Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Биологическая активность рибонуклеаз 13
1.1.К Роль рибонуклеаз в регуляции экспрессии генов 16
1.1.2. Защитные функции рибонуклеаз 23
1.2. Цитотоксичные рибонуклеазы различных организмов 27
1.2.1. Механизмы цитотоксичности рибонуклеаз 32
1.2.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности рибонуклеаз 39
1.3. Иммуногенные эффекты рибонуклеаз 48
2. Материалы и методы исследований 52
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы 52
2.1.1. Ферментные препараты 52
2.1.2. Бактериальные штаммы 56
2.1.3. Клеточные культуры 57
2.2. Методы определения токсического и генотоксического действия РНКаз в прокариотических тест-системах 58
2.2.1. Оценка токсичности ферментных препаратов по выживаемости тестерных штаммов грамотрицательных и грамположительпых микроорганизмов 58
2.2.2. Оценка токсичности ферментных препаратов по ингибированию уровня конститутивных ферментов 59
2.2.3. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах.. 60
2.2.3.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций 60
2.2.3.2. SOS-хромотест 61
2.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур 61
2.4. Цитомстрическое определение апоптических клеток 62
2.5 Визуализация апоптических изменений клеток с помощью методов микроскопии 64
2.5.1. Микроскопическое исследование апоптических изменений клеточной морфологи и 64
2.5.2. Микроскопия с использованием витального окрашивания флуоресцентным красителем JC-1 64
2.5.3. Прямая регистрация уровня внутриклеточного Са с помощью флуорохромного агента FURA-2 64
2.6. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем ноле 65
2.7. Цитометричсское исследование индукции нсспецифического иммунного ответа 66
2.8. Статистическая обработка результатов 67
3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Токсические и гепотоксическис эффекты микробных рибонуклеаз 68
3.1.1. Токсические эффекты рибонуклеаз 68
3.1.2. Индукция генных мутаций рибонуклеазами в тесте Эймса 69
3.1.3. SOS-индуцирующая активность рибонуклеаз 70
3.2. Апоптозиндуцирующее действие микробных рибонуклеаз на нормальные и малигнизированпые клетки эукариот 76
3.2.1. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови 76
3.2.2. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на клетки солидных опухолей 87
3.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур при росте в присутствии микробных РНКаз 90
3.4. Апоптотическис изменения морфологических и физиологических характеристик клеток под действием рибонуклеазы Bacillus intermedius 94
3.5. Рибонуклаза Bacillus intermedius как индуктор поликлопалыюго Т-клеточиого ответа 101
4. Заключение 103
Выводы 107
Список литературы 110
- Биологическая активность рибонуклеаз
- Иммуногенные эффекты рибонуклеаз
- Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем ноле
- Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибонуклеазы (РНКазы) - важнейшие ферменты метаболизма РНК, функции которых заключаются в расщеплении мРНК, превращении предшественников РНК в зрелые формы, продукции малых регуляторных РНК, деградации определенных типов РНК. Клетка содержит около 20 видов экзо- и эндорибонуклеаз, которые могут входить в состав надмолекулярных комплексов и проявлять высокую специфичность к определенным нуклеотидным последовательностям и структурам [Deutscher, Li, 2001]. В последние годы пристальное внимание уделяется функциям РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, роста и дифференцировки клеток, защитой от патогенов, индукцией апоптоза.
С определенной долей условности можно сказать, что многим РНКазам эволюционно присущи токсические свойства. Действительно, секретируемые микробные РНКазы не только обеспечивают клетки-хозяина доступным источником фосфора в условиях фосфатного голодания [Rittmann et al., 2005], который образуется при разложении РНК нежизнеспособных клеток, но и могут служить оружием в конкурентной борьбе с другими микроорганизмами за экологическую нишу.
