Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ : 6
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Иммунитет в защите организма от злокачественных опухолей 16
Иммуноглобулины 19
IgG при неопластических процессах 33
Система комплемента 36
Комплемент при неопластических процессах 54
Взаимодействие системы комплемента с IgG 58'
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы 66
Методы 69
Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови человека 69
Диск-электрофорез 70
Определение концентрации белков 70
Гибридомная технология 71
Подсчет числа жизнеспособных клеток 77
Метод двойной радиальной иммунодиффузии (Оухтерлони) 77
Получение конъюгатов моноклональных антител 77
Иммуноферментный анализ 78
Определение констант диссоциации комплекса Clq-IgG 86
Реакция связывания комплемента с IgG в присутствии эритроцитов барана 87
2.2.11. Определение общей гемолитической активности
комплемента (СН50) 89
Определение гемолитической активности комплемента по альтернативному пути (АРН50) в присутствии кроличьих эритроцитов 90
Определение влияния IgG на АРН50 91
Оценка противоопухолевого эффекта по увеличению продолжительности жизни 91
Статистическая обработка результатов 92
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. Получение моноклональных антител 93
3.1. Получение моноклональных антител к иммуноглобулинам
человека и мелиттину 93
3.2. Получение моноклональных антител к
опухольассоциированному антигену СА-125 103
ГЛАВА 4. Взаимодействие Clq субкомпонента комплемента с IgG
больных хроническим лимфолейкозом, ходжкинскими,
неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы 110
Определение констант диссоциации комплексов Clq-IgG больных хроническим лимфолейкозом, ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы 113
Определение аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG больных хроническим лимфолейкозом в сравнении со здоровыми донорами 119
Определение реакции связывания комплемента и констант диссоциации IgG больных хроническим лимфолейкозом и здоровых доноров с Clq в присутствии сахарозы 123
Определение Clq, взаимодействующих с IgG больных хроническим лимфолейкозом и IgG здоровых доноров 126
Определение константы диссоциации комплекса Clq с лигандированным
фосфатидилхолином IgG и аффинности моноклональных антител
к различным антигенным детерминантам данного IgG 127
ГЛАВА 5. Активность альтернативного пути комплемента и влияние
на него IgG больных хроническим лимфолейкозом, ходжкинскими,
неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы 133
Оценка альтернативного пути в сыворотке крови больных хроническим лимфолейкозом, ходжкинскими, неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы и здоровых доноров 134
Определение содержания Clq, СЗ, СЗа, СЗ(Н20) и С4 в сыворотке крови больных ходжкинскими, неходжкинскими
лимфомами и раком молочной железы 138
5.3. Исследование влияния IgG больных хроническим лимфолейкозом,
ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы
и здоровых лиц на альтернативный путь активации комплемента 140
5.4. Исследование влияния IgG на спонтанный гидролиз компонента СЗ
при инкубации сыворотки крови больных хроническим лимфолейкозом.... 142
ГЛАВА 6. Конформационные изменения СЗ компонента комплемента
в процессе его спонтанного гидролиза при неопластических
процессах и состояниях «онкологического риска» 144
Конформационные изменения СЗ в процессе его спонтанного гидролиза при ходжкинских лимфомах 147
Конформационные изменения СЗ в процессе его спонтанного гидролиза при неходжкинских лимфомах 156
Конформационные изменения СЗ в процессе его спонтанного гидролиза при раке молочной железы 162
Конформационные изменения СЗ в процессе его спонтанного гидролиза у больных «группы онкологического риска» по раку молочной железы 168
Исследование корреляции между уровнем СЗ(НгО) и концентрацией опухолевого маркера — антигена СА-125 у больных раком яичников 172
ГЛАВА 7. Конформационные изменения СЗ в плазме крови
больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами,
раком молочной железы под влиянием химиотерапии 176
7.1. Конформационные изменения СЗ в плазме крови больных
с ходжкинскими лимфомами под влиянием химиотерапии 177
7.2. Конформационные изменения СЗ в плазме крови больных
с неходжкинскими лимфомами под влиянием химиотерапии 183
7.3. Конформационные изменения СЗ в плазме крови больных
раком молочной железы под влиянием химиотерапии 188
