Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Негативные последствия накопления в биосфере продуктов химического синтеза 10
1.1.1. Синтетические пластики - глобальная экологическая проблема 10
1.1.2. Биологическая опасность загрязнения биосферы ксенобиотиками 15
1.2. Эколого-биотехнологические альтернативы продуктам химического синтеза 17
1.2.1. Перспективность разрушаемых пластиков 18
1.2.2. Экологический потенциал биопрепаратов 23
1.3. Биотехнологический ресурс полигидроксиалканоатов как альтернативы синтетическим полимерным материалам 31
1.4. Производство и сферы применения ПГА 42
1.4.1. Состояние и перспективы наращивания объемов выпуска ПГА 42
1.4.2. Потенциальные сферы применения ПГА 45
1.5. Закономерности биодеградации ПГА 50
1.5.1. Механизм биоразрушения ПГА в лабораторных исследованиях 50
1.5.2. Исследования биодеградации ПГА в природных условиях 59
Глава 2. Объекты и методы исследования 68
2.1. Объекты исследования 68
2.1.1. Синтези выделение полигидроксиалканоатов 68
2.1.2. Изготовление экспериментальных образцов полигидроксиалканоатов и их характеристика 70
2.2. Методы исследования свойств полимеров 71
2.2.1. Исследование химической структуры ПГА 71
2.2.2. Исследование структуры поверхности, физико-химических и физико-механических свойств полимерных образцов 71
2.3. Методы исследования биодеградации образцов полигидроксиалканоатов 73
2.3.1. Исследование биоразрушаемости образцов ПГА в лабораторных условиях 74
2.3.2. Исследование биоразрушаемости образцов ПГА в натурных экспериментах 75
2.4. Микробиологические исследования 79
2.5. Молекулярно-генетические исследования 82
2.6. Конструирование и исследование долговременных форм сельскохозяйственных препаратов, депонированных в матрикс из ПГА 84
2.6.1. Методика депонирования препаратов в полимерный матрикс 84
2.6.2. Исследование динамики оттока препаратов в почву 86
2.6.3. Исследование эффективности разработанных долговременных форм препаратов 87
2.7. Конструирование биофунгицидов, иммобилизованных на микроносителях из ПГА, и исследование их эффективности 88
2.7.1. Методы оценки эффективности биопрепарата на основе спор гриба Т. harzianum для защиты сеянцев Picea obovata (Ledeb.) 88
2.7.2. Методы определения потенциала ПГА в качестве микроносителя для создания биофунгнцидов нового поколения 89
2.8. Статистическая обработка результатов 91
Глава 3. Конструирование экспериментальных образцов ПГА и исследование процесса биоразрушения в лабораторных условиях 92
3.1. Получение и характеристика полимерных изделий из ПГА 92
3.2. Исследование разрушаемости ПГА в лабораторных условиях 97
3.3. Последствия взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкосистемах 103
Глава 4. Закономерности биоразрушения полигидрокси ажаноатов почвенными микробиоценозами 112
4.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах средних широт Сибирского региона 112
4.2. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах в тропических условиях 130
Глава 5. Закономерности биоразрушеиия ПГА в природных водоемах 148
5.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в морской воде в тропических условиях 148
5.2. Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира 162
Глава 6. Конструирование и оценка эффективности долговременных форм сельскохозяйственных препаратов, депонированных в матрикс из полигидроксиалканоатов 170
6.1. Долговременная форма гербицидного средства, депонированного в матрикс из ПГА 170
6.2. Использование ПГА для разработки пролонгированной формы азотных удобрений 177
Глава 7. Конструирование новых форм биологических препаратов защиты растений на основе иммобилизованных спор грибов Trichoderma 190
7.1. Эффективность биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma в защите сеянцев хвойных в лесопитомниках 190
7.2. Оценка эффективности новых форм биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma, иммобилизованных на носителе ПГА 198
Заключение 204
Выводы 208
Список использованной литературы 211
- Экологический потенциал биопрепаратов
- Последствия взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкосистемах
- Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах в тропических условиях
- Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира
Введение к работе
Актуальность темы. В результате активной хозяйственной деятельности и на фоне роста населения планеты во все более широком масштабе увеличивается производство и потребление химических веществ. Объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год; их основная часть скапливается на свалках, так как повторной переработке в развитых странах подвергается не более 16-20 % (Kijchavengkul, Auras, 2008; Chanprateep, 2010). Под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 тыс. га земель, в том числе плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Полиэтиленовый мусор выводит из строя канализационные и дренажные системы городов, загрязняет водоемы. По данным Green Pease, ежегодно в воды Мирового океана попадает до 10% от объемов выпускаемых пластиков (Moore et al., 2001; Tanabe et al., 2004).