В настоящее время особое внимание уделяется биологическим эффектам рибонуклеаз, таким, как контроль роста кровеносных сосудов, токсичность по отношению к клеткам опухолей, противовирусная активность. Современные представления о роли и функциях РНКаз в клетках позволяют рассматривать эти ферменты как перспективную альтернативу традиционным химиотерапевтическим средствам в щадящей терапии злокачественных новообразований. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к клеткам опухолей [Leland, Raines, 2001; Spalletti-Cernia et al., 2004; Ильинская, Макаров, 2005]. Наиболее известным ферментом этого ряда является РНКаза лягушки Rana pipiens - онконаза [Saxena, et al., 2003], успешно проходит III стадию клинических испытаний как противоопухолевый препарат в терапии злокачественных новообразований легких. Для РНКаз, как средств противоопухолевой терапии, основное значение имеет фактор избирательного действия по отношению к раковым клеткам. Кроме того, иммуногенный эффект ферментов, внедряемых в практическую медицину, должен быть по возможности низким. При этом целенаправленный поиск терапевтически перспективных ферментов среди РНКаз млекопитающих не всегда тактически оправдан в связи с эволюционно сформировавшейся системой защиты клетки млекопитающих от излишней активности собственных РНКаз, опосредованной действием специфического цитозолыюго ингибитора РНКаз (РИ) [Leland, Raines, 2001]. В связи с этим особое внимание на себя обращают РНКазы филогенетически далекие от своих аналогов у млекопитающих, такие, как РНКазы амфибий, грибов и микроорганизмов, нечувствительные к действию РИ [Sevcik et al., 2002]. Таким образом, отсутствие возможности у бактериальных рибонуклеаз быть инактивированными РИ, а также широкие возможности для биоинженерии этих ферментов делает их весьма привлекательными для разработки новых терапевтических средств.
Основы исследования противовирусного действия РНКаз животных в России были заложены работами Р.И. Салганика с соавторами [1976], это важное направление развивается сегодня с привлечением микробных РНКаз [Грибенча с соавт., 2004], причем особенное внимание уделяется синтезу искусственных небелковых РНКаз с противовирусными эффектами, проводимому под руководством В.В. Власова [Власов, 2004; Kuznetsova et al., 2005]. Эффекты нуклеодеполимераз в отношении опухолевых клеток изучались в нашей стране с 60-х гг. прошлого века [Беляева, Нужина, 1969], однако пристальное внимание эффектам бактериальных РНКаз было уделено позже в работах Куриненко с соавторами [1991].
До сих пор вопрос о механизмах противоопухолевого действия РНКаз остается открытым. Современный уровень исследования структуры РНКаз и клеточных компонентов, с которыми они взаимодействуют, позволяет по-новому оценить вклад отдельных молекулярных детерминант в процесс индуцированной гибели опухолевых клеток. Регуляция экспрессии генов малыми РНК (РНК-интерференция) определяет особый путь действия экзогенных РНКаз на клетки эукариот [McManus, 2003]. Определение молекулярных детерминант РНКаз бактерий, ответственных за проявление их цитотоксических свойств к ( злокачественным и нормальным клеткам человека, а также изучение их иммуногенной активности позволит обосновать возможность применения микробных РНКаз и биоинженерных конструкций на их основе в лечении злокачественных новообразований и наметить технологические подходы к решению проблемы получения функционально активных терапевтических белков.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явились оценка цитотоксического действия микробных РНКаз на злокачественные клетки крови и клетки солидных опухолей, а также характеристика показателей селективности действия, генотоксичности и иммуногенности ферментов, позволяющие экспериментально подтвердить потенциальную возможность использования РНКаз как средств щадящей противоопухолевой терапии. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Исследовать токсические эффекты РНКаз Bacillus intermedins (биназы) и Streptomyces aureofaciens (РНКазы Sa) и их мутантов при воздействии на клетки бактерий.
2. Охарактеризовать генотоксическую активность микробных РНКаз и их мутантов в прокариотических тест-системах. 3. Исследовать апоптогенное действие РНКазы Bacillus intermedins -биназы и ее мутантов со сниженной каталитической активностью на культуры нормальных и злокачественных клеток крови, а также на клетки солидных опухолей животных.
4. Охарактеризовать иммуногенные свойства РНКазы В. intermedins. по анализу специфических активационных маркеров Т-клеток.
5. На основе полученных данных оценить вклад отдельных молекулярных детерминант, а именно катиониости и каталитической активности РНКаз в апоптогенное и цитотоксическое действие ферментов.
