Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СТРУКТУРА И ЗАКОНОМЕРНОСТИ
ЭКСПРЕССИИ ИММУНОГЛОЕУЛИНОВЫХ ГЕНОВ .... 9
Строение молекулы иммуноглобулина 9
Источники разнообразия иммуноглобулинов . . 14
1.2.1. Генетические элементы, контролирующие
образование иммуноглобулинов 14
v-сегменты 16
J-сегменты 20
d -сегменты 23
С-гены 25
1.2.2. Разнообразие, возникающее в результате
объединения генетических элементов в
единый v -ген ig 27
Правило 12/23 30
Сочетания генных сегментов .... 32
Вариации последовательности на участке объединения генных сегментов 35
Неканонические варианты рекомбинации генных сегментов 38
1.2.2.5. Соматические мутации v-генов . . 39
1.2.3. Комбинаторика Н- и ь-цепей как возможный
источник разнообразия иммуноглобулинов . 44
1.2.3.1. Избирательность объединения Н- и l -
цепей 1(з 45
Стр.
1.2.3.2. Избирательность формирования анти
генной структуры иммуноглобулинов . . 50
1.2.3.3. Избирательность формирования АСЦ ... 53
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ 63
Животные 63
Иммунизация животных 63
Получение иммуносорбентов 64
Получение антител к v- и С-районам иммуноглобулинов мыши 64
Иодирование белков 66
Радиоиммунологические методы 66
Выделение иммуноглобулинов . 67
Полипептидные цепи иммуноглобулинов 68
Получение рекомбинантных иммуноглобулинов в растворе 69
Фракционирование нормальных ь-цепей ig мыши 69
Условия культивирования клеток 69
Слияние лимфоидных клеток 70
Отбор и клонирование антитело-продуцирующих клеточных популяций 71
ГЛАВА Ш. АССОЦИАЦШ l -ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В РАСТВО
РЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ Н-ЦЕПЯМИ 72
Прямая сорбция l -цепей иммуноглобулинов на сорбенте с фиксированной Н-цепыо 73
Конкурентное взаимодействие l-цепей с фиксированной Н-цепью 78
Выводы 85
Стр. ГЛАВА ІУ. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ v-
ДОМЕШВ МИЕЛОМНОГО ЕЕЛКА M0PC-2I РЕКОМВИ-
НАНТНЫШ ЖМУНОГЛОЕШНАМИ 86
Антигенная структура v -доменов ig -21 .... 86
Нативность рекомбинантных иммуноглобулинов . . 88
Антигенная структура v -доменов рекомбинантных иммуноглобулинов ..... 93
4.4. Выводы 104
ГЛАВА У. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЩЩОТИПЙЧЕСКОИ СТРУКТУРЫ И
АНТИТЕЛЬЮЙ АКТИВНОСТИ ГИБРИДОМНОГО ЕЕЛКА ig
В25 РЕКОМБШАНТНЫМИ ИШШГЛОЕУЛИНАМИ .... 104
5.1. Антигенная структура нативного и рекомбинант-
ного ig-B2 104
Антигенная структура v -доменов рекомбинантных ig 107
Антиген-связывающая активность рекомбинантных
ig 115
5.4. Выводы 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122
ВЫВОДИ 129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
Введение к работе
Выяснение источников разнообразия иммуноглобулинов ( ig ) является одной из центральных проблем иммунологии. Многочисленные исследования организации и функционирования генетического материала, кодирующего тяжелые (Н) и легкие ( l) цепи ig высших животных позволяют назвать ряд важнейших источников этого разнообразия, достигающего величины
7 8 10-10 различных молекул ід для индивидуального организма.
Такими хорошо изученными, но не охарактеризованными количественно (то есть по относительному вкладу в наблюдаемое разнообразие ig ) являются следующие факторы: множественность наследуемых генетических сегментов, ненаследуемые варианты, возникающие при объединении этих сегментов в генные блоки, соматические мутации в указанных генных блоках. В то же время мало неисследованным остается потенциально наиболее мощ- \. ный источник разнообразия ig- свободная комбинаторика Н-и l -цепей. Хорошо известно, что антиген-связывающий центр (АСЦ) молекулы ig создается.в результате взаимодействия Н-и l -цепей. Если бы все сочетания Н- и l-цепей давали функциональные АСЦ, то разнообразие ig определялось бы как про-.изведение вида Н х ь , где Н и l-разнообразие одноименных полипептидов данного организма.
Если в действительности не все сочетания Н- и l-цепей реализуются в виде функционально активных молекул ig , то такая избирательность может быть связана со следующими обстоятельствами: I) не все полипептиды способны объединяться в молекулу ig ; 2) не все полипептиды формируют при объеди-
нении пространственную структуру, характерную для ig ; 3) не во всех сочетаниях полипептидов при объединении образуется функциональный АСЦ ig . Работы, непосредственно посвященные исследованию первого из перечисленных критериев избирательности, практически отсутствуют. Исследования вто-\ рого и третьего критериев дают противоречивые результаты, так как в совокупности изучено всего несколько десятков сочетаний полипептидов, а эта выборка явно недостаточна для
оценки одного из основных источников генерации 10 молекул
Ig .
В данной работе применен принципиально иной подход: вместо увеличения выборки за счет привлечения большого числа индивидуальных ig мы получали рекомбинантные ig с использованием пула Н- и l -цепей нормальных ig сыворотки, представляющих все разнообразие соответствующих полипептидов организма.
Для выявления избирательности объединения Н- и ь-цепей ig (первый критерий) мы исследовали взаимодействие индивидуальной Н-цепи миеломного ig мыши с пулом нормальных L-цепей ig сыворотки. Результаты этого исследования изложены в Ш главе настоящей работы. Анализ избирательности ассоциации полипептидов ig включает решение двух задач: I) выбор условий и снятие характеристик реакции объединения Н- и ь_ цепей; 2) количественная оценка доли нормальных ь-цепей, способных взаимодействовать с индивидуальной Н-цепыо.
Второй критерий избирательности был использован при исследовании формирования уникальной пространственной структу-
ры рекомбинантными ig , содержащими миеломную цепь и пул нормальных цепей ig. Результаты этого исследования изложены в ІУ главе данной работы и включают решение трех экспериментальных задач: I) получение и характеристика антител к уникальным антигенным детерминантам v-домена миеломного ig ; 2) получение гетерологичных рекомбинантных молекул состава HnLgJ 3) определение доли нормальных полипептидов, способных сформировать тестируемую структуру v -доменов.
I глава данной работы посвящена исследованию рекомбинантных ig, содержащих Н- и l -цепи моноклонального антитела к фибронектину человека. Использование полученного нами гиб-ридомного ig известной специфичности позволило в этой части работы применить сразу 2 критерия оценки рекомбинантных ig -пространственную структуру v -доменов и активность АСЦ.
Полученные результаты свидетельствуют об избирательности взаимодействия полипептидных цепей по всем трем использованным критериям и позволяют отвергнуть предположение о свободной комбинаторике Н- и l-цепей ig .
Гибридома, использованная нами как объект для изучения моноклонального ig с определенной структурой и активностью, имеет также практическую ценность как источник моноклональ-ных антител заданной специфичности. Получение гибридом к фибронектину человека является основой для разработки методов количественной оценки содержания в плазме крови и тканях этого белка, играющего ключевую роль в заживлении ран, опухолевом росте, эмбриогенезе и, возможно, при ожоговой болезни и атеросклерозе.
Научная новизна данной работы заключается в количественной характеристике одного из источников разнообразия ig . Практическая же ценность работы состоит в освоении перспективного метода биотехнологии - гибридомной техники, и получении с помощью этого метода моноклональных антител к фибронектину человека.
ГЖВА І
СТРУКТУРА И ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ИММУН0ГЛ0Б7ЛИН0ШХ
ГЕНОВ
ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ
І.І. Строение МОЛекуЛЫ хд
В настоящем разделе будут даны лишь те сведения о структуре ig , которые необходимы для изложения материала о структурных генах ig .
Разнообразие молекул ig в сыворотке крови млекопитающих оценивается величиной 10 . Объединение І(з в единое семейство белков основано на их функциональном и структурном родстве.
ig обладают антительной специфичностью, т.е. способностью взаимодействовать с антигенами - чужеродными для организма веществами - и многомиллионное разнообразие молекул ig связано прежде всего с их специфичностью как AT. Число генетических элементов, контролирующих образование AT, со-ставляет не более, чем 10 , и ниже будет показано, как из столь малого числа генных сегментов образуется столь большое число молекул AT.
Общие структурные свойства, характерные для всех молекул AT, состоят в следующем (рис. I) ( I ):
I. Молекула состоит из четырех полипептидов: двух L -цепей и двух Н-цепей;
Н- и l-цєпи имеют существенные отличия в первичной структуре, если их сравнивать между собой, но обе Н-и обе ь-цепи в составе индивидуальной молекулы попарно идентичны;
В функциональном отношении каждую полипептидную цепь молекулы AT можно разделить на две части: вариабельную (v) и постоянную (С). К v-части относятся II0-I20 n -концевых остатков полипептидных цепей, остальные остатки входят в С-часть цепи;
В пределах v -части выделяются три района, которые носят название гипервариабельных и обозначаются римскими цифрами: I, П и Ш, считая от n -конца. Именно в этих районах сосредоточены аминокислотные остатки, участвующие в построении антиген-связывающего центра (АСЦ);
5. v-часть l -цепей можно разбить на два сегмента:
v-сегмент и j-сегмент; v -часть Н-цепей можно разбить на
три сегмента: v-, d- и j -сегменты. Эти сегменты были вы
делены при анализе характера аминокислотных замен, но за
тем оказалось, что каждый из этих сегментов кодируется от
дельным участком ДНК. Ш гипервариабельный участок ь-цепи
создается комбинацией v- и j -сегментов, а в построении Ш
гипервариабельного участка Н-цепи участвуют v-, d- и j-
сегменты;
6. Полипептидные цепи молекулы ig имеют доменную ор
ганизацию. Каждый домен содержит около НО аминокислотных
остатков, одну внутрицепьевую дисульфидную связь; все доме
ны имеют определенную гомологию в первичной структуре и
сходную пространственную организацию. Гипервариабельные
"ОЕЕЖ
l_s-s—J I
U5-125
h nh~JJh|
s-s
1 D -125
H MH
А І 'ні Ь f
S—S
YA U ?
