые помещали в специальный штатив, и облучали в рабочей камере Гаммаселла до получения необходимой дозы.
В опытах с мягким рентгеновским излучением ("Тур-60") дрожжевая суспензия находилась в цилиндрической плексиглассовои кювете, герметично соединенной с тубусом аппарата; при этом слой суспензии на дне кюветы не превышал 2-3 мм. Подобные кюветы применялись и при облучении быстрыми нейтронами, но объем суспензии в последнем случае был около 10 мл.
При изучении кислородного эффекта дрожжевую суспензию облучали в герметических стеклянных флаконах, заполненных азотом или воздухом. Аноксию создавали продуванием через суспензию азота в течение 30 мин со скоростью 4 мл/мин.
Из-за малой проникающей способности oi -частиц дрожжевые клетки облучали в виде монослоя, приготавливаемого следующим образом: 0,02 мл суспензии помещали на поверхность водного агара и перед облучением помещали на 20-30 минут в термостат (30С) для выпаривания воды из капли. Оставшийся на поверхности агара монослой клеток облучали ol-частицами плутония-239.
Радиочувствительность и пострадиационное восстановление жизнеспособности дрожжевых клеток разной плоидности
Зависимость лучевой инактивации клеток от числа хромосомных наборов описана, как указывалось в обзоре литературы, многими авторами. Хорошо известен факт, что диплоидные и полиплоидные дрожжи способны восстанавливать радиационные повреждения при выдерживании их в пострадиационный период в непитательной среде. Известно также, что гаплоидные дрожжи не обладают такой способностью.
Целью данного раздела работы было выяснение влияния плоид ности дрожжевых клеток на основные параметры пострадиационного восстановления - величину необратимого компонента поражения к и скорость элиминации первичных повреждений Jb.
В первой серии экспериментов использовали полиплоидный ряд штаммов дрожжей Saccharomyces cerevlsiae (от гаплоидного до гексаплоидного), полученный от доктора Р.Мортимера. Названия штаммов и полученные радиобиологические характеристики приведены в таблице 3.I.I. Источником рентгеновского излучения служила терапевтическая установка "ТУР-60". Выживаемость дрожжевых клеток определяли по методике микроколоний.
На рис. 3.I.I, 3.1.2 (А,В) изображена зависимость выживаемости дрожжей разной плоидности от дозы. За исключением гаплоидных дрожжей,кривая выживаемости которых экспоненциальна (рис. 3.I.IA, кривая I), эта зависимость описывается сигмоидными кривыми. По кривым выживаемости гаплоидных и полиплоидных штаммов дрожжей рассчитаны значения D и LDQ0 И приведены в таблице 3.I.I. Сравнение параметров, характеризующих радиочувствительность, показывает, что наиболее радиочувствительными являются гаплоидные дрожжевые клетки, а наиболее радиорезистентными - триплоидные. Из рис. 3.I.I., 3.1.2 видно, что кривые полиплоидных штаммов располагаются практически параллельно друг ДРУГУ, поэтому величина D не отражает существенных различий в радиочувствительности, а наиболее показательной будет величина LDQn. Для самого радиочувствительного гаплоидного штамма LDQQ - 120 Гр, а для самого радиорезистентного - триплоидного - 520 Гр. С дальнейшим повышением плоидности LD уменьшается, что соответствует и литературным данным ( Mortimer, 1958; Laskowski, I960).
Относительная биологическая эффективность летального действия оі -частиц на дрожжевые клетки разной плоидности
Представлены кривые выживаемости изогенных штаммов дрожжей разной плоидности серии Ласковского 2П-1аМ,
Кривые выживаемости гаплоидных штаммов дрожжей серии Ласковского после облучения d-частицами (I) и Jf-квантами (2) (А,Б). Кривые выживаемости полиплоидных штаммов дрожжей серии Ласковского после облучения cL -частицами (I) и /"-квантами (3), высеянных на питательную среду сразу после облучения (1,3) и после 3-х суточного восстановления (2,4) (В, Г, Д, Е, Ж). 90 -211-Ів, 211, 301, 415, 500 и 600, высеянных на питательную среду сразу после облучения У -квантами и d.-частицами, а также после 3-х суточного восстановления в непитательной среде, из которого следует, что кривые выживаемости для гаплоидных штаммов после облучения оі-частщамк экспоненциальны, а для полиплоидных штаммов - сигмоидны. Радиобиологические характеристики этих штаммов представлены в таблице 4.І.І, из которой видно, что после облучения плотноионизирующей радиацией самыми радиочувствительными являются гаплоиды и гексаплоид, а наиболее радиорезистентным - диплоид, как и после облучения редкоионизирующей радиацией.
Для количественной оценки способности к пострадиационному восстановлению полиплоидных штаммов после облучения -частицами и -квантами была определена величина необратимого компонента поражения k , значение которой представлено в таблице 4.1 Л. Из таблицы видно, что эта величина с ростом плоидности уменьшается как после облучения о-частицами, так и после облучения 0-квантами. Зависимость величины необратимого компонента поражения к после облучения об-частицами от плоидности представлена на рис. 4Л.2 (А). Коэффициент корреляции - г = -0,8776, г м. = -0,8802, величина которого свидетельствует о наличии корреляции. Экспериментальные данные, приведенные на рис. 4Л.2 (А), показывают, что значения необратимого компонента поражения к всегда выше после облучения oL -частицами, чем после облучения квантами. Это означает, что эффективность пострадиационного восстановления полиплоидных дрожжевых клеток от потенциально летальных повреждений, вызванных сС-частицами почти всегда ниже