Научная новизна. Впервые установлены токсические эффекты по отношению к грам положительным и грамотрицательным бактериям высоких концентраций биназы, ее мутанта Lys26Ala и катионных мутантов РНКазы Sa (5К, 7К). Впервые показано генотоксическое действие катионных бактериальных РНКаз в тесте Эймса по индукции мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у бактерий Salmonella typhimurium ТА 100 и в тесте по индукции SOS-ответа у Escherichia coli PQ 37, при этом генотоксические свойства коррелировали с поверхностным зарядом молекулы фермента. В работе впервые с помощью методов проточной цитометрии, электрофореза в пульсирующем поле и дифференциального окрашивания зафиксировано апоптоз-индуцирующее действие биназы по отношению к клеткам солидных опухолей (карцинома легких А549) и клеткам миелогенного лейкоза К562 и проведен сравнительный анализ апоптогенной активности РНКазы по отношению к нормальным и опухолевым клеткам. Установлено, что в отношении нетрансформированных аналогов опухолевых клеток фермент не проявляет апоптоз-индуцирующих свойств. Впервые охарактеризован решающий вклад в апоптогенность биназы ее каталитической активности, то есть показано, что необходимым условием апоптогенности фермента является расщепление доступной клеточной РНК. Впервые выявлено, что вклад каталитической активности РНказ в поражение клеток солидных опухолей более значим в сравнении с ролью рибонуклеолитической активности в индукцию апоптоза злокачественных клеток крови. Апоптические свойства катионных мутантов РНКазы Sa и биназы продемонстрированы в отношении клеточных линий нормальных и ras-трансформированных фибробластов, а также эмбриональных клеток почек человека, нормальных и искусственно экспрессирующих гены кальций-зависимых калиевых каналов, роль которых представляется важной для реализации цитотоксичности РНКаз. Впервые выявлено, что биназа, а также ее мутант Lys26Ala с пониженной каталитической активностью не индуцировали экспрессии специфических маркеров иммунного ответа (CD69 и у-интерферона) в популяции CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, что свидетельствует об отсутствии у цитотоксичных ферментов свойств индуктора поли клон ал ыюго Т-клеточного ответа по типу суперантигена.
Практическая значимость. Актуальность проблемы раковых заболеваний заставляет вести постоянный поиск новых препаратов и подходов для лечения злокачественных новообразований, поэтому любая возможность получения новых щадящих средств противоопухолевой терапии, избирательно поражающих злокачественные клетки, имеет несомненную практическую ценность. Настоящая работа особенно важна в связи с тем, что обосновывает индукцию бактериальными РНКазами преимущественной гибели опухолевых клеток путем апоптоза, не нарушающего функционального состояния нормальных тканей организма. В данной работе обоснована возможность получения препаратов с селективным апоптоз-индуцирующим действием в отношении малигнизированных клеток на базе каталитически активных катионных микробных РНКаз. Выяснение роли отдельных молекулярных детерминант в токсическом действии РНКаз, в частности весомого вклада зарядовых свойств и каталитической активности молекулы, а также анализ механизма действия этих ферментов позволят разработать подходы к целенаправленному получению высокотоксичных для малигнизированных клеток препаратов нового поколения, альтернативных известным ДНК-повреждающим химиотерапевтическим агентам. Установленное отсутствие у биназы свойств инициатора неспецифического иммунного ответа позволяет в первом приближении обосновать возможность использования этого фермента, а также биоинженерных конструкций на его основе в терапии опухолевых заболеваний.
В ходе экспериментальной работы разработана и опробована оригинальная методика цитометрического определения апоптозиндуцирующего действия соединений, выгодно отличающаяся от классической меньшей стоимостью за счет замены использования дорогостоящих препаратов (аннексина и пропидиума йодида) для цитофлуорометрической фиксации апоптических изменений клеток на более дешевые аналоги (мероцианин 540 и 7-аминоактиномицин D).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2002-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования автора как исполнителя данной тематики поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (04-04-49385), фонда Североатлантического союза (LST.CLG.979534), фонда "Университеты России - фундаментальные исследования" (ур.11.01.004) и фонда академии наук Республики Татарстан (НИОКР АН РТ 03-3.10-292), госконтрактами 02.434.11.3020 «Конструирование противоопухолевых препаратов селективного действия на основе микробных рибонуклеаз» и «Центр коллективного пользования КГУ» 02.451.11.7019 (2005-2006гг.), а также программой «Развитие научного потенциала высшей школы РНП.2.1.1.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку фонда Палаты депутатов г. Берлина (2003-2004гг.). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Цитометрические исследования и фиксацию апоптических изменений клеток проводили на базе института Медицинской иммунологии Шарите, Берлин, Германия.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и региональных конференциях: VI международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005), XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», (Казань, 2005г.), V конференции Научно-образовательного Центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005г.), 79-й Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной 1000-летию Казани (2005г.), 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005г.), итоговых научных конференциях Казанского Государственного Университета (2003г. - 2005г.), а также на семинарах кафедры микробиологии и Института Биологии Казанского Государственного Университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц, 28 рисунков. Библиография содержит 221 наименование российских и зарубежных авторов.