Интенсивные технологии ведения сельского хозяйства требуют применения огромного количества разнообразных химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов. При этом не боле 10 % применяемых и вносимых в окружающую среду пестицидов достигает цели; основная масса этих веществ аккумулируется в биологических объектах, загрязняет почвы, водоемы, вызывает гибель полезных организмов и нарушает равновесие в природных экосистемах (Hansen et al., 2004; Hasler et al. 2010).
Традиционное повсеместное применение продуктов химического синтеза, получаемых из невозобновляемых природных ресурсов, приводит к чрезмерному росту количества неутилизируемых отходов, что вступает в противоречие с мероприятиями, направленными на защиту окружающей среды и создает глобальную экологическую проблему. Одним из путей снижения антропогенного давления на экосистемы является замена синтетических полимеров природными, которые подвержены биологической деструкции и разлагаются в естественной среде, вовлекаясь в круговорот (Kijchavengkul, Auras, 2008; Волова, 2004; Asrar, Gruys, 2002; Штильман, 2006).
Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению в практику целевых продуктов, синтезируемых микроорганизмами. Ценным продуктом биотехнологии являются микробные полигидроксиалканоаты (ПГА), которые обладают спектром полезных свойств, в том числе биосовместимостью и биоразрушаемостью. ПГА перспективны в качестве материала и изделий биомедицинского назначения, разрушаемой упаковки пищи и напитков, предметов гигиены и санитарии, изделий и препаратов для коммунального и сельского хозяйства (Sudech, Doi, 2000; Stock et al., 2000; Asrar, Gruys, 2002; Volova, 2004; Hazer et al., 2007).
Наблюдаемые сегодня наращивание объемов выпуска и расширение сфер применения ПГА делают необходимым изучение способности окружающей среды к трансформации этого вида биологической продукции. Однако количество работ, в которых были бы всесторонне рассмотрены различные аспекты разрушения ПГА в природной среде, в целом невелико; большинство исследований выполнено в лабораторных условиях без учета всей сложности этого процесса (Mergeret et al., 1993; Jendrossek et al., 2001, 2002; Bonartseva et al., 2003, Woolnough et al., 2008). Вместе с тем, разрушаемость ПГА зависит от многих составляющих, таких как химический состав и структура полимера, микробная составляющая биоты как главного агента их биодеградации, а также условий среды, которые, в свою очередь, определяются биологическими, гидротермическими, климатическими и погодными условиями. Результаты по разрушаемости ПГА, полученные в лаборатории, не позволяют прогнозировать поведение и разрушение ПГА в сложных и изменяющихся природных экосистемах. Для этого необходимо комплексное исследование, которое даст ответы на ряд ключевых вопросов: 1) как состав микробиоценоза среды влияет на процесс разрушения ПГА и какие микроорганизмы являются истинными и активными деструкторами ПГА применительно к конкретным внешним условиям; 2) какое воздействие на скорость разрушения оказывают химический состав ПГА, способ изготовления изделий, геометрия и размеры образцов; 3) как изменяются макро- и микроструктура ПГА и их свойства (кристалличность, молекулярная масса, полидисперсность) в процессе разрушения; 4) насколько значимо влияние на этот процесс физико-химических условий среды; 5) каким образом процесс разрушения ПГА будет протекать в регионах, различающихся погодными и климатическими условиями.
Необходимость проведения комплексного исследования, позволяющего адекватно и всесторонне изучить этот многофакторный процесс, послужила основанием для настоящей работы, и позволила поставить ее цель и определить задачи.
Цели и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование взаимодействия ПГА с природными микробиоценозами и выявление закономерностей биоразрушения в различных климатических зонах во взаимосвязи с физико-химической структурой полимеров.
Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:
сконструировать из ПГА различной химической структуры экспериментальные образцы изделий и изучить закономерности их биоразрушения и последствия взаимодействия с микроорганизмами в лабораторных микроэкосистемах;
исследовать биоразрушение ПГА в природных экосистемах (почвах и водоемах повышенной солености), расположенных в разных климатических зонах (Сибирский регион, тропики);
изучить особенности микробиоценозов в районах исследования и выделить доминантные микроорганизмы, участвующие в биоразрушении ПГА; с применением индикаторных сред отобрать первичных биодеструкторов;
идентифицировать на основе культуральных, морфо-физиологических и молекулярно-генетических методов доминантные микроорганизмы- деструкторы ПГА, характерные для конкретных природных микроэкосистем;
изучить динамику биодеградации ПГА в сопоставлении с микробиологическими и физико-химическими характеристиками среды с учетом химического состава и формы полимерных образцов;
исследовать изменения микроструктуры и физико-химических свойств ПГА в процессе биодеградации для формирования представлений о механизме разрушения этого класса полимеров;
оценить эффективность ПГА для конструирования экологически безопасных и адресных препаратов сельскохозяйственного назначения. Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование
закономерностей биоразрушаемости ПГА в природных условиях микробиоценозами различной структуры, функционирующими в различных климатических и погодных условиях, с учетом структуры полигидроксиалканоатов и их физико-химических свойств. Выполнены сравнительные исследования биоразрушения пленок и объемных прессованных форм из ПГА в природных микроэкосистемах: Сибирских и тропических почвах, морской тропической воде, солоноватоводном озере Шира. Установлено, что в почвах разрушение полимеров сопровождается повышением степени кристалличности; в морской воде в условиях тропиков этот показатель не изменяется, аморфная и кристаллическая фазы полимера подвергаются разрушению в одинаковой мере. Доказано, что в почве и морской воде в условиях тропиков происходит более активное разрушение образцов из гомополимера (поли-3-гидроксибутирата) по сравнению с сополимерными образцами (поли-3-гидроксибутирата-со-3- гидроксивалерата), в то время как в почвах и водоемах Сибири быстрее разрушаются образцы из сополимера. Активное разрушение ПГА имеет место
при обсемененности среды не менее 107 КОЕ в 1 г. Установлено, что ПГА стимулируют развитие микрофлоры. Впервые показано, что на поверхности полимерных образцов формируется микробиоценоз, специфичный для конкретной природной среды, качественно и количественно отличающийся от микробиоценозов контрольных образцов почвы. По совокупности культуральных, морфологических, физиологических признаков и результатов анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S и 28S рРНК идентифицированы первичные микроорганизмы-деструкторы ПГА. Во всех исследованных регионах активными деструкторами ПГА являются представители родов Bacillus, Paecilomyces и Penicillium, остальные микроорганизмы - специфичны для различных природных экосистем. Доминантными деструкторами ПГА в почвах Сибири являются бактерии родов Variovorax, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus и Xanthomonas и микромицеты Penicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium; в тропических почвах - бактерии родов Burkholderia, Bacillus, Cupriavidus, Streptomyces, Nocardiopsis, Mycobacterium, и микромицеты Gongronella, Penicillium, Acremonium, Paecilomyces и Trichoderma; в прибрежной воде Южно-Китайского моря - бактерии родов Enterobacter, Bacillus и Gracilibacillus.
Практическая значимость. Комплексное исследование процессов биоразрушения ПГА в природных средах и получение данных, необходимых для прогнозирования сценария биораспада ПГА в природе, составят основу для конструирования долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. На основе изученных закономерностей биоразрушения ПГА почвенными микробиоценозами сконструированы препараты сельскохозяйственного назначения: гербицид, азотное удобрение и биофунгицид триходермин. Показана возможность использования ПГА в качестве основы для депонирования препаратов. Установлено, что такие долговременные формы препаратов обеспечивают контролируемый выход активного начала в течение вегетационного периода растений, что позволяет сократить нормы внесения химических веществ в агроценозы и уменьшить негативное воздействие на биосферу.
Положения, выносимые на защиту:
-
-
Исследованные закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов в различных регионах, определяемые химическими свойствами ПГА и формой полимерного изделия, структурой микробиоценоза и погодно-климатическими условиями.
-
Идентифицированные микроорганизмы - первичные деструкторы полигидроксиалканоатов, специфичные для условий среды и определяющие механизм биоразрушения ПГА.
-
Научная основа для применения полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для конструирования долговременных препаратов сельскохозяйственного назначения.
Работа выполнена в рамках плановой тематики СФУ «Изучение закономерностей микробиологического синтеза разрушаемых биопластиков (полимеров гидроксипроизводных алкановых кислот, ПГА) новой структуры и выявление механизмов их взаимодействия с биологическими системами на организменном и экосистемном уровнях» и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) грант REC 002; программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты № 2.1.1.528 и РНП-11 «Фундаментальные основы конструирования полимерных микро- и наноносителей биологически активных соединений»; программы «Эколан» Т- 1.3 «Исследование закономерностей деградации биопластиков и устойчивости их к воздействию факторов внешней среды в условиях тропиков»; проекта по постановлению Правительства РФ № 220 «Ведущие ученые» Биотехнологии новых биоматериалов.
