Содержание к диссертации
Введение 4
1. Обзор литературы 11
1.1. Факторы, определяющие чувствительность клеток
к воздействию ионизирующего излучения 11
1.2. Изменения клеточной радиочувствительности после
облучения в малых дозах 20
2.Материалы и методы 33
Лимфоциты крови: выделение,
условия культивирования и облучения 33
Культура клеток:
условия культивирования и облучения 35
Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала 37
Метод электрофореза ДНК единичных клеток 39
Анализ доли клеток с высоким содержанием фосфорилированного гистона
Н2АХ 43
Оценка доли погибших клеток 44
Статистический анализ полученных данных 46
3. Результаты исследований и их обсуждение 47
3.1.Индукция двунитевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в делящихся лимфоцитах крови
человека, облученных в адаптирующей дозе 47
3.2.Изменения поврежденности генома и чувствительности
к образованию ДР ДНК при тес тирующем
облучении в поколениях облученных клеток линии СНО 60
3.3.Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и
клеток селезенки мышей в течение хронического облучения 66
Заключение 74
Выводы 76
Список использованной литературы 78
Введение к работе
Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению (адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствигельность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill, Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Seoane et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001, 2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической системы (формирование гипервариабельных участков
парагопа антител, появление альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее актуальных задач радиационной биологии.
В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные' пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеинкиназа С (РКС), р38 митоген-активируемая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 81, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения о том, в ответ па какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика на облучение. Среди повреждений ДНК, вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных
клеток к тестирующему облучению: предотвращения образования ДР ДНК
или активизации процессов репарации ДНК от них? В течение скольких
поколений облученных клегок сохраняется
чувствительность/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется?
Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденности ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных поколениях облученных клеток млекопитающих.
В работе использовали лимфоциты крови человека, эпителиальные клетки яичника китайского хомячка линии СНО, а также лейкоциты крови и клетки селезенки мышей линии СВАЛас. Выбор столь разных экспериментальных обьектов обусловлен их уникальными возможностями. В отличие от лимфоцитов грызунов, свежевыделеиные лимфоциты периферической крови человека легко стимулируются к делению фитогемоагглютинином. Высокая чувствительность к облучению, известный кариотип и возможность их культивирования in vitro в течение 5-6 суток (без усложнения методики) сделали лимфоциты крови человека одним из наиболее распространенных объектов для изучения механизмов адаптивного ответа (АО) (Пелевина и др., 2000, 2003, 2007, 2009). Недостатком этого объекта является относительно короткий срок культивирования и довольно высокая вариабельность показателей в зависимости от конкретного донора. Для оценки эффектов облучения в отдаленных потомках облученных клеток нами была использована
культура клеток яичника китайского хомячка линии СЫО. Ранее именно на этой культуре клеток была показана индукция нестабильности генома в потомках облученных клеток (Антощина и др. 2005). Для изучения биологических эффектов хронического облучения клеток млекопитающих in vivo нами были выбраны линейные мыши СВАЛас, характеризующиеся высокой чувствительностью к хроническому облучению и низким уровнем спонтанных хромосомных нарушений (Blandova, 1983). Использование общего методического подхода для оценки изменений радиочувствительности ДНК делает возможным включение экспериментальных результатов, полученных на вышеупомянутых биообъектах, в диссертационную работу.
Цель и задачи исследования Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР ДИК, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- Исследовать изменения выхода и эффективности репарации ДНК от
ДР, индуцированных тестирующим облучением в проявляющей дозе в
адаптированных облучением в малой дозе и контрольных делящихся
лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.
Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток эпителия яичника китайского хомячка линии СНО.
- Изучить изменения выхода ДР ДНК, индуцированных облучением в
проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы. Положения, выносимые на защиту:
Адаптивный ответ, вызванный в стимулированных к делению лимфоцитах крови облучением в малой дозе (5 сГр), сохраняется в их кратковременной культуре, по крайней мерс, в течение 72 ч (~ 3 митоза) после его индукции, переходя от материнских клеток в поколения дочерних
Поврежденность ДНК, обусловленная двунитевыми разрывами ее молекул в клетках СНО в результате облучения в сублетальной дозе, проявляется в потомстве этих клеток длительное время, на протяжении многих поколений, такими же разрывами, свидетельствуя о возникновении и поддержании, по крайней мере, в части их, радиационно-индуцированной нестабильности генома и создавая условия для селекции из них клеток-родоначальников радиорезистентных клонов
3. При хроническом воздействии у-излучения на клетки
млекопитающих в зависимости от времени облучения и от накопленной
дозы реализуются различные системы защиты іслеток от облучения, не
связанные и связанные со снижением степени фрагментации ДНК в
клеточных популяциях.
Научная новизна. Впервые с помощью метода ДНК-комет были проведены исследования изменений чувствительности адаптированных облучением в малой дозе лимфоцитов периферической крови человека к индукции ДР ДНК облучением в тестирующей дозе, а также эффективности их репарации в течение 72 ч (время ~ трех митозов) после
индукции ЛО. Впервые исследованы изменения степени поврежденности генома и чувствительности к дополнительному облучению в 37-42-х поколениях, облученных в дозе 1 Гр. эпителиальных клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Получены новые результаты, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые показано, что при хроническом 'воздействии у-излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации-ДНК в клеточной популяции.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии при изучении механизмов возникновения и поддержания нестабильности генома, изменения радиочувствительности клеточных популяций в пострадиационном периоде, эффектов формирования отдаленных последствий облучения на клеточном уровне. Результаты исследований хронически облученных мышей будут весьма полезны при проведении радиоэкологического мониторинга окружающей среды, а в космической биологии и в медицине для оценки эффектов хронического облучения в малых дозах.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью
исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008) и 36-м ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (Tours, France, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