Биологическая активность рибонуклеаз
За последние годы накоплены новые данные о роли РНКаз в жизненных процессах живых организмов. Если раньше этим ферментам приписывались в основном лишь неспецифические гидролизующие функции, то теперь становится ясно, что РНКазы играют центральную роль в метаболизме внутриклеточной РНК. Функции рибонуклеаз заключаются в деградации матричной и других видов РНК, превращении РНК-предшественников в их зрелые формы, продукции малых регуляторных РНК. Понимание важности этих ферментов привело к значительной активизации процессов их изучения. Известно, что в клетке может содержаться до 20 различных РНКаз, часто обладающих высокой специфичностью действия в отношении определенных последовательностей и структур. Рибонуклеазы могут быть представлены в клетке в виде отдельных белков, а также находиться в составе сложных супрамолекулярных комплексов где, функционируя вместе с другими ферментами, участвуют в процессах метаболизма РНК [Deutscher, Li, 2001].
Множественная роль процессов катаболизма не вызывает сомнений. Продукция мономерных низкомолекулярных блоков для синтеза высокомолекулярных биополимеров, вовлечение образующихся низко молекулярных субстратов в энергодающие аэробные и анаэробные реакции, устранение соединений с функциональными и структурными нарушениями - этот перечень важнейших функций системы реакций катаболизма дополняет сигнальная функция, реализуемая путем воздействия на транскрипцию, трансляцию и ферментативную активность ранее синтезированных молекул олигомерными промежуточными продуктами метаболизма. Накапливается все больше информации о том, что некоторые олигонуклеотиды, олигопептиды и олигосахариды, являющиеся продуктами деградации соответствующих полимеров, а также промежуточные продукты деградации липидов обладают регуляторно-сигнальными функциями [Тарчевский, 1992].
Особенно важной проблемой представляется регуляция клеточных функций продуктами деградации нуклеиновых кислот - олиго- и мононуклеотидами, поскольку она связана с особенностями сохранения и реализации генетической информации. Время жизни матричной РНК составляет всего несколько часов, что определяет количество белка, которое будет синтезировано. Синтез мРНК регулируется путем индукции и репрессии (в частности, катаболитной), синтез стабильных форм РНК ингибируется не только при недостатке предшественников, но и при накоплении в клетках высокофосфорилированных нуклеотидов [Шлегель, 1987]. Образующиеся при деградации РНК нуклеотиды служат строительным материалом для новых РНК, используется в синтезе коферментов и для активации различных соединений, а также составляют пул свободных нуклеотидов, изменяющийся в зависимости от возраста клетки и внешних условий [Астапович, 1979]. Увеличивающийся фонд свободных нуклеотидов у микроорганизмов служит показателем голодания культуры и образуется за счет деградации РНК [Choen, Kaplan, 1977]. Деградация РНК и выход нуклеотидов из клеток микроорганизмов являются показателями действия на клетки многих неблагоприятных факторов - действия антибиотиков, поверхностно-активных веществ, облучения, голодания и т.п. [Астапович, 1979]. Выход нуклеотидов из клеток дрожжей Tonda utilis индуцировали также белки, в частности, панкреатическая РНКаза и бычий сывороточный альбумин, что, по мнению автора, опосредовано генерализованными конформационными перестройками мембран [Конев, 1985].