ГЛАВА 8. Конформационные изменения СЗ под влиянием иммуномодули-
рующих средств: эфирных масел Lavandula vera, Salvia solaria
и глюконатов Зсі-металлов. Изучение их противоопухолевых свойств 195
Исследование противоопухолевой активности эфирных масел Lavandula vera и Salvia solaria in vivo 196
Влияние эфирных масел Lavandula vera и Salvia solaria на
изменение уровня СЗ(НгО) в процессе инкубации сыворотки крови 199
Исследование цитотоксического, противоопухолевого и иммуномодулирующего действия глюконатов ЗсІ-металлов 210
Влияние глюконатов Зсі-металлов на изменение уровня
СЗ(Н20) в процессе инкубации сыворотки крови 218
ГЛАВА 9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 222
ВЫВОДЫ 236
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 238
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
APT - ароматерапия
ДМП - диффузная мастопатия
ИЛ - интерлейкин
ИФН - интерферон
ИФА - иммуноферментный анализ
МАК - мембраноатакующий комплекс
МКАТ — моноклональные антитела
МЭЛ - комплекс соединений Зё-металлов (двухвалентных металлов
Mn, Fe, Со, Си и Zn) с глюконовой кислотой
НХЛ - неходжкинские лимфомы
ОФД - ортофенилендиамин
ПХ - пероксидаза хрена
ПХТ - полихимиотерапия
РМЖ — рак молочной железы
РСК - реакция связывания комплемента
ТРА - торможение развития асцита
УМП - узловая мастопатия
УПЖ - увеличение продолжительности жизни
ФА - фиброаденома
ХЛ - ходжкинские лимфомы
ХЛЛ — хронический лимфолейкоз
ЭГТА — этиленгликольтетраацетат
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат
ABTS — 2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолин сульфонат)
АРН50 — гемолитическая активность альтернативного пути
BSA - бычий сывороточный альбумин
С — компонент системы комплемента
Clq - субкомпонент первого фактора комплемента
СЗ — третий компонент комплемента
СН50 - общая гемолитическая активность комплемента
Fab - вариабельный фрагмент иммуноглобулинов
Fc - постоянный фрагмент иммуноглобулинов
FcRn - неонатальные рецепторы IgG
FcyR - рецепторы IgG
FILA - система гистосовместимости
Ig - иммуноглобулины
IgA- иммуноглобулины класса А
IgG- иммуноглобулины класса G
IgM- иммуноглобулины класса М
IgE- иммуноглобулины класса Е
IgD- иммуноглобулины класса D
PBS - забуференный физиологический раствор
PBST - забуференный физиологический раствор с 0,05% твином 20
VBS - вероналовый буфер с добавлением Mg
VBS** - вероналовый буфер с добавлением Са2+ и Mg2+
Введение к работе
Актуальность темы
Неопластические процессы развиваются благодаря способности опухолевых клеток к «ускользанию» от иммунного надзора. Причины данного феномена пока до конца не понятны, хотя для его объяснения имеется множество концепций.
В настоящее время считается, что существует большое разнообразие механизмов «ускользания» опухолевых клеток от иммунологического контроля. Выяснение этих механизмов является одним из наиболее актуальных направлений современной биологии и медицины.
При развитии злокачественных новообразований у больных обнаруживаются нарушения иммунитета, затрагивающие практически все его звенья. От функционального состояния иммунной системы в значительной степени* зависит интенсивность развития, роста и метастазирования опухоли, длительность ремиссии, ряд клинических проявлений и эффективность защиты. организма от злокачественных опухолей в целом. Спонтанные ремиссии, появление метастазов лишь после удаления первичной опухоли или обнаружения опухолевых клеток указывают на активное состояние противоопухолево-го иммунитета [Иегер Л. и др., 1990; Барышников А.Ю., 2003; Абелев Г.И., 2004; Никулин Б.А., 2007]. Существенную роль при этом играют опухолевые маркеры, сывороточные антитела, белки системы комплемента.
Комплемент и антитела относятся к двум различным системам иммунной защиты организма: врожденному (неспецифическому) и приобретенному (специфическому/адаптивному), отличающимся и одновременно дополняющим друг друга, существующим в очень тесной взаимосвязи.
Иммуноглобулины, большая часть которых приходится на класс IgG, являются ключевыми макромолекулами приобретенного иммунитета, так как
они отвечают за распознавание чужеродных агентов и запускают иммунные реакции организма. Вместе с тем иммунный ответ инициируется и усиливается различными фрагментами компонентов системы комплемента, которая среди систем гуморального звена врожденного иммунитета обладает наиболее сложным и многогранным действием.