NHfl
s—s«
s-s
s—s-
>S"-S
s-s
.450
J-COOH
s—s«
'S-S
-c-J L—s —
^0 j-Cfl
ip.
CH3 J-COOH
s—s
S-S"
L.?-tJ L—s~
Рис. I. Схема молекулы иммуноглобулина класса
l - легкие полипептидные цепи, Н - тяжелые полипептидные цепи (цифрами обозначены положения аминокислотных остатков); v_ и v - вариабельные сегменты; j - j -сегмент; d - D-сегмент; с_ -постоянный домен l -цепей; C-pjI, Сд2 и С^З - постоянные дс Н-цепей; ШР - шарнирный участок; s-s -дисульфидные связи; в пределах v -области
заштрихованы места локализации гипервариабельных участков, определяющих структуру АСЦ.
участки образуют пространственно сближенные петли;
Существует два типа l -цепей: каппа (X) и лямбда (А); различия в аминокислотной последовательности между Х- и ^-цепями составляют около 60%. У- и А-гены локализованы на разных парах аутосом (2,3);
В отличие от l-цепей, Н-цепи могут не отличаться по v -части, но различия в строении их С-частей достигают 70%. По характеру аминокислотной последовательности С-части подразделяются на 5 классов, обозначаемых: ідм, igA, igG,
igD и ідЕ . Соответствующие Н-цепи обозначаются греческими буквами: м, <*, f, & и . В пределах igG класса молекул выделяются четыре подкласса. Если различия между классами составляют 40-70%, то различия между подклассами igG не превышают 10%. Из рис. I видно, что С-часть Н-цепи ^-клас-са содержит три Си-домена, И -цепь содержит на один домен больше. Возможность существования разных классов или подклассов AT, имеющих одну и ту же v-часть, объясняется тем, что все гены Н-цепей локализованы на одной и той же хромосоме;
9. Антиген-связывающий центр молекулы AT строится бла
годаря взаимодействию двух полипептидных цепей - одной L -
цепи и одной Н-цепи. Естественно, что основную роль в пост
роении АСЦ играют гипервариабельные участки обеих цепей.
Тетрамерная молекула AT содержит два идентичных АСЦ;
10. Объединение Н- и l-цепей в тетрамерную молекулу
не контролируется генетически. Образование Н- и і» -цепей
определяется разными генами, трансляция мРНК идет с разных
- ІЗ -
полисом, и образующиеся полипептиды спонтанно объединяются в цитоплазме;
II. Молекула ig , крупного глобулярного белка, может выступать в роли антигена. Различают 3 типа антигенных детерминант молекулы ig : изотипы, аллотипы и идиотипы. К изотипам относятся маркеры, присутствующие на 1(? всех особей данного вида. Как правило, они локализованы на С-доме-нах и соответствуют классам и подклассам Н-цепей и типам l -цепей. Ряд авторов применяют это обозначение и для маркеров v-подгрупп Н- и ь-цепей, представляющих наследуемые варианты, общие для данного вида. К аллотипам относятся антигенные детерминанты, присутствующие на ig одних особей данного вида, но отсутствующие у других; эти маркеры выявлены как для v -, так и для С-доменов Ig и кодируются ал-лельными генами. Идиотипические детерминанты локализованы исключительно в v -доменах ig, причем либо непосредственно в АСЦ, либо в прилежащих участках, и многие из них имеют сложную конформационную природу, так что их экспрессия I зависит от взаимодействия Н- и l-цепей ig . Определенные \ идиотипы связаны, как правило, с AT определенной специфичности. Идиотип представляет собой комплекс индивидуальных антигенных детерминант - идиотопов, поэтому в принципе возможны количественные различия в экспрессии идиотипов.
Более 25 лет назад Бернет сформулировал гипотезу: "одна клетка - одно антитело" ( 4 ). Гипотеза блестяще подтвердилась, но только совсем недавно стал понятен молекуляр-но-генетический механизм такой узкой специализации В-клет-
ки: выяснилось, что в индивидуальной лимфоидной клетке из многих сотен генов ig активен, как правило, только тот минимальный набор генов, который необходим для синтеза одной Н- и одной ь_цепи. Разнообразие же молекул 1(з , рав-
ное 10 , создается за счет того, что в разных лимфоидных клетках активируются разные гены ig и, следовательно, популяция лимфоидных клеток гетерогенна по специфичности.
1.2. Источники разнообразия ig
I.2.I. Генетические элементы, контролирующие образование 1?
Б верхней части рис. 2 дано схематическое изображение генетических элементов, контролирующих образование ig . Генными сегментами мы будем называть участки ДНК, находящиеся в неперестроенном, недифференцированном состоянии. Как станет ясно из дальнейшего изложения, "собранный" v -ген ig образуется путем слияния на уровне ДНК далеко отстоящих друг от друга участков. Слияние этих участков происходит только в лимфоидных клетках, а в клетках печени, почек и других тканей, как и в эмбриональной ДНК, генные сегменты ig существуют разрозненно.
v -геном l -цепей мы будем называть ген, собранный из v - и J-сегментов, a v-reHOM Н-цепей - ген, собранный из v-, d- и J -сегментов. С-гены в процессе дифференцировки лимфоидных клеток перестройкам на уровне ДНК не подвергаются.
т:
v ^ J
дїишадв-.-'-Ліи
ш
ЛЕПНИН -111
И
V| J3 С3 Jj С| V2 ^г ^2 ^4 ^4
н.__E-i-E-B-L-B-J И , ,П И Г I П Г I Р ..LEL,
, J /* 6 85И!2Ьї2оЄа
і вяпппп інші im їй іие нп иппрнп ,
РГНЕФН ІИИ'ІЖМ ИИ ПР РРРРПН,
Рис. 2. Гены иммуноглобулинов мыши в эмбриональном (А) и
дифференцированном (Б) состояниях. Н-, Х- и >гены находятся на негомологичных аутосомах. Объединение генных сегментов и экспрессия v -генов происходит в дифференцированной (Б) В-клетке только на двух хромосомах из шести. уЦ, &, р> р, #2Ь, $2а, Є,<*. - С1Г гены соответствующих классов.
I.2.I.I. v -сегменты
v -сегменты контролируют образование n-концевых участков полипептидных цепей вплоть до 95 остатка для Х-Чепеи ( 5,6 ),(рис. 3), до 98 остатка - для Х-цепей ( 7,8 ) и до 99-100 - у Н-цепей ig мыши ( 9,10 ) (рис. 4). Длина v -сегмента полипептида может варьировать за счет вставок и делеций, и здесь приведены усредненные величины. Отсчет остатков ведется с N-конца зрелой цепи, возникающей, когда от первичного продукта трансляции отщепляется гидрофобный лидерный пептид.
В отличие от однозначности данных о размерах и первичных структурах v -сегментов, вопрос о числе v -сегментов до конца не решен. Все же имеются данные, позволяющие дать примерную экстраполяционную оценку их числа. Эта экстраполяция основана на следующих экспериментальных результатах. Исследование аминокислотной последовательности нескольких сот миеломных Х-цепей мыши позволило выделить примерно 50 семейств - так называемые вариабельные подгруппы ( II ). При анализе аминокислотной последовательности учитывались только остатки остова полипептидной цепи, лежащие вне гипервариабельных участков. Для каждой подгруппы имеется характерная аминокислотная последовательность, и в пределах подгруппы различия между полипептидами невелики, тогда как между подгруппами различия достигают 50%. Уже из анализа бел- V ковой структуры стало ясно, что полипептидные цепи каждой подгруппы должны контролироваться независимыми генными сег-
-4 -З 95и 108 109 220
ьч і>—<
Рис. 3. Ген l -цепи в дифференцированном состоянии.
Широкой полосой обозначены экзоны, тонкой линией -интроны. l-экзон, контролирующие! структуру сигнального пептида, отсутствующего у зрелой l -цепи, v, j - одноименные генные сегменты в составе v -гена; С - С-ген.
Цифрами под рисунком даны предельные размеры интронов в парах оснований. Цифры над рисунком показывают положение аминокислотных остатков полипептидной цепи.
Полукружиями обозначены сигнальные последовательности для сплайсинга.
Da с
Рис. 4. Ген Н-цепи в дифференцированном состоянии.
Широкой полосой обозначены экзоны,
тонкой линией - интроны.
l- экзон сигнального пептида; v, d и j -'одноименные генные сегменты в составе объединенного v -гена; G - С-ген.
Цифры под,-рисунком показывают положение аминокислотных остатков зрелой полипептидной цепи.
ментами, и, следовательно, минимальное число v^ -сегментов - 50. На самом деле это число существенно выше, что стало ясно из опытов по гибридизации нуклеиновых кислот. В качестве гибридизациоиного зонда используют или кДНК, синтезированную на основе индивидуальной мРНК, или клонированный геномный v-сегмент. Выяснилось, что при гибридизации индивидуального vx-сегмента с рестрикционными фрагментами эмбриональной ДНК единственный гибридизующийся фрагмент выявляется в редких случаях ( 12 ), наиболее часто одна проба выявляет от 4 до 8 ( 13,14,15,16,6,17,18 ), иногда до 13 ( 19 ) фрагментов, причем неродственные зонды дают неперекрывающиеся картины. Если среднее число генов, контролирующих Х-цепи одной подгруппы, принять за 6, то общее число наследуемых v -сегментов в геноме мыши составляет 300 ( 20). Сходная величина была получена нами при анализе количественного содержания белков vx 15 подгруппы в пуле нормальных ig мыши ( 21 ).
Попытки определить сходным способом число наследуемых v-сегментов других семейств дают несколько противоречивые
оценки: от 50 ( 22 ) до 160 ( 23 ) v -сегментов мыши; 80
Vjj-сегментов человека ( 22 ), от 25-30 (24 ) до 50 ( 25 ) vx-сегментов человека.