Увеличение соотношения циклических нуклеотидов цГМФ/цАМФ считают выраженной тенденцией при дисдифференциации и интенсивной пролиферации животных клеток. При этом отмечено снижение активности деполимераз нуклеиновых кислот в быстро пролиферирующих тканях и опухолях [Акоев, 1988]. Образование особых кратных 180-200 Ьр олигонуклеосомных фрагментов ДНК эндонуклеазами, индуцируемыми повышением внутриклеточной концентрации Са2+ (ДНКаза I), снижением внутриклеточного рН (ДНКаза II), а также эндонуклеазами, активируемыми при поли(АДФ)-рибозилировании, отличает апоптоз от некроза [Manning, Patierno, 1996]. В клетках эукариот обнаружены быстро метаболизирующиеся олигорибонуклеотиды, которые могут регулировать клеточный метаболизм, переходя от одной клетки к другой. Предполагают, что такая роль короткоцепочечной внеклеточной РНК аналогична роли вторичных мессенджеров [Benner, 1988; D Alessio, 1993].
В целом значение конкретных реакций расщепления нуклеиновых кислот и роль, образующихся при этом определенных олигонуклеотидов, выяснены далеко не полностью. Например, в печени крыс идентифицировано 5 различных белков, каждый из которых обладает РНКазной активностью, приводящей к инактивации рибосом [Chen et ah, 1996]. Для клеток E.coli известно 8 отдельных 3 -5 экзорибонуклеаз, имеющих in vivo отчасти перекрывающиеся функции. Одного из ферментов деградации мРНК, РНКазы II или полинуклеотидфосфорилазы, достаточно для поддержания жизнеспособности, но инактивация обеих РНКаз приводит к смерти клетки [Deutscher, Li, 2001].
Значительный интерес представляет регуляция экспрессии генов олигорибонуклеотидами в ходе недавно открытого процесса РНК-интерференции, заключающегося в контроле стабильности клеточных мРНК за счет их взаимодействия со специфическими короткими двуспиральными РНК [McManus, Sharp, 2002]. Возможность целенаправленной регуляции активности генов посредством манипулирования процессом РНК-интерференции имеет большой терапевтический потенциал.
Иммуногенные эффекты рибонуклеаз
Оценка иммуногенных и иммунотоксических свойств перспективных терапевтических препаратов является одним из ключевых шагов внедрения их в лечебный процесс. Особенно серьезную проблему представляет собой потенциальная иммуногенность белковых препаратов, связанная со способностью иммунной системы инициировать формирование эффекторов, нейтрализующих антигенную чужеродность введенных соединений. Цитотоксичная РНКаза, вводимая в организм для терапии злокачественных новообразований, представляет собой вероятную мишень воздействия иммунной системы, которое может привести к изменению ее потенциальных эффектов, в том числе и показанных in vitro. В ряде случаев отмечено, что формирование иммунного ответа на введение в организм белкового препарата приводило к резкому снижению терапевтического эффекта последнего; кроме того, не исключена и возможность значительных осложнений, связанных с риском для жизни пациента [Chirino et ai, 2004]. Преимущество использования для терапии опухолей цитотоксичных РНКаз млекопитающих с ожидаемо меньшим иммуногенным действием не вполне очевидно, хотя считается, что близкородственные человеку белки менее иммуногены. Действительно, бычья панкреатическая РНКаза А после однократного введения мышам показала крайне низкую иммуногенность (титр антител 10-80) [Matousek et al., 2003]. В то же время установлено, что титр антител после однократной инъекции также бычьей BS-РНКазы был гораздо выше. Более того, ее иммуногенность на один-два порядка превышала таковую для филогенетически отдаленной РНКазы лягушки - онконазы (титр антител 1600-3200 против 80-320, соответственно).
Нельзя не отметить более высокую, чем у BS-РНКазы, иммуносупрессивнуїо активность онконазы, что проявлялось в ингибиции ей пролиферации митоген-стимулированных лимфоцитов в культуре, в то время как BS-РНКаза практически не проявляла подобных эффектов [Matousek et aL, 2003]. Известна и способность онконазы вызывать апоптоз активированных лимфоцитов [Halicka et aL, 2002].
Более высокая продукция антител к BS-РНКазе может быть объяснена большим размером ее отдельных мономеров по сравнению с онконазой (124 и 104 аминокислотных остатка, соответственно), а также тем, что BS-РНКаза представляет собой природный димер [Mazzarella et aL, 1993]. Однако по цитотокси ческой активности в отношении опухолевых клеток онконаза значительно опережает BS-РНКазу [Matousek et aL, 2003], что в сочетании с ее низкой иммуногенностью делает ее чрезвычайно перспективным препаратом щадящей противоопухолевой терапии. Интересным и перспективным представляется разработка новых щадящих противоопухолевых терапевтических средств на основе РНКаз бактерий в случае их низкой иммуногенности.