Комплемент в последнее время все больше рассматривается как важнейший регулятор адаптивного иммунитета, играющий существенную роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе, неопластических, а также механизмах иммунологической толерантности. Начальным этапом классического пути активации комплемента является присоединение к комплексу антиген-антитело Clq - субкомпонента первого фактора комплемента. Компонент СЗ, участвующий во всех путях активации комплемента и являющийся одним из центральных белков защитной системы человека, выступает в качестве связующего звена между врожденным и приобретенным иммунитетом [Sahu А. et al., 2001; Xin-pei Yu et al., 2004].
При патологии может происходить постсинтетическая модификация белков, вызванная не генетическими, а другими причинами, что было продемонстрировано еще Г.В. Троицким на примере альбумина [Троицкий Г.В., 1991]. Модификации, затрагивающие центральные звенья иммунитета, являются наиболее опасными. При этом особый интерес представляют не денату-рационные процессы, а тонкие конформационные переходы, не сопровождающиеся нарушением нативной структуры белка. Удобной моделью для таких исследований является спонтанный гидролиз компонента СЗ, в процессе которого происходит конформационная перестройка молекулы, обнажается тиоэфирная связь в а-цепи и образуется конформационная форма СЗ(Н20), инициирующая альтернативный путь активации системы комплемента.
В основе нарушения механизмов реализации противоопухолевой защиты организма может лежать изменение характера взаимоотношений между различными системами иммунитета и их составляющими, в том числе между
антителами и комплементом. Выявление этих закономерностей позволяет по-новому подойти к оценке патогенеза болезни и приблизить к разгадке феномена иммунной резистентности новообразований.
В силу выше изложенного, именно эти три молекулы были выбраны нами для исследований взаимодействия комплемента (Clq) с иммуноглобулинами (IgG) и конформационных изменений в процессе спонтанного гидролиза (СЗ) при неопластических процессах, которые способны приблизить к разгадке феномена иммунной резистентности новообразований.
Цель исследования:
Выяснить биохимические механизмы взаимодействия врожденного и приобретенного иммунитета на примере ключевых белков: субкомпонента комплемента Clq и иммуноглобулина G, а также конформационных изменений компонента комплемента СЗ в процессе спонтанного гидролиза при неопластических состояниях.
Задачи исследования:
Сравнить константы взаимодействия между субкомпонентом комплемента Clq и IgG при неопластических состояниях (хроническом лимфо-лейкозе, ходжкинских и неходжкинских лимфомах, раке молочной железы) и в норме.
Провести сравнительный анализ аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG больных хроническим лимфолейкозом и здоровых доноров.
Сравнить количество Clq связывающихся с IgG больных хроническим лимфолейкозом и здоровых доноров.
Оценить на модели IgG-фосфатидилхолин влияние лигандирования
на комплементфиксирующую функцию IgG и аффинность моноклональных антител к его различным антигенным детерминантам.
Оценить влияние IgG при изучаемых заболеваниях на альтернативный путь активации комплемента.
Оценить закономерности конформационных изменений СЗ компонента комплемента в процессе спонтанного гидролиза при инкубации сыворотки и плазмы крови больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы, а также «группы онкологического риска».
Исследовать взаимосвязь между уровнем конформационной формы СЗ компонента - СЗ(НгО) и опухольассоциированного антигена СА-125 у больных раком яичников до и после проведения курса химиотерапии.
Изучить конформационные изменения СЗ компонента у больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы на фоне программы химиотерапии.
Оценить влияние на конформационные изменения СЗ компонента иммуномодулирующих средств: эфирных масел Lavandula vera, Salvia solaria и глюконатов Зсі-металлов.
Научная новизна работы
Впервые проведен анализ аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG больных хроническим лимфо-лейкозом.
Впервые проведен сравнительный анализ констант диссоциации комплекса Clq-IgG до и после взаимодействия его с фосфатидилхолином и аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG после его лигандирования.
Впервые охарактеризованы конформационные изменения СЗ компонента комплемента в процессе его спонтанного гидролиза при инкубации
сыворотки и плазмы крови больных хроническим лимфолейкозом, с ход-жкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы, «группы онкологического риска» по раку молочной железы.