Расстояние между соседними v -сегментами в эмбриональной ДНК составляет в среднем 15 000 пар нуклеотидов ( 26 ), для vx-сегментов мыши колеблется от 7 000 до 21 000 пар ( 19 ). В тех случаях, когда удавалось выделить фрагменты ДНК, несущие одновременно 2 или более v-сегментов, неизмен-
но оказывалось, что соседние сегменты принадлежат к одной подгруппе и имеют существенную гомологию не только в своей структурной части, но и в межгенных участках ( 27 ). Из этого следует, что v-сегменты одной подгруппы собраны в кластер (рис. 5), как это показано для vx2i подгруппы мыши: 6 сегментов на участке 90 000 пар нуклеотидов ( 19 ). Предполагается, что v-сегменты одной подгруппы возникли путем тандемных дупликаций одного исходного предкового гена, а их сходство между собой не только в кодирующих, но и в окружающих участках позволяет им путем рекомбинации обмениваться генетическим материалом ( 28,29 ), увеличивая тем самым разнообразие v-сегментов за счет рекомбинантных структур. В то же время реальное разнообразие v -сегментов может быть заметно меньше их количества, физически присутствующего в геноме: среди наследуемых сегментов довольно часто встречаются псевдогены, несущие терминирующие кодоны в смысловой части, либо имеющие другие дефекты. По некоторым оценкам псевдогены могут составлять до 40% наследуемого репертуара vH-сегментов ( 29 ).
1.2.1.2. j-сегменты
На уровне полипептидной цепи J -сегмент (от английского Joining ) объединяет v -сегмент с С-районом цепи (рис. I). На генном уровне J-сегменты представляют собой отдельно расположенные участки ДНК (рис. 2 и 5). Их расстояние от комплекса v-сегментов неизвестно, но по отношению к С-генам их положение точно локализовано. Ближайший к С-
^^
h-!
Рис. 5. Генетические элементы Х-Цепеи иммуноглобулинов мыши.
l - лидерный экзон v -сегмента. Гомологичные v -сегменты собраны в подгруппы.
Черные полукружия - сигнальные участки рекомбинации v- и J -сегментов. Белые сигналы для сплайсинга. Ген Е 1 подгруппы и J^3 - псевдргены из-за отсутствия сигналов рекомбинации и сплайсинга, соответственно.
гену J-сегмент Х-цепей мыши расположен на расстоянии 2,6 тысячи пар оснований, а для Н-цепей ig мыши расстояние между Jn - и Си - составляет 6,5 тысяч пар ( 30,31 ).
J-сегментам присвоены порядковые номера в направлении 5'—*3', т.е. ближайший к С-гену j-сегмент будет иметь наибольший номер (рис. 5).
J-сегменты l -цепей кодируют участок полипептидной цепи размером в 13 аминокислотных остатков. Длина J -сегментов остается неизменной для всех исследованных видов (мышь, крыса, человек) и для обоих типов l-цепей ig мыши, но если у Х-цепей J -сегмент полипептидной цепи охватывает аминокислотные остатки с 96 по 108 ( 14,32 ), то у Л-цепей - с 98 по НО ( 7,33,341). Расстояние между J-сегментами Х-цепей составляет в среднем 300 пар оснований . ( 30 ).
Общее число J -сегментов Х-цепей ig мыши равно 5, и один из этих сегментов относится к псевдо-генам (рис. 5) ( 30,35 ). Для Х-цепей ig человека известно 5 J -сегментов, причем псевдо-гены отсутствуют (36 ), а для Х-цепей ig крысы выявлено 8 J-сегментов, из которых два псевдогена ( 37 ). Консервативными у разных видов являются не только размеры J-сегментов и расстояния между ними, но и последовательности структурной части: гомология мевду J-сегментами мыши и крысы составляет 92% (37 ), а мыши и человека - 82% ( 38 ).
В отличие от единообразия размеров и межгенных расстояний J-сегментов Х-цепей, J -сегменты Н-цепей имеют по
обоим признакам существенные отличия. Известно 5 JH-cer-ментов 1(з мыши, из них: один - псевдо-ген, два - кодируют участок Н-цепи размером в 15 аминокислотных остатков и два - в 17 остатков ( 39 ) (рис. 6). Еще большее разнооб- разие наблюдается среди JH-сегментов ig человека (рис.7). Здесь из 9 JH-сегментов три относятся к категории псевдогенов, сегменты л и 2 кодируют участок цепи размером 17 остатков, J3 и 4 - 15, J5 - 16 и J6 - 20 ( 40 ). Возможно, что большее разнообразие JH -сегментов по сравнению с JL связано с тем, что JH -сегменты вносят гораздо больший вклад в построение АСЦ, чем JL.
Как было сказано выше, Ш гипервариабельный участок строится путем объединения v_ и j '-сегментов для l -цепей и v~ , D_ и J-сегментов у Н-цепей, но при этом JL-сегменты "вкладывают", как правило, только один кодон в построение АСЦ, тогда как JH -сегменты - от 4-х до 6-ти кодонов ( 39 ).
1.2.1.3. D-сегменты
d-сегменты как участки ДНК, кодирующие определенные отрезки Н-цепей ig , были обнаружены только в 1981 г. в результате целенаправленных поисков ( 41,42 ). Их поиск был начат по той причине, что сопоставление структуры определенных эмбриональных v- и J-сегментов с аминокислотной последовательностью Н-цепей выявило нехватку участка ДНК, который должен был бы кодировать большую часть Ш гипервариабельного участка этих Н-цепей ( 42 ). Другими
словами, суммарная нуклеотидная последовательность v - и J-сегментов не давала полной последовательности v -области Н-цепи. Исходя из этого, предположили, что существуют отдельные генетические элементы, контролирующие образование небольшого по размеру пептида, и этот пептид играет важную роль в построении АСЦ, так как целиком входит в Ш гипервариабельный участок. Основное отличие d -сегментов от остальных генетических элементов ig состоит в том, что ни один из р-сегментов не способен реализоваться в последовательность аминокислот в том виде, как он существует в эмбриональной ДНК: это следует из размеров d -сегментов. К настоящему времени установлена нуклеотидная последовательность 12 D-сегментов ("43. ), и, по-видимому, существуют еще, как минимум 2 d-сегмента Н-цепей ig мыши. Все D-сегменты можно разбить на три семейства, которые в своей структурной части имеют длину в 10, II и 23 пар оснований, т.е. ни в одном случае нет числа, кратного трем. Более того, на уровне полипептидной цепи длина d-сєгмєнтов может достигать 9 аминокислот, но может состоять и из одного аминокислотного остатка. Сейчас уже ясно, что о -сегменты наиболее подвержены генным перестройкам и способны объединяться не только с v- и j-сегментами Н-цепей, но и между собой. В настоящее время известные эмбриональные d -сегменты ig мыши точно картированы и секвенированы (рис. 6). Показано, что они занимают участок ДНК длиной 80 т.п.н., расположенный непосредственно к 5' от JH -кластера, и находятся в эмбриональной ДНК в той же ориентации, что и JH-cer-
менты ( 43 ). Расстояние между соседними d -сегментами колеблется от 3 до 20 т.п.н. Наименее удаленный от J -кластера d-сєгмєнт расположен всего в 0,7 т.п.н. к 5' от -1 -сегмента ( 42 ).
1.2.1.4. С-гены
С-гены контролируют образование постоянных частей ь-и Н- полипептидных цепей ig . Из самой номенклатуры понятно, что С-часть цепи в пределах данного типа, класса или подкласса ig остается неизменной по своему строению. Например, все варианты X-цепей имеют одну и ту же С-конце-вую половину полипептидной цепи (остатки 109-215),и в соответствии с этим в геноме мыши, крысы и человека обнаружен единственный С -ген ( 38,44,45 ) (рис. 2). С-гены ъ -цепей хд не содержат интронов и не подвергаются сплайсингу, а также не претерпевают никаких перестроек в процессе дифференцировки лимфоидных клеток. В отличие от Х-генов, Х-гены не единичны: выявлено 4 Сч-гена мыши ( 46 ) и не менее 6 - в ДНК человека ( 45,47,48 ). Гены Х- и X-цепей, как уже упоминалось, локализованы на разных негомологичных аутосомах, а в генных перестройках могут участвовать только сегменты внутри одной хромосомы; в результате Х- и А-цепи используют неперекрывающиеся репертуары v- ж J-сегментов, так что их могішо отличать не только по С-, но и по v-районам.
В отличие от этого, Н-цепи, принадлежащие к различным классам и подклассам, могут иметь одну и ту же v-часть
(49,50,51). Это объясняется тем, что все Си-гены локализованы на одной и той же хромосоме, и на этой же хромосоме расположены vH-, jr- и d-сегменты (рис. 6). В процессе диф-ференцировки лимфоидных клеток одни и те же генетические элементы, формирующие vH-reH, могут проявляться в сочетании с различными Си-генами.
Указанное различие между CL- и Стт-генами является не единственным: Сд-гены, в отличие от с -, имеют экзон/интрон-ную структуру, характерную для генов эукариот и, кроме того, имеют специальные, так называемые мембранные экзоны, что приводит к существованию Н-цепей в виде двух форм - мембранной и секретируемой ( 52,53,54 ). Порядок расположения Си-генов ig мыши в эмбриональной ДНК является следующим (в скобках указаны расстояния в т.п.н.):5'-А-/4,5/- -/55/- W3-/34/-- JC1-/21/- Ц 2 ь-/15/- Ц 2а-/14,5/- * -/12,5/- Є -3' ( ЗІ, 52,55, 56 ). Предполагается, что исходный предковый ген ig кодировал I домен, и затем путем тандемных дупликаций с последующей дивергенцией возникло все семейство генов ig (57). Их четкая доменная организация позволяет обмениваться генетической информацией путем рекомбинации целых доменов, что, по-видимому, и привело к возникновению различных классов и подклассов. Появление новых классов и подклассов важно в функциональном отношении по следующим причинам. С-части полипептидных цепей не участвуют в построении АСЦ, но выполняют важные эффекторные функции: способность проникать через плацентарный барьер, фиксироваться на определенных типах клеток, связывать комплемент и т.д., и по своим эффекторным
свойствам разные классы ig существенно отличаются ( I ). Именно поэтому для организма вовсе не безразлично, к какому классу ig принадлежат AT. Например, AT igA класса способны поступать в различного рода секреторные выделения, и их наличие в молоке кормящей матери обеспечивает новорожденного иммунитетом. AT igE класса имеют специфическое сродство к поверхности тучных клеток, и взаимодействие AT этого класса с антигеном приводит к аллергическим реакциям.
Таким образом, способность одного и того же vH -гена объединяться с разными С^-генами вносит дополнительное разнообразие в иммунный ответ.