Иммуногенность РНКазы Bacillus intermedins считается очень слабой. Так, для получения антител к биназе эксперименты всегда проводились с помощью многократной иммунизации животных в присутствии адьюванта [Егоров с соавт., 1996]. Антитела определялись только в сыворотке крови животных, иммунизированных биназой в смеси с полным адыовантом Фрейнда [Куриненко, 1991].
Изучение влияния РНКазы Bacillus intermedins на гуморальный и клеточный иммунитет выявило, что при введении фермента увеличивалось количество антителообразующих клеток в животных, иммунизированных антигеном (эритроцитами барана), что свидетельствует об иммуностимулирующих свойствах биназы [Нехорошкова с соавт., 1988]. Максимальный стимулирующий эффект отмечался при введении фермента одновременно с антигеном через 24 и 48 часов после иммунизации. Установлено, что реализация иммуностимулирующего действия биназы осуществляется в основном благодаря ее действию на Т-лимфоциты, увеличивая количество зрелых лимфоцитов в иммунокомпетентных органах животных [Нехорошкова с соавт., 1988] и иммуностимулирующие эффекты данного фермента были более выраженными по сравнению с РНКазой 1 [Куриненко, 1991].
В низких концентрациях, не превышающих 10" мкг/мл, фермент индуцировал усиленное образование Е-рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, усиливало преципитацию, определяемую в реакции розеткообразования с эритроцитами человека [Kurinenko et al., 1998]. Высокие концентрации, напротив, снижали способность Т-лимфоцитов к розеткообразованию. В отношении В-лимфоцитов биназа проявляла супрессивное действие в любой из исследованных концентраций от 10"6 до 10" мкг/мл [Kurinenko et al., 1998]. Кроме того, установлено стимулирующее действие РНКазы Bacillus intermedins на клеточный иммунитет и образование неспецифических факторов защиты организма [Куриненко, 1991]. Важно отметить, что эффекты биназы по отношению к лимфоцитам человека зависят от каталитической активности фермента, и фотоинактивированная биназа не проявляла способности стимулировать Т-лимфоциты [Kurinenko et al., 1998]. На основании имеющихся фактов можно предполагать, что биназа в цитотоксических концентрациях, предполагаемых к использованию в противоопухолевой терапии, не будет проявлять себя как сильный антиген, однако это предположение нуждается в экспериментальной проверке. Кроме того, обобщение приведенных данных литературы позволяет нам обоснованно считать, что препараты на основе бактериальных рибонуклеаз могут разрабатываться в качестве цитотоксических агентов, вызывающих апоптоз-индуцирующее действие на малигнизированные клетки. В связи с вышеизложенным основное внимание в работе уделено исследованию свойств бактериальных РНКаз как возможных суперантигенов - индукторов поликлопального Т-клеточного ответа - и оценке их апоптогенного потенциала в отношении онкотрансформированных клеток в зависимости от молекулярных характеристик исследованных ферментов.
Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем ноле
Апоптические изменения клеток солидных опухолей (А549) выявляли методами флуоресцентной микроскопии и детектирования фрагментации ДНК с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле. Для визуализации ядер фиксированные метанолом клетки окрашивали бис-бензимидом 33358 (Hoechst).
Экспоненциально растущие клетки А549 метили 3Н-тимидином (0,45 мкКи/мл) производства Sigma и инкубировали с РНКазой в течение 24, 48 и 72ч. После центрифугирования клетки смешивали с 1% низкоплавкой агарозой (4 10 кл/мл) и помещали в холод. Застывшие гелевые пластинки в течение 12ч подвергали действию лизирующего буфера (2% N-лаурилсаркозина, 0.5М ЭДТА, 0.5мг/мл протеиназы К, рН 8) для разрушения клеток, трижды промывали ТЕ-буфером (ЮмМ Трис, 1мМ ЭДТА, рН 8) и помещали в кармашки агарозного геля. Электрофорез проводили согласно стандартным протоколам, описанным ранее, с использованием системы BioRad CHEF-DRIII [Vock et al. 1999]. В качестве маркеров использовали рестрикционные фрагменты ДНК Sachharomyces cerevisiae (от 0,24 до 2,2 Мб) и фага X (145,5; 97; 48,5Кб). Гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 р.г/мл) и фотографировали в ультрафиолете.