Впервые выявлена зависимость между изменением уровня конфор-мационной формы СЗ компонента комплемента СЗ(І20) и содержанием опухолевого маркера СА-125 в плазме крови больных раком яичников до и после проведения курса химиотерапии.
Впервые охарактеризованы конформационные изменения СЗ компонента под действием химиотерапии и иммуномодулирующих средств (эфирных масел Lavandula vera, Salvia solaria и глюконатов Зсі-металлов).
Получены новые штаммы гибридом, продуцирующие моноклональ-ные антитела к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека, пептиду мелиттину и опухольассоциированному антигену СА-125.
Впервые обосновываются биохимические причины изменений взаимодействия Clq с IgG и конформационных изменений компонента СЗ в процессе его спонтанного гидролиза при неопластических состояниях.
Научно-практическая значимость
Данные о взаимодействии Clq субкомпонента комплемента с IgG и конформационных изменениях СЗ компонента в сыворотке крови больных при неопластических процессах и состояниях онкологического риска имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов патогенеза заболеваний, для улучшения диагностики, прогноза и эффективности лечения.
Полученные в работе моноклональные антитела (Патенты РФ от 1993-1994, №№: 2002803, 2003679, 2003680, 2003681, 2003682, 2003683, 2003684, 2003685, 2003686, 2003687, 2008350, 2010856) могут быть применены для различных биохимических, биофизических, иммунологических, клинических исследований, создания диагностических тест-систем и лечебных препара-
тов.
Полученные результаты исследования могут помочь дальнейшему развитию и использованию научно-обоснованных методов борьбы со злокачественными заболеваниями.
Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе курсов биологической химии, биофизики, иммунологии, онкологии образовательных учреждений высшего медицинского образования и последипломной подготовки врачей.
Основные положения, выносимые на защиту
При неопластических процессах: хроническом лимфолейкозе, ход-жкинских и неходжкинских лимфомах, раке молочной железы происходит ослабление силы связывания между субкомпонентом комплемента Clq и иммуноглобулином G, выражающееся в увеличении константы диссоциации комплекса Clq-IgG.
Причиной снижения комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах является взаимодействие с Fc-фрагментами IgG метаболитов деструкции неопластических и других клеток - лигандов пептидной и липидной природы, проявляющих свойства катионов.
При неопластических процессах белок СЗ претерпевает модифика-ционные изменения, проявляющиеся в процессе его спонтанного гидролиза, обусловленные появлением в сыворотке крови большего (по сравнению со здоровыми донорами) количества нуклеофилов, способствующих его кон-формационному переходу в форму СЗ(Н20).
4. Изменение уровня конформационной формы СЗ компонента -
СЗ(Н20) в плазме крови больных раком яичников после курса химиотерапии
коррелирует со снижением концентрации опухольассоциированного антиге
на СА-125.
Под действием химиотерапии в процессе инкубации плазмы крови больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы наблюдается снижение уровня конформационной формы СЗ(НгО) в зависимости от числа курсов химиотерапии, которое отражает положительную динамику лечения.
Иммуномодулирующие средства (эфирные масла Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконаты Зсі-металлов) оказывают корригирующее и стабилизирующее влияние на изменение уровня СЗ(Н20).
Апробация диссертации
Материалы диссертации были доложены на республиканской конференции «Современные проблемы естествознания на стыке наук» (Уфа, 1998), 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 1999), XIX Всероссийском Чугуевском совещании по химии комплексных соединений (Иваново, 1999), Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2000), Международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности" (Томск, 2000), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции «Перспективные разработки науки и техники» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований - 2005» (Днепропетровск, 2005), Межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), Международной научно-практической конференции «Совре-
менные направления теоретических и прикладных исследований» (Одесса, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007), VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007).
Внедрение результатов работы
Полученные в диссертационной работе моноклональные антитела внедрены в научно-исследовательскую деятельность кафедры биохимии и лаборатории биотехнологии Крымского государственного медицинского университета им. СИ. Георгиевского, лаборатории молекулярной биологии и нано-биотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, отдела биофизики Института биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины. Результаты диссертации внедрены в учебный процесс и научную деятельность кафедры биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» и в практику работы отделения общей онкологии Башкирского Республиканского клинического онкологического диспансера.