Данные, приведенные в настоящем разделе, показывают, что отличительным свойством ig является множественность кодирующих их генных сегментов, что может иметь непосредственное отношение к генерации разнообразия ig. Эти потенции генетического материала ig реализуются в ходе генных перестроек, как будет показано ниже.
1.2.2. Разнообразие, возникающее в результате объединения генетических элементов в единый v-ген ig
Принципиальное отличие генов ig от всех остальных генов эукариот состоит в том, что функционирующий ген ig собирается из отдельных участков ДНК. Ферменты, занимающиеся переносом генных сегментов ід,пока не выделены, но известны последовательности ДНК, которые можно рассматривать в качестве сигнальных, т.е. распознаваемых гипотетическими фермента-
&LF16 &Sp2S ^52 Зн
0.7
«-
УСИЛИТЕЛЬ
Cjm CS Gj3 C#l Cj26 Cy2a С б С*
6.5
4.5
І 55 I 54 I 21 I 15 I 14 I 1
8j3 %1 Sj2b Sj2a Se Sdb
Рис. 6. Участок 12 хромосомы мыши, содержащий генетические элементы Н-цепек ig.
Светлыми столбиками отмечены места расположения d -сегментов; показаны только крайние d -сегменты, остальные 9 расположены между DTTnn/. и n 0 0 . Узкие
LE'lo Ьр2. о
черные столбики показывают расположение Jy -сегментов, широкие черные столбики -расположение С^-генов. цифрами показаны расстояния в т.п.н. Незаштрихованные прямоугольники отмечают sH -районы, ответственные за Си-переключение. Круг с 5' от Си-гена - усилитель транскрипции С^-локуса.
Jft D Зі 32 3Y2 3s 34 35 3Y3 36
II 11
III и
34-26 H9 299 -117 286 357 304 410
Рис. 7. Схема расположения j -сегментов Н-цепей иммуноглобулинов человека.
Буквой Ш обозначены псевдогены. Цифры.показывают расстояния между сегментами (п.н.) d - d -сегмент. Ближайший к Си -гену j -сегмент имеет наибольший порядковый номер.
- зо -
ми ( 9,32,14) (рис. 8). Именно эти сигнальные последовательности ДНК, которые являются универсальными для v-, d-и j-сегментов Н- и l -цепей, вносят определенный порядок в сложный процесс перестройки генных сегментов.
1.2.2.1. Правило 12/23
Структура сигнальных последовательностей приведена в таблице ( 9,38,36,5,14,10,6,37,58 ):
Генный сегмент
Сигнальные последовательности генных сегментов ig (в скобках указано число пар оснований между двумя сигнальными последовательностями)
JH D20
3'CACAGTG-(12)-АСАААААСС5 * 3'CACAGTG-(23)-ТСАААААСА5' 3'CACAGTG-(2 3)-АСАААААСС5' 5'GGTTTTTGT-(2 3)-CACTGTG3' 5'GGTTTTTGC-(12)-CACTGTG3' 5'GGTTTTTGT-(23)-CACTGTG3' 5GATTTTTGT-(12)-TACTGTG-D-CACAGTG-(12)-ACAAAAACC3'
В случае v-сегментов сигнальные последовательности следуют непосредственно (или через одно-два основания) за последним кодоном структурной части ( 5,6,9 ), а в случае J-сегментов сигнальные последовательности расположены непосредственно перед структурной частью j-ДНК ( 14 ).
Иная ситуация обнаружена для Е>_сегментов: структурная часть d-сегмента обладает сигнальными последовательностями с обеих сторон ( 42 ).
- ЗІ
Y/
С - G С - G А'- Т А -Т А -Т А -Т А -Т С - 6
А -Т
G - С Т - А . G - С
А'-.Т
г - г
С - G
С TGG ACG НС GGT - У
С
5'- GAG GAT ССТ Trp Thr Рне Gly
Glu Asp Pro 9б 97 98 9? 93 ЗД 95
Рис. 8. Схема объединения vx- и Jx-сегментов при формировании полного vx -гена
Показаны 3*-концевой участок vx 21-сегмента, 5*-концевой участок л* і -сегмента и.их комплементарные сигнальные участки. Буквами а, с, g и Т обозначены соответствующие основания в последовательности ДНК; черточками между ними обозначено спаривание комплементарных оснований. Под триплетами кодирующих участков показаны кодируемые аминокислотные остатки, ниже цифрами указано их положение в процессированной Х-цепи.
Легко заметить, что сигнальный гептамер является палиндромом и что существует определенная закономерность в отношении числа пар оснований, разделяющих сигнальные геп-тамеры от нонамеров. Эта закономерность состоит в том, что генные сегменты, расположенные на одной и той же хромосоме и обладающие потенциальной способностью к объединению, имеют различную длину между сигнальными последовательностями. Так, это расстояние составляет 12 пар у v^ и 23 - у J^ , 23 -у v^ и 12 - у J у Для VH и j расстояние между сигнальными последовательностями одинаково и составляет 23 п.н., тогда как d-сегменты имеют с обеих сторон вставные участки, размером по 12 п.н. Рекомбинация происходит только между сегментами с дополнительными размерами вставных участков (рис.8).
1.2.2.2. Сочетания генных сегментов
Исследования в области генетики ig проводятся на трех основных уровнях: I) изучается структура генных сегментов ig в недифференцированном состоянии, для чего используют ДНК спермы или непродуцирующих ig тканей (почки, печень); 2) изучается структура перестроенных генов ig в дифференцированных по продукции ig лимфоидных клетках (миеломы, гибридомы, нормальные В-лимфоциты); 3) изучается структура полипептидных цепей ig , синтез которых определяется исследуемыми генами; в зависимости от задачи могут изучаться и мРЖ.
Исследования на трех указанных уровнях показали следующее: разнообразие v -генов, экспрессирующихся в В-клетках,
и, соответственно, разнообразие полипептидов существенно выше, чем разнообразие наследуемых v -сегментов в эмбриональной ДНК. Определенный вклад в это нарастание разнообразия вносят соматические мутации (раздел 2.2.5.), но постоянно действующим генератором разнообразия является и сам процесс объединения генных сегментов в единый v-ген.
Важнейшим следствием универсальности узнающих участков генных сегментов ig и выполнения правила 12/23 является случайная комбинаторика генных сегментов внутри каждой из трех групп сцепления. Это значит, что каждый из 300 ^-сегментов может объединиться с любым из 4 Jx-сегментов, в результате чего возникает 1200 вариантов v^ -генов. Для Н-цепей мыши эта комбинаторика выглядит следующим образом: 200 v -сегментов х 20 d-сєгмєнтов х 4 J -сегмента, в результате может возникнуть 16 000 v -генов.
Исследования миелом и гибридом показали, что замена одного или двух сегментов в составе v -гена может приводить к исчезновению одной ( 59,60 ) и появлению другой специфичности ( 61-63 ), изменению идиотипической структуры ( 64 ), а также к увеличению разнообразия внутри одного семейства AT за счет вариаций тонкой специфичности и аффинности ( 65-^ 68,69,70).
Таким образом, источником разнообразия Ig является не только множественность наследуемых генных сегментов, но и их случайная комбинаторика в составе v -генов: одни и те же генные сегменты в различных комбинациях могут создавать частично или полностью различающиеся АСЦ. Существуют, как будет
Pro-95
У2ІК-С- 5-CCTCC ICflCAGTG
—З
Зі—S^CACTGTGl GTGG-з'
Trp-96
л. CCGTGG
г. CCTTGG
CCTCGG
GCTGCG
}
Pro'a-Trp
Рго95-Аг*96 Pro 95- Pro96
Рис. 9. Разнообразие аминокислотных последовательностей в третьем гипервариабельном участке, возникающее при v-j объединении Х-пепей иммуноглобулинов мыши.
Обведен сигнальный гептамер. Дан пример объединения одного из v 21-сегмецтов с vxi -сегментом. '
показано ниже, и другие источники разнообразия I9 , связанные с процессом объединения генных сегментов.
1.2.2.3. Вариации последовательности на участке объединения генных сегментов
Сдвиг точки рекомбинации. Возникновение разнообразия за счет процесса объединения генных сегментов впервые было показано при исследовании первичной структуры миеломных l-цепей ig мыши, относящихся к вариабельной подгруппе vx2i (71 ). Из 20 исследованных ь-цепей у 5 j-участки отличались от эмбриональных последовательностей, но находились в точном соответствии со структурой объединенных v-j-блоков в клетках исследуемых миелом.
Сопоставление структуры эмбриональных и перестроенных vx~ и .тх-сегментов позволило точно установить точку рекомбинации между двумя сегментами. Как правило, этой точкой служила фосфодиэфирная связь, соединяющая 2-й и 3-й нуклеоти-ды инвариантного для X-цепей кодона в 95 положении v-сегмента ( 14 ). Однако из рис. 9 видно, что эта точка может сдвигаться, и на рисунке изображены те случаи, когда сдвиг точки объединения приводит к появлению новых функциональных последовательностей. Напомним, что 96 остаток полипептидной цепи участвует в построении АСЦ, так как входит в состав третьего гипервариабельного участка l-цепей, и сдвиг точки объединения приводит к изменению именно этого остатка: с триптофана - на аргинин или пролин. Аналогичные данные получены и при исследовании набора гибридом к синте-
/ „, бо,, зот юч тическому полипептиду (состава Giu Ala туг ), - использование 3 разных j^-сегментов и сдвиг точки рекомбинации дает в пределах этого семейства антител 4 варианта 96 остатка ( 72 ). При v-j объединении сегментов ь -цепей 25% возникающих последовательностей отличается от эмбриональных. Значительно более сложным является процесс объединения эмбриональных сегментов в случае Н-цепей: vH -ген "собирается", как минимум, из трех различных сегментов - vH, d и JH ( 9,41,42 ). Очевидно, что в случае vh-d-j -объединения аналогичные механизмы, т.е. простой сдвиг точки рекомбинации, могут дать гораздо большее разнообразие последовательностей, чем в случае vx-j^-объединения: если сдвиг точки в единичном акте рекомбинации дает п вариантов, то в двух последовательных независимых рекомбинационных событиях создается п2 вариантов. Действительно, разнообразие vTT -структур гибридомных iq к азофениларсонату создается
Н -3
за счет сдвига точки d-jt -объединения на фоне использова-
ния единственной тройки v-, d- и j-сегментов ( 73 ).