Перспективы применения белковых препаратов в терапии патологий человека требуют своевременной оценки их иммуногенной активности. Непосредственное измерение количества Т-лимфоцитов после введения белка в организм - редко практикуемая процедура, а традиционные модели на животных дают плохую корреляцию данных с результатами клинической иммуногенности и имеют ограниченные прогностические возможности в связи с межвидовыми различиями основного комплекса гистосовместимости и рецепторными комплексами Т-клеток [Chirino et at, 2004]. Эффективность иммунного ответа, главным образом, обусловлена популяцией CD8+ и CD4+ Т-клеток и сопровождается экспрессией на их внешней поверхности специфического активационного антигена CD69 [Simms, Ellis 1996], а также продукцией цитокинов, в частности, интерферона-гамма (у-интерферон) [Cherepnev et ah, 2004]. В связи с этим, анализ экспрессии популяциями CD8+ и CD4+ Т-клеток активационных маркеров позволяет адекватно оценить неспецифический иммунный ответ на действие чужеродных белков.
Индукцию неспецифического иммунного ответа под действием биназы определяли цитометрически на проточном цитометре FACSCalibur (США) по уровню экспрессии антигена CD69 и у-интерферона CD4+, CD8+ лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте фиколверографина (Pharmacia, Швеция) по стандартной методике [Воушп, 1968].
Лимфоциты ресуспендировали в полной питательной среде RPMI 1640 до концентрации 500000кл/мл. Растворы препаратов РНКаз в объеме ЮОмкл вносили в 5мл цитометрические пробирки, добавляли к ним 400мкл суспензии клеток. Образцы инкубировали 2ч при температуре 37С в атмосфере 5% СО2 в штативах под наклоном 5 после чего к ним добавляли 500 ил 10 иг/мл брефердина A (Sigma), специфически блокирующего секрецию у-интерферона клетками в среду культивирования. Пробы инкубировали еще 14ч, затем отмывали холодным PBS (4 С). Окрашивание клеток производили комплексом антител, коньюгированных с флуоресцентными красителями: anti-IFN-g-FITC, anti-CD69-PE, anti-CD3-PerCP, anti-CD8-APC, anti-CD-4-APC (BD,CUIA) как описано у Черепнева с соавторами [Cherepnev et ah, 2004]. В качестве стандартного индуктора неспецифического иммунного ответа применяли стафилококковый энтеротоксин Б (СЭБ) производства Sigma, обладающий суперантигенными свойствами [McCloskey et at, 2004], в концентрации 100нг/мл.
Математическую обработку результатов цитометрии проводили в программе Statistica 6.0 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в качестве критерия достоверности. При этом р 0.05 принимали за достоверный уровень значимости. Оценку среднеквадратичного отклонения результатов остальных экспериментов, а также сравнение двух групп данных проводили в программе MS-Excel. Среднеквадратичное отклонение не превышало 12%, за критерий значимости отличий между двумя группами данных принимали критерий вероятности р 0.05.
Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови
В исследовании роли характеристик молекул РНКаз, важных для цитотоксичности, достигнут определенный успех. Получены четкие доказательства необходимости наличия некоторого уровня каталитической активности для проявления цитотоксичности. Поэтому одним из определяющих цитотоксичность свойств РНКазы является ее способность избегать взаимодействия с цитозольным ингибитором РНКаз, блокирующим каталитические функции фермента [Leland, Raines, 2001].
Именно бактериальные РНКазы, в силу их филогенетической удаленности, не связываются с цитозольным ингибитором, который эволюционно предназначен для защиты клетки от действия собственных рибонуклеаз. В связи с этим свойством бактериальные РНКазы обладают несомненным преимуществом для разработки в качестве основы новых противоопухолевых препаратов, которая исторически начиналась с РНКазами животного происхождения , в частности, с РНКазы A [Leland, Raines, 2001]. Наши исследования показали, что среди микробных РНКаз высокотоксичными оказались ферменты с достаточным уровнем каталитической активности: биназа, ее мутант Lys26Ala, и катионные мутанты РНКазы Sa - 5К и 7К. Оказалось, что только те молекулы каталитически активных РНКаз, которые несут положительный заряд, способны к индукции токсических, генотоксических и апоптических эффектов. Ряд авторов ранее отмечал роль положительного заряда в цитотоксичности, при этом молекула РНКазы может быть катионной по природе, то есть как дикий тип фермента (онконаза [Saxena et al., 2003]), либо модифицированной генно-инженерным путем [Ilinskaya et al, 2002] или путем химической модификации [Futami et al, 2002].
Как взаимодействие РНКаз с клеточными компонентами приводит к апоптической гибели клетки, до сих пор до конца не установлено. На основе данных литературы мы составили сводную таблицу 6, отражающую современное представление о клеточных мишенях действия экзогенных РНКаз.
Фактически главной мишенью действия РНКаз является РНК, многообразие форм которой охватывает как связанные с белками РНК (рибосомные, информационные, РНК в составе рибонуклеопротеинов -сигнал-узнающих частиц, так и не связанные с белками транспортные РНК, малые интерферирующие и некодирующие микроРНК [McManus, Sharp, 2002; McManus, 2003].
Фермент-субстратные взаимодействия экзогенной РНКазы с клеточной РНК зависят от доступности РНК-содержащих компонентов клетки действию фермента. Информация о наличии РНК в составе клеточных структур неоднозначна, поскольку содержание РНК -динамический показатель, зависящий от внешних условий, стадии развития, клеточного цикла и других факторов. На сегодня одним из особенно привлекательных предположений является возможное участие РНКаз в регуляции процессов РНК-интерференции. Предполагают, что онконаза расщепляет малые некодирующие РНК (микроРНК, или miRNA), являющиеся антисмысловыми посттрансляционными репрессорами мРНК различных белков-регуляторов клеточного цикла [Ardelt et ah, 2003]. Поскольку последние представляют собой двуспиральные РНК, вклад каталитической активности в цитотоксические эффекты, вероятно, во многом будет связан с каталитической активностью РНКаз по отношению к дсРНК.
Наш вклад в расшифровку механизмов действия бактериальных РНКаз заключается в подтверждении роли клеточных мишеней, таких, как онкоген ras и кальций-зависимых калиевых каналов, в реализации токсических эффектов РНКаз. Нами осуществлена прямая регистрация апоптических изменений ряда клеток при действии цитотоксических бактериальных РНКаз (рис. 23-25, 27), а также непосредственно в живых клетках, обработанных ими, зафиксировано возрастание концентрации внутриклеточного кальция (рис.26).
С другой стороны, нами показано, что токсические, генотоксические и апоптогепные эффекты бактериальных РНКаз детерминированы главным образом катионными и каталитическими свойствами. Для проявления ферментом цитотоксичности он должен сохранять определенный уровень рибонуклеолитической активности и обладать положительным зарядом молекулы. Вероятно, именно катионность обуславливает избирательность действия исследованных ферментов по отношению к злокачественным клеткам, как это показано нами для биназы и ее мутанта Lys Ala на нормальных и малигнизированных клетках крови. Это связано с более высоким содержанием кислых гликолипидов и гликопротеинов на внешней поверхности клеточных мембран опухолевых клеток [Ran et al., 2002].
Поскольку в популяции CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов крови человека РНКаза Bacillus intermedins не стимулирует экспрессию активационных маркеров CD69 и у-интерферона, можно считать, что у биназы отсутствуют свойства индуктора поликлопального Т-клеточного ответа. Отчасти наш вывод подтверждается данными литературы об отсутствии иммуногенности фермента при однократном введении опытным животным [Куриненко, 1991]. Данные, полученные нами при изучении потенциальной иммуногенности биназы в цитотоксических концентрациях, индуцирующих апоптоз, определенно имеют практическое значение, еще раз подтверждающее реальную возможность разработки противоопухолевых препаратов на основе бактериальных РНКаз.
Результаты наших исследований позволяют считать катионные каталитически активные бактериальные РНКазы перспективными для создания новых средств щадящей противоопухолевой терапии, альтернативных классическим ДНК-повреждающим агентам, обладающим невысокой селективностью действия.