Аналогично, разнообразие v -структур большой панели гиб-
ридом к фосфорилхолину создается с использованием единственной пары v- и j-сегментов, в значительной мере за счет сдвигов в обеих точках рекомбинации ( 67 ). Сдвиги, генерирующие разнообразие Ш гипервариабельного участка в обеих точках рекомбинации выявлены также для миеломных и гибридомных ig к галактану ( 74 ).
Делении и вставки некодируемых нуклеотидов в точках объединения. Разнообразие последовательностей в местах кон-
такта может создаваться и за счет делеций 1,2 или большего количества кодонов одного или обоих рекомбинирующих сегментов. Так, для миеломы НРС-76 показано использование эмбрионального jtt-сегмента с делецией двух его 5' -конце-вых кодонов ( 75 ). Для трех больших групп, на которые распадаются миеломы и гибридомы к фбсфорилхолину, отличающихся по частным идиотипическим маркерам и тонкой специфичности, показано использование единственного j -сегмента: в одной группе v -генов он присутствует полностью (миело-ма TEPC-I5), в другой - с делецией I кодона (миелома МсРС-603), в третьей - с делецией 2 кодонов (миелома M0PC-I67) (76 ).
При сравнении нуклеотидных и полипептидных последовательностей ig было высказано предположение о возможности не только делеций, но и вставок некодируемых нуклеотидов, т.е. появления в точке рекомбинации олигонуклеотидов, не происходящих ни от одного из рекомбинирующих сегментов (77).
Такие вставки были выявлены в местах D_j -объединения сна-
чала для нефункционально перестроенных генов ig ( 78 ), затем в экспрессируемых генах гибридом и миелом к галактану ( 74 ) и фосфорилхолину ( 66 ). Предполагается, что не-кодируемые нуклеотиды встраиваются случайным образом при ли-гировании рекомбинирующих фрагментов с участием терминальной трансферазы. Случайный характер застройки этих небольших участков (напомним, что они попадают в Ш гипервариабельный район, формирующий АСЦ) может заметно усиливать разнообразие в указанном участке.
1.2.2.4. Неканонические варианты рекомбинации генных сегментов
Дополнительным источником разнообразия последовательностей в Ш гипервариабельном районе могут быть v -гены неканонического состава. Например, для миеломных ig , специфичных к левану, показано укорочение Ш гипервариабельного участка за счет полного отсутствия о-сегмента: для АСЦ данной специфичности полный Ук-ген состоит только из v - и j-сегментов, их непосредственное объединение возможно за счет особенностей строения узнающего участка JH3 -сегмента ( 69,75,79 ). Разнообразие последовательностей может создаваться также из-за объединения двух d-сегментов
подряд, так что в результате образуется блок v _n-n-J »
н н
имеющий необычную последовательность и увеличенную длину Ш гипервариабельного участка ( 77 ). Разнообразие последовательностей d-сегмента может, видимо, создаваться и за счет инверсии рекомбинирующего d -сегмента, как это показано для лимфоидных клеток мыши ( 78 ).
В ряде случаев гены ig несут следы недавних рекомбина-ционных событий, хотя не всегда можно определить, произошел неравный перекрест или конверсия генов (конверсией называется такое взаимодействие генов, в результате которого меняется только один из взаимодействующих элементов). После того, как было высказано предположение о конверсии генов Ig (80 ), были описаны нуклеотидные последовательности, появление которых действительно молшо объяснить конверсией.
Такие события выявлены для о- ( 40 ), v^- ( 81 ) и vH -
сегментов ( 82 ) человека, а также для v -сегментов мыши
( 83,84 ). До 40% эмбриональных v-сегментов являются псев-до-генами ( 29 ), т.е. не экспрессируются самостоятельно, и только благодаря конверсии или другим рекомбинационным событиям кодирующие участки этих псевдо-генов могут частично или полностью переноситься на функциональные v -сегменты и участвовать в генерации разнообразия.
1.2.2.5. Соматические мутации v-генов
Перестройка генных сегментов ig , помимо непосредственного создания разнообразия v -структур, активирует еще один процесс, приводящий к дополнительному увеличению этого разнообразия - соматический мутагенез генов xg . Соматические мутации выявляются сравнительными исследованиями на трех уровнях, приведенных в разделе 2.2.2. (эмбриональные сегменты, перестроенные гены, полипептиды). Исследования на трех перечисленных уровнях позволили установить, что соматические мутации генов ig ( 65,85,86,87 ) затрагивают только перестроенные генные сегменты ig . Предполагается поэтому, что сам процесс формирования vH- или vL-reHa сопровождается "вспышкой" мутаций, например, из-за ошибок в репарации в процессе генных перестроек. Кроме того, ддш^н-генов "вспышка" может происходить и при переключении Сд-ак-тивности, так как мутации выявляются, как правило, во всех классах хч, кроме ідм ( 65,86 ). Соматические мутации никогда не затрагивают С-гены.
Для фосфорилхолин-связывающих миелом M0PC-I67 и M0PC-5II показана экспрессия \~тл. Jx-сегментов, отличающихся между собой и от эмбриональных сегментов по 4 соматическим заменам в остатках остова, разным для двух миелом,
В клетках миеломы М0РС-5П, помимо перестроенного гена v-167 , на другой Х-хрсшосоме v-167 сегмент выявлен в неперестроенном эмбриональном состоянии, и у этого v-сегмента никаких изменений не обнаружено: его структура оказалась точно такой же, как и структура v-167 сегмента, выделенного из эмбриональной ДБК линии мышей balb/c ( 12 ). Таким образом, мутационный механизм действительно связан с процессом v-j-объединения и не затрагивает эмбриональных сегментов ( 88 ). Структура того же vY-reHa v -167 была
* L
исследована в двух гибридомах, продуцирующих AT к ФХ. В одной гибридоме из 1100 расшифрованных оснований выявлено 4 замены (0,4$), но не в самом гене v-167 > а в участках, непосредственно прилегающих к v -гену как с 5', так и с 3'-концов. В другой гибридоме обнаружено 14 замен (1,3$), но из них в структурной части локализовано только две замены, причем одна из них не значащая. В обоих случаях замены в районе сь-гена не обнаружены. Из этих данных можно сделать вывод, что мутационные замены не имеют направленного характера, связанного со специфичностью AT, а тот факт, что мутации локализуются в районе v -гена, но не С-гена, объясняется тем, что мутационный процесс сопряжен с перестройками ДНК при v-j-объединении.
Существуют экспериментальные данные не только о наличии, но и о вкладе соматических мутаций в генерацию разнообразия vL-cTpyKTyp. vx 21-подгруппа мыши кодируется 7-Ю эмбриональными vx-сегментами, но уже сейчас только среди миелом мышей линии balb/c выявлено более 30 уникальных аминокислотных последовательностей этой подгруппы ( 18 ). По крайней мере для двух эмбриональных сегментов этого семейства показана экспрессия в миеломных и гибридомных клетках в виде 3-5 соматических вариантов для каждого; варианты отличаются друг от друга и от эмбрионального прототипа только точечными заменами ( 19 ). Особое значение соматические мутации могут иглеть для V^ -сегментов, присутствующих в эмбриональной ДНК мыши всего в 2 экземплярах: за счет соматических замен из единственной пары сегментов, формирующих v^-домены, возникло ~ 10 известных к настоящему моменту уникальных последовательностей ( 58 ). Исследованием панели гибридом показан значительный вклад соматических мутаций в генерацию разнообразия v^ -доменов моноклональных AT к синтетическому полипептиду (72).
На модели миеломных белков и гибридомных AT к фосфо-рилхолину были изучены и соматические мутации vH-генов. При исследовании vH -генов миелом M0PC-I67 и МсРС-603, продуцирующих igA,получены следующие данные ( 86 ) (рис. 10): в районе гена VTT-167 выявлено 44 замены из 1054 расшифрованных оснований (4,2$), а для гена v -боз - 10 замен на 714 оснований (1,4$). Замены распределены не только в пределах кодирующей части, но и в прилегающих участках, а за-
L fl-HHtf)
МИ* ІННЩі І) І Щіі[~Ьі«/>—h-f#-
4 J-
M 167
J
Hill II
f4—h
-/>
/ /-
M603
її » і
to Ю
J/l—J L-
9' o-
O"
-ЧН-
ЧН-
'«Г
C>4 Ю
-4 F
Рис. 10. Карта соматических мутаций двух vH -генов иммуноглобулинов мыши.
Внизу указана длина в т.п.н. Ьа точку отсчета принята граница vT, -d -сегментов. Вертикальными чертами отмечены единичные аминокислотные замены по сравнению с эмбриональной последовательностью.
мены в районе С^-гена не обнаружены. Как и в случае vT -генов, мутационные замены для v^-генов устанавливались по сравнению со структурой соответствующего эмбрионального vH -сегмента. Аналогичные исследования выявили соматические мутации в перестроенных уЬ!-сегментах В-клеток человека ( 40 ) и анти-инулиновых миелом мыши (79 ). а также в перестроенных vH и о -сегментах гибридом к арсонату ( 73 ), миелом и гибридом к фосфорилхолину ( 67 ), декстрану ( 69 ), фруктозану и галактану (89 ), а также гибридом к оксаза-лону ( 68 ). Показано, что в основном за счет соматических замен единственная пара vH- и Jp-сегментов дает более 50 высоко гомологичных, но не идентичных v^-последовательнос-тей AT к арсонату ( 60 ). Введение соматических мутаций (частота 0,5$) по ходу смены доминирующих клонотипов в иммунном ответе приводит к закономерному возрастанию аффинности AT к антигену, как показало сравнительное исследование 40 миелом и гибридом, представляющих разные стадии иммунного ответа на фосфорилхолин ( 90 ). Помимо генерации разнообразия внутри одного семейства AT за счет вариаций тонкой специфичности и аффинности, соматические мутации могут создавать AT разных семейств: один эмбриональный VF -сегмент с различными вариантами замен (всего 3 измененных остатка) используется как в миеломных AT к фруктозану, так и в связывающих галактан ( 89 ), т.е. в совершенно различных АСЦ.
Таким образом, основными выявленными экспериментально источниками разнообразия ig являются следующие:
множественность наследуемых генных сегментов,
различные сочетания генных сегментов,
вариации последовательностей в точках объединения,
соматические мутации перестроенных v -генов.
1.2.3. Комбинаторика Н- и l-цепей как возможный источник разнообразия ig
Из всех обсуждавшихся источников разнообразия *я удовлетворительной количественной оценке (т.е. оценке с точностью до порядка) поддаются только величины, характеризующие количество наследуемых генных сегментов и варианты их простейших сочетаний (v х j и vR х d х j ) , а для отдельных случаев - также частота соматических мутаций. Количественная оценка вклада в разнообразие неканонических вариантов объединения генных сегментов (сдвиг, делеции, вставки, инверсии и т.д.) отсутствует вовсе, хотя, и это крайне важно, все эти события экспериментально выявлены в клетках лимфоидного ряда.
В то же время, потенциально наиболее эффективным, но наименее исследованным источником разнообразия является комбинаторика всех вариантов Н- и l -цепей, возникших в результате описанных выше процессов: если бы все сочетания полипептидных цепей ig давали функциональные АСЦ, то разнообразие ig организма определялось в конечном счете как произведение вида: н х l } где н и l - разнообразие соответствующих полипептидов данного организма. Действительно,
ряд авторов считает эту комбинаторику (а не соматическую диверсификацию v -генов) основным источником разнообразия ( 22 ). Если все же существует избирательность взаимодействия Н- и l-цепей, т.е. преимущество одних сочетаний, по сравнению с другими, то оно могло бы проявляться, во-первых, при объединении Н- и l -цепей, во-вторых, при формировании идиотипической структуры, в-третьих, при образовании АСЦ. Подобное преимущество одних сочетаний над другжш можно пытаться выявить либо исследованием реальной комбинаторики полипептидов в нативных ig , либо получением in vitro гибридных молекул ig рекомбинацией изолированных Н- и L-цепей разного происхождения. Кроме того, может быть использован промежуточный подход: сочетание полипептидов выбирает экспериментатор, но их взаимодействие исследуется не в пробирке, а в клетке - либо трансфекцией лим-фоидных клеток генами ig , либо инъекцией Н- и L -мРБК в
ООЦИТЫ Xenopus laevis , ЛИбО СЛИЯНИЄМ В-КЛЄТОК, СИНТЄЗИ-
рующих различные полипептиды. Данные об избирательности взаимодействия полипептидов ig по трем указанным критериям (объединение, структура, функция), полученные перечисленными методами, подробно рассмотрены в следующих разделах.
1.2.3.1. Избирательность объединения Н- и l -цепей ig
Объединение Н- и L-цепей в клетке. Одновременное введение в ооцит V4 и д2-мРНК, полученных из разных миелом, приводит к секреции гибридного igGi, Я 2 ( 91 ), тогда как
введение /рІ-мРНК с тремя различными Я2-мРНК приводит к секреции только 2 вариантов ig из трех возможных ( 92 ). Если Я2-мРНК вводится в ооцит, где уже присутствует собранный из аутологичных полипептидов Х1,Х M0PC-2I, то синтезируемая /\2-цепь не способна вытеснить Х-цепь из предсуществующих комплексов ( 93 ). Аналогичную экспериментальную систему можно сконструировать также с использованием трансфекции или гибридомной техники. Трансфекция геном полной <-цепи миеломного белка МсРС-603 клеток миело-мы ns-1, синтезирующих только Х-цепь, приводит к формированию и секреции igA,x в таком же количестве, как и в исходной миеломе МсРС-603 ( 94 ). Гибридизация лимфоидных клеток крысы, содержащих ^-цепи с разными v- и С-домена-ми, приводит в ряде гибридомных клонов к одновременной секреции 3 типов молекул ig: содержащих только один, только второй и содержащих оба варианта Х"-цепеи> т.е. все возможные сочетания ( 95 ).
Условия конкуренции двух ь-цепей за ассоциацию с единственной Н-цепью (или наоборот) изредка возникают in vivo, когда в В-клетке продуцируются 2 альтернативные формы одноименного полипептида. Например, в клетках миеломы мыши M0PC-I73 в одной из двух синтезируемых X-цепей произошла мутационная замена инвариантного тгр-35 на Leu, в результате чего она не может объединиться с синтезируемой этими же клетками Н-цепью ( 96 ). В клетках миеломы s-107 из двух различных Х~Цепеи ~ продуктов аллельных локусов -только одна объединяется с Н-цепью и формирует iga.# спе-
цифичный к фосфорилхолину (97). Аналогично, в пре-В-клеточ-ной линии мыши 18-81, помимо синтезировавшихся исходно J2b-и Х-пепей, в части клеток в ходе культивирования произошла спонтанная активация аллельного Н-локуса и начался синтез /А-цепи с совершенно отличным от )^2ь-цепи v-доменом. При этом с X-цепью объединяется и секретируется в составе целого ig только исходная # 2ь-цепь ( 98 ).
Исследование v^-, «ід -сегментов и бд]_-гена мышей линии sJL' отличающихся резко сниженным уровнем экспрессии )cl-полипептидов в составе ig поверхности спленоцитов или нормальной сыворотки, выявило единственное различие, по сравнению с нормально экспрессируемыми Хі-генами мышей BALB/c: замена g на Т в кодирующей части c^i -гена приводит к появлению vai-155 вместо Giy . По мнению авт., за счет меньшей гидрофобности и гибкости vai , по сравнению с Giy , изменяется конформацияуЗ-слоя С-домена Аі-цепи, что ослабляет взаимодействие всех Аі-цепей этой линии с большинством Н-цепей ( 99 ). Видимо, по сходной причине среди ig кролика, независимо от генотипа, из всех аллелей серии ь ( Х-гены) слабее и реже всего экспрессируется ген bas ,не кодирующий обычного в І7Ї положении для С-^-генов остатка cys ( 100 ).
Приведенные данные указывают на то, что не только в случае гетерологичных сочетаний (как в экспериментах с ооцитами), но и в случае некоторых аутологичных, т.е. когда Н- и ь -цепи происходят из одной В-клетки, проявляется избирательность их взашлодействия, и не все сочетания полипептидов способны сформировать молекулу ig . Возможно, что такая несовмести-
мость - явление довольно частое, но так как в норме В-клет-ка производит I ^-цеиъ и І Н-цепь, то в случае неподходящего сочетания продукция ig отсутствует, в результате чего такие клетки элшлинируются и не встречаются среди миелом и гибридом. 3 описанных случая выявлены только за счет наличия альтернативной формы полипептида, оказавшегося подходящим для формирования ig.
Объединение Н- и ь -цепей in vitro . Исследования ассоциации Н- и L-цепей ig in vitro показали, что в случае ау-тологичного сочетания объединение полипептидов происходит в 2 стадии ( 101 ): быстрая реакция, свойственная как v- , так и С-доменам, и медленная, свойственная только v-доменам, и связанная с корформационной подгонкой vl~ и ун-доменов (всего в таком взаимодействии принимают участие 4 домена - 2
домена "ь-цепи, v и с і-домены). Объединение аутологич-
н н
ных полипептидов происходит с высокой аффинностью - К& 10
М ( 102 ), складываясь из двух составляющих: взаимодействия
v-доменов с К 10-10 М (103,104) и взаимодействия Сн1 и
7 —Т Сь-доменов с К 10 М ( 105 ). Избирательность взаимодействия Н- и L-цепей в данных исследованиях проявляется в следующем. Все изолированные с -домены, в том числе и гетероло-
7 —Т гичные, реагируют с Н-цепью одинаково с К 10 М ( 103 ),
но из изолированных v -доменов только аутологичный спосо-
бен связываться с данной Н-цепью ( 103 ). Гетерологичный v -
домен может взаимодействовать с Н-цепью, только если с ней
предварительно объединился с -домен, но увеличения аффинное-
.Li
ти при этом не происходит. Точно так же, только аутологичный
v^-домен в изолированном виде может объединяться с l -цепью
7 Т (К 10 М~ ) ( 104 ). Кроме того, только для взаимодействия
с аутологичной Н-цепью показана кооперативность взаимодействия изолированных v~ и С-доменов l-цєпи ( 105 ). Таким образом, специфичность взаимодействия Н- и l-цепей определяется их v -доменами, причем для vH -домена, видимо, его Ш гипервариабельным участком ( 104 ). Во всех исследованных случаях показано преобладание по аффинности аутологичных сочетаний над гетерологичными. Эти данные подтверждаются и экспериментами по конкурентной ассоциации Н- и l -цепей in vitro. Если объединение возмолшо для самых разных сочетаний полипептидов ( 106 ), в том числе и межвидовых - кролик-крыса и кролик-человек - ( 107 ), при конкуренции, как правило, выявляется преимущество аутологичного сочетания. Преимущество может быть незначительным - 1,1-1,8 раза по соотношению ауто-и гетерологичных L-цепей в комплексе ( 108 ), или таким, что гетерологичные полипептиды полностью вытесняются из комплекса ( 109 ). При исследовании 30 гетерологичных сочетаний Н-и ь_цепей моноклональных AT мыши к флюоресцеину было показано, что в 13 случаях гетерологичные полипептиды вообще не могли конкурировать с аутологичными, в 13 сочетаниях наблюдалось преобладание аутологичных полипептидов в 1,5-50 раз, и в 4 вариантах гетерологичные полипептиды включались в комплекс в 1,5-2,5 раза активнее аутологичных ( 109 ). Таким образом, исходные сочетания преобладали в 26 случаях из 30 (87$). Интересно, что Н-цепи выеокоаффинных AT проявляли большую избирательность, и из 15 гетерологичных l-цепей с ними
взаимодействовали только 5, тогда как с Н-цепями низкоаффинных AT взаимодействовали 12 l-цепей из 15 ( 109 ). В аналогичном исследовании II миеломных ig человека и I миеломного ig мыши ( НО ) показано преимущество аутологичных комбинаций в 36 случаях из 44 исследованных - 82%, причем, отсутствует какая-либо корреляция сродства полипептидов с изоти-пами, аллотипами, v-подгруппами. Разница между Н-цепями высоко- и низкоаффинных AT, а также отсутствие корреляции сродства даже с v-подгруппами говорят о том, что специфичность взаимодействия полипептидных цепей ig может определяться очень тонкими особенностями их структуры, так что объединение Н- и l-цепей в полноценную молекулу ig должно быть крайне избирательным. Отдельные случаи преобладания гетерологич-ных сочетаний говорят о том, что в клетке нет специальной генетической программы подбора определенного ^ь_гена к уже перестроенному v -гену. Действительно, в клоне пре-В-клеток, синтезирующих индивидуальную /U-цепь, независимая активация Х-генов приводит к появлению в разных клетках клона разнообразных X-цепей, относящихся даже к разным подгруппам ( III ). Вероятнее всего, в В-клетках возникают все возможные случайные сочетания Н- и l-цепей, из которых впоследствии отбираются ...функциональные.
2.3.2. Избирательность формирования антигенной структуры *д
Зависимость антигенной структуры ig от сочетания Н- и ь-цепей показана для естественных сочетаний полипептидов: эк-
спрессия аллотипа Gim(3) tf -цепи человека зависит от l-цепи и убывает в ряду миеломных ig человека: igGA, igGvx1I, igGvxm, igGVxX ( 112 ). Рекомбинация полипептидов in vitro показала, что для экспрессии аллотшшческого маркера vH-доменов кролика al также важно объединение с l -цепью ( ИЗ ), причем L-цепь усиливает экспрессию al только в присутствии сн1 -домена, но не с изолированным vH -доменом. Кроме того, важна природа сн1-домена: экспрессия al сильнее в случае jf-цепи, чем в случае о<-цепи ( ИЗ ). Наибольший интерес все же представляют данные по избирательности формирования идиотипических структур. Экспрессия идиотипических маркеров рекомбинантными ig исследовалась только in vitro . Исчезновение или резкое снижение экспрессии идиотипа при замещении одного из аутологичных полипептидов гетерологичным показано для миеломных ( 114 ) и гибридомных ig мыши, причем, в одном случае идиотип определяла Н-цепь ( 115 ), в другом - ь-цепь ( 116 ). Во всех трех случаях ( II4-II6 ) рекомбинация проводилась внутри семейства AT идентичной специфичности. Аналогичные данные получены и для моноклональных ig человека: полное восстановление идиотипа происходит только при аутологичном сочетании, хотя частичное возможно при подстановке Х-цепи той же подгруппы ( 117 ). Для набора миеломных 1(з , специфичных к динитрофенолу ( 118 ), фосфорил-холину ( 119 ), инулину ( 120 ) показано полное восстановление идиотипа гетерологичными комплексами, независимо от того, определяется идиотип Н- ( 118,119 ) или l -цепью ( 120 ). Полное восстановление идиотипа гетерологичными комплексами
( II8-I20 ) объясняется использованием в каждом случае Н-и l-цепей от AT одного семейства, имеющих идентичную специфичность, сходный идиотип и кодируемых одншл v-сегментом. Все же в типичном случае гетерологичные комплексы не воспроизводят ни одного из родительских идиотипов: для набора из 9 моноклональных AT к флюоресцеину выявлен только I гибридный комплекс, демонстрирующий 20% идиотипической активности ig - донора ь-цепи ( 121 ).
Приведенные данные показывают весь спектр возможных вариантов реставрации антигенной структуры, но не дают четкого представления о сравнительной частоте этих вариантов. В этом отношении более информативными были бы эксперименты с использованием препаратов, представляющих все разнообразие Н- и L-цепей данного организма. Действительно, существуют, хотя и в очень ограниченном количестве, работы, где в качестве одного из партнеров по рекомбинации используются не индивидуальные полипептиды, но поликлональные Н- или ь -цепи ( 122-124 ) нормальных ig сыворотки мыши и кролика. В одном случае комплекс специфической Н-цепи с l -норм, лишен исходного идиоти-па ( 123 ); в другом таком же комплексе идиотип слабо экс-прессируется (точная количественная оценка отсутствует), тогда как в реципрокном - отсутствует ( 124 ). Для панели гибридом к азофениларсонату выявлена Н-цепь, восстанавливающая :. в комплексе с l -норм ~ 6% антигенной активности идио-типа ( 122 ), но вывода о доле ь-норм, способных участвовать в формировании данного идиотипа, авторы не делают. Сходные данные получены при использовании препаратов поликлональных
Н- и l-цепей сывороточных AT кролика и мыши ( 118,125 ). Таким образом, результаты, полученные для моно- и поликлональных ig, находятся в хорошем соответствии, свидетельствуя о жесткой избирательности объединения Н- и ^-цепей 1сз . К сожалению, ни в одной работе с использованием поликлональных полипептидов не получена корректная количественная оценка доли цепей, компетентных в создании тестируемых структур.
2.3.3. Избирательность формирования АСЦ
Ассоциация полипептидов в клетке. Можно предположить, что наиболее жестким является все-таки функциональный критерий - т.е. возникновение активного центра AT при взаимодействии полипептидных цепей. Это значит, что во многих случаях, когда ассоциация полипептидов произошла и образовался нормально секретируемый ig , не отличимый по физико-химическим и антигенным свойствам от активного AT, специфическая активность может отсутствовать. Для гибридомы к азофенил-арсонату показано, что 40% v^ -доменов аффинно выделенного AT представляют собственно Н-цепь AT, тогда как 60% - Н-цепь родительской миеломы, не способную создать АСЦ. В этом случае в клетках образуются гибридные молекулы, содержащие оба типа Н-цепей, но I АСЦ на молекулу ( 126 ). Аналогичные результаты получены для ряда гибридом крысы ( 95 ). Для гибридом к фосфорилхолину, полученных в условиях супрессии доминирующего идиотипа (это стимулирует появление необычных сочетаний Н- и l-цепей), показано, что объединение обычной для этого АСЦ Н-цепи с необычной Х-цепыо, происходящей из
клеток миеломы, приводит к снижению аффинности на 2 порядка, так же, как и объединение специфичной ь-цепи с необч-ной Н-цепью ( 127 ). Следует отметить, что отбирались только клоны, сохранившие исходную специфичность, поэтому остались вне поля зрения все варианты полной потери АСЦ. Единичная мутационная замена в ^-сегменте антифосфорилхолиновой миеломы s-107 приводит к падению аффинности AT на порядок ( 128 ); замена в vH -сегменте той же миеломы Giu-35 на А1а приводит к полному исчезновению АСЦ при сохранении идиотипа ( 129 ): водородная связь между Giu-35 и гидроксильной группой туг-94 l -цепи стабилизирует конформацию АСЦ. При введении 15 замен в v -домен гибридомы к нитрофенилацетату произошла полная потеря активности секретируемого ідо при частичном сохранении идиотипа ( 84 ).
Сходная ситуация может быть создана в клетке экспериментально: в ДНК клеток гибридомы к тринитрофенолу, утратившей в результате мутации синтез Х-Депи AT, был встроен совершенно отличный от экспрессировавшегося активный Х-ген. Восстановилась продукция Х-цепи, ее объединение с исходной миеломной U-цепью и секреция ідмх , но полностью утрачена исходная активность AT ( 130 ). Аналогичный результат получен при встраивании гена о(-цепи AT в клетки миеломы, синтезирующей Х-цепь - продукция igAX, без АСЦ ( 94 ).
Приведенные данные показывают, что даже минимальные изменения в последовательности одного из полипептидов при полной сохранности другого могут сделать указанный полипептид в значительной мере или полностью непригодным для формирования
AT с тестируемой специфичностью. В то же время, во всех случаях исчезновения исходной специфичности остается открытым вопрос, не появляется ли при этом новая активность, совершенно отличная от исходной: впрямую проверить это экспериментально не представляется возможным.
Наблюдаемые в нативных ig сочетания полипептидов. Предположим, что Н-цепь (именно она определяет, как правило, структуру и специфичность АСЦ) действительно является поли-потентной, т.е. с одной l -цепью образует один АСЦ, с другой -совершенно другой, и т.д. Если бы это было справедливо для большинства Н-цепей, такая полипотентность была бы эффективным источником разнообразия AT, делая сраведливой приведенную ранее формулу: разнообразие ig = разнообразие Н-цепей х разнообразие l -цепей. При этом, одна и та же Н-цепь может. участвовать в создании совершенно различных семейств AT, а в составе одного семейства AT, родственных по специфичности и/или идиотипу, могут присутствовать совершенно различные Н-цепи в комплексе с разными l -цепями. Это предсказание, основанное на предположении о полипотентности Н-цепей, уже можно проверить экспериментально. Для этого достаточно исследовать разнообразие vH -последовательностей генов или полипептидов внутри семейств ig . В настоящее время подобные исследования сывороточных, миеломных и гибридомных ig проведены для следующих семейств AT: к фосфорилхолину, азафениларсо-нату, динитрофенолу, нитрофенилацетату, фенилоксазолону, синтетическим полипептидам, полисахаридам левану, галактану, инулину, декстрану, углеводу стрептококка группы А. Получен-
ные при исследовании этих семейств данные свидетельствуют против полипотентности Ы-цепей: показано преобладание идентичных или очень сходных по первичной структуре Н-цепей на фоне, как правило, несколько большего разнообразия l -цепей для AT мыши к нитрофенилацетату ( 63,65 ), фенилоксазолону ( 68 ), азофениларсонату ( 73 ), фосфорилхолину ( 76,90 ), синтетическому полипептиду ( 72,131 ), инулину ( 79,132), галактану ( 74,133 ), декстрану ( 69,70 ), левану ( 89 ), использование 2 различных Н-цепей в AT к углеводу стрептококка группы А ( 61 ). В ряде случаев выявлено также очень ограниченное разнообразие ь_цепей: 3 варианта для AT к фосфорилхолину ( 90,134 ), 2 - для AT к синтетическому полипептиду ( 131 ), I - для AT нитрофенилацетату ( 62 ), азофениларсонату ( 73 ), фенилоксазолону ( 68 ), декстрану ( 70 ). Для AT к инулину выявлен крайний вариант избирательности - изо-тип X-цепей Ух11» который в составе других AT вообще не встречается и присутствует только в комплексе с Н-цепями изотипа vh5 ( 132 ), так что даже нормальные 1(з сыворотки неимунной мыши, содержащие v^n , непременно содержат также и vh5 и АСЦ указанной специфичности. Все анти-инулино-вые гибридомы и миеломы имеют редуцированный Ш гипервариабельный участок из-за полного отсутствия в составе vn -гена D-сегмента; считается, что только указанный вариант Х-цепи может эффективно объединяться таким необычным по структуре %-доменом ( 79 ), причем важна не столько аминокислотная последовательность, сколько длина Ш гипервариабельного участка. Стандартная длина этого района с небольшими вариациями
последовательности выявлена для AT к галактану ( 133 ), декстрану ( 69 ), и это может быть важным фактором, ограничивающим разнообразие v -структур, способных объединяться
с данным v -доменом. Среди миелом и гибридом к фосфорилхо-н
лину, экспрессирующих I vH и і J -сегмент, можно выделить
3 подсемейства, различающихся по используемым vx -генам. В
одном случае j -сегмент вошел в состав vH -гена полностью,
и в этой группе AT экспрессируется только I vx -ген. В другой группе j -сегмент, и, следовательно, Ш гипервариабель-н
ный район укорочен на I кодон и экспрессируется с другим vx~ геном. В третьей группе с укороченным на 2 ко дона JH -сегментом экспрессируется третий vx-reH ( 76 ). Вероятно, избирательное использование Х-цепей трех совершенно различных изотипов (vx8f vx22 и vx24 подгруппы) связано именно с вариациями длины Ш гипервариабельного района ( 66 ). Для v -районов обоих семейств AT, использующих исключительно Хі-цепи - AT к декстрану ( 70 ) и нитрофенилацетату ( 63 ) -выявлены инвариантные остатки vH -доменов ( 135 ), хотя эти 2 группы v -последовательностей кодируются совершенно неродственными генными сегментами. Возможно, сходные для указанных последовательностей остатки определяют специфичность взаимодействия Н- и ь-цепей ( 135 ).
В редких случаях показана преобладающая роль ь_цепей в формировании АСЦ: для двух десятков гибридом к углеводу стрептококка группы А ( 136 ) и для 10 моноклональных ревматоидных факторов человека - *дм , анти-igG - показано использование идентичных внутри семейства ч% -последователь-
ностей, vxX и vxlilb ( 137 ), соответственно. При этом наблюдается разнообразие v -структур/
Таким образом, из II наиболее подробно исследованных семейств AT для 10 показана монотонность первичных структур, противоречащая предположению о полипотентности Н-цепей (или ь-цепей в случае их ведущей роли). Известны случаи, которые можно считать отклонениями от указанной закономерности. Для гибридом к синтетическому полипептиду состава (Glu Ala
туг ) показано, что использование двух совершенно различных vx -сегментов в сочетании с одним vH -сегментом приводит к появлению AT с несколько отличными идиотипами и тонкой специфичностью ( 131 ), но все же относящимися к одному семейству AT. AT к углеводу стрептококка мышей линии A/J и AT к инулину мышей balb/c используют аллельные формы одного наследуемого vH -сегмента ( 61 ). Можно было бы считать этот случай примером полипотентности Н-цепи, создающей совершенно различные АСЦ с участием разных Х-Цепей, но при этом источником разнообразия может быть не только замена одного vx-reHa другим, а ряд различий самих vR -генов: 5 соматических замен, из них 3 - в АСЦ, различные d- и Jp -сегменты ( 61 ). В гибридомах мышей С57зь генный сегмент VH186.2 экспрессируется с v^-геном в составе AT к нитрофенилацета-ту ( 65 ), и с у^-геном - в AT к синтетическому полипептиду ( 62 ), но и в этом случае сам vH -сегмент несет множественные соматические мутации, и используются совершенно различные о-сегменты ( 65,62). Для гибридомных AT мышей balb/c к этим двум антигенам выявлена совершенно сходная ситуация:
использование единственной пары vH- и JH -сегментов либо с v«-, либо с v^-геном; при этом Уы-сегменты несут соматические замены и объединены с различными d -сегментами ( 63 ). Для создания АСЦ AT к нитрофенилацетату чрезвычайно важна, видимо, именно 'Аі-цепь: в гибридомах этой специфичности, происходящих ОТ МЫШеЙ BALB/c и C57BL/6 , Уд І-ДОМЄН СОЧЄТаЄТ-
ся с совершенно различными vH -доменами, состоящими из неродственных v-, d- и J-сегментов ( 135 ). Несмотря на идио-типические различия, в обоих случаях создаются AT, идентичные по характерному спектру аффинностей к различным производным антигена. Последний пример показывает, что даже в тех случаях, когда возможно продуктивное объединение разных vH -доменов с одним vL, такая комбинаторика не приводит к увеличению разнообразия AT, но дает AT одной специфичности. Таким образом, пока не выявлено ни одного случая использования идентичных Н-цепей (т.е. с однім v-, d- и J-сегментом и без соматических замен или с идентичными заменами) в комплексе с разными l -цепями для создания АСЦ неперекрывающихся специфічностей. Не исключено, что такие случаи все же возможны, и выборка из 10-12 семейств AT просто мала для их выявления, но достаточна для того, чтобы показать, что такие случаи не являются преобладающими. Это значит, что, как правило, Н-цепь способна создать единственный АСЦ или группу родственных специфичностей в комплексе с ограниченным разнообразием L-цепей. Во всех случаях объединения Н-цепей с неподходящими для создания данного АСЦ l-цепями никакая другая специфичность не возникает вообще, и такие непродуктивные сочетания, даже возникнув в лимфоидной клетке, должны элиминирова-
ться, т.е. не будут представлены среди моноклональных или сывороточных AT и не внесут вклад в их разнообразие.
Активный центр тэекомбинантных ig . Исчезновение или резкое снижение специфической активности при замещении одного из аутологичных полипептидов гетерологичным показано для миеломных AT человека ( 117), гибридомных и миеломных ^ ig мыши ( 138 ), в том числе к флюоресцеину ( 109 ), фосфорилхолину ( 119,139,140 ), динитрофенолу ( 141,142,118 ). Для набора миеломных ig к инулину ( 120,143 ) и галактану ( 144,145 ) показано полное сохранение гетерологичными комплексами идиотипов, АСЦ, аффинности к антигену, но это объясняется происхождением всех Н- и l -цепей внутри каждого семейства от единственной пары v -сегментов: в этом случае сочетание полипептидов, полученных от разных ig одного семейства, нельзя считать гетерологичным в истинном смысле слова. В типичном случае истинно гетерологичные комплексы, даже происходящие от AT с идентичной специфичностью (но от разных генных сегментов), не формируют АСЦ. Например, ни один из гетерологичных комплексов Н- и l-цепей 3 моноклональных igG1 человека, специфичных к стрептолизину 0, не обладает указанной специфичностью ( 146 ).
Как >и в случае исследования идиотипов рекомбинантных ig , вывод об избирательности взаимодействия Н- и l -цепей, сделанный для моноклональных ig , подтверждается и в опытах с ь- и Н-норм: ассоциация Н-цепей миеломных ig , специфичных к фосфорилхолину ( 119 ) или динитрофенолу ( 125 ), с l -норм не создает АСЦ, так же, как и ассоциация Н-норм и
ь-норм с l- и Н-цепями AT человека к стрептолизину ( 146 ).
Приведенные данные по реассоциации изолированных Н- и
ь-цепей ig мыши, крысы, человека, кролика можно обобщить
следующим образом. Константа ассоциации аутологичных полити _т пептидов может превышать ЮМ , тогда как для гетероло-
7 -Т гичных она составляет только 10 М , причем, во втором
случае v -домены вообще не вносят вклад во взаимодействие; с этим согласуется преобладание аутологичных сочетаний в условиях конкурентной реассоциации. Из данных об отсутствии специфического взаимодействия v-доменов гетерологичных полипептидов можно сделать вывод об отсутствии полноценной структуры v-района и, следовательно, какой-либо специфичности іЬетерологичннх комплексов. Действительно, если объ- V единение возможно, видимо, практически для любого сочетания полипептидов, то идиотип и АСЦ восстанавливаются только при аутологичном. Как обсуждалось выше, в типичном случае Н-цепь способна создать единственную специфичность AT, причем только в комплексе с подходящей ь-цепью. Это значит, что при рекомбинации in vitro в гетерологичных комплексах не возникает не только ни один из родительских АСЦ, но и никакой другой; этот вывод также согласуется с данными об отсутствии специфичности взаимодействия v -доменов гетерологичных Н- и l -цепей. Следовательно, не все сочетания Н- и l -цепей вносят вклад в разнообразие ig . Чтобы учесть это обстоятельство, в произведение разнообразия Н-цепей на разнообразие l -цепей при подсчете количества функциональных необходимо ввести поправочный коэффициент, который должен быть меньше единицы. Этот коэффициент можно определить экс-
периментально, как частоту сохранения исходного идиотипа и/или АСЦ случайными гетерологичными комплексами. Коэффициент может варьировать для разных семейств Ig , поэтому для корректной оценки его величины очень важны размеры выборки. Проблема выборки выглядит следующим образом: самые обстоятельные работы по избирательности объединения, формированию идиотипов и АСЦ рассматривают 44, 10 и 36 вариантов, соответственно. Недостаточность подобных выборок для решения вопроса о вкладе обсуждаемого источника разнообразия в создание
10 различных ig очевидна.
В данной работе применен принципиально иной подход: вместо увеличения выборки ва счет привлечения большого числа моноклональных ig мы получали рекомбинантные белки с использованием пула Н- и ь-цепей нормальных ig сыворотки, представляющих все разнообразие и все потенции соответствующих полипептидов организма. Исследование сочетаний Н- и L -цепей проводилось на всех трех уровнях, на которых, как мы предполагаем, может проявиться избирательность: объединение полипептидов, восстановление антигенной структуры v -доменов, восстановление АСЦ. В отличие от других авторов, также исследовавших Н- и ь-норм, но не ставивших перед собой задачи выявления общего коэффициента избирательности, мы попытались количественно охарактеризовать комплексообразование, а также экспрессию исходных идиотипов и АСЦ полученными препаратами.
Использованный экспериментальный подход позволил нагл прямо показать избирательность объединения Н- и L -цепей: не все L -норм способны взаимодействовать с индивидуальной Ы-цепью. Кроме того, мы оценили среди Н- и L-норм долю полипептидов, способных в комплесе с компетентным полипептидом
формировать ''-тестируемые v -структуру и/или АСЦ. Эта доля, по нашему мнению, и представляет собой усредненный для ig анализируемого семейства поправочный коэффициент.