Апробация работы: материалы диссертации были представлены на XXXIII Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, НГУ, 1995), Региональной научной конференции «Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономического профиля» (Красноярск, КрасГАУ, 1995), Всероссийской научной конференции «Агроэкология и устойчивое развитие регионов», посвященной 45-летию КрасГАУ (Красноярск, КрасГАУ, 1998), IUFRO International Symposium «Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization» (Krasnoyarsk, 1998), Южно-Сибирской Региональной научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири - 2000 год» (Абакан, ХГУ, 1998), VI региональной научно-практической и методической конференции «Производительные силы Красноярского края в современных социально-экономических условиях» ( Красноярск, 1999), Annual International Research Conference «Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions» (San Diego, 1999), Международном совещании «Методы оценки состояния и устойчивости сеянцев хвойных» (Красноярск, 1999), I межрегиональном семинаре по мониторингу и защите леса (Красноярск, 2000), 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов» (Красноярск, 2001), Conference «Ecology of Soil Microorganisms» (Prague, Czech Republic, 2011), I и II Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, СФУ, 2011, 2012), BIT's 4th Annual World Congress of Industrial Biotechnology (Dalian, China, 2011), Second International Conference on Recycling and Reuse of Materials (Kottayam, India, 2011), I и II Съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 11 статей, в т.ч. 10 в специализированных журналах, рекомендованных ВАК, 2 работы в сборниках научных статей, 1 монография, 1 патент, 15 учебно-методических работ, 23 работы в сборниках материалов международных и Всероссийских конференций.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех микробиологических исследований, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 248 страницах машинописного текста и содержит 32 таблицы и 58 рисунков; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 329 источников, в т.ч. 239 зарубежных.
Экологический потенциал биопрепаратов
Скорость и многообразие происходящих фитосанитарных изменений на фоне селектирующего давления пестицидов сегодня определяют биотическую неустойчивость не только в пределах отдельных полей или культур, но и в масштабе экосистем (Коваленков, 2010). Эффективность сельскохозяйственных технологий в производстве продуктов питания зависит от многих факторов, включая эколого-географи-ческие и экономические, а также от возобновляемых биологических ресурсов, таких, как культурные растения, домашние животные, микроорганизмы. Повышение биологической продуктивности в сельском хозяйстве является предметом активных исследований комплекса различных биологических наук. Использование микроорганизмов в качестве биопестицндов - сравнительно новое направление биотехнологии, но уже имеющее существенные достижения.
Анализ научных отчетов ЫИУ РАСХН показал, что в настоящее время наукой обеспечен значительный результативный задел по завершенным научным разработкам. Так, в ВИЗР создано 7 биопрепаратов, которые прошли государственные испытания и включены в Государственный каталог пестицидов и агрохнмикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Отечественные биопрепараты не только имеют серьезные экологические преимущества перед химическими, но и вполне конкурентоспособны по экономическим показателям на широком спектре вредителей и возбудителей заболеваний. Эти разработки имеют признание во многих зарубежных странах и подтверждают реальность прогноза, сделанного Международной организацией по биологической борьбе с вредными животными и растениями «IOBC-Global» о том, что доля биологической защиты в мире к 2050 г. составит 35-40 % (Гончаров, 2010).
В настоящее время бактерии, грибы, вирусы находят все более широкое применение в качестве промышленных биопестицидов. Технология производства этих препаратов различна, как различна природа и физиологические особенности микроорганизмов-продуцентов. Однако имеется ряд универсальных требований, предъявляемых к биопестицидам, основными среди них являются: селективность и высокая эффективность действия, безопасность для человека и полезных представителей флоры и фауны, длительная сохранность и удобство применения, хорошая смачиваемость и прилипаемость.
В США, Канаде, Японии, странах Европы для борьбы с различными болезнями сельскохозяйственных растений используются ряд антибиотических веществ. Чаще всего это производные стрептомицина, актидиона, террамицина и других антибиотиков, которые применяются как в чистом виде, так и в различных смесях. В России широко испытываются такие немедицинские антибиотики, как трихотецин и фитобактериомицин (фитолавин) (Биологические средства..., 2005). Хотя к настоящему времени известно около 4000 микробных метаболитов, обладающих антибиотическими свойствами, и около 35000 их синтетических производных и аналогов, в практике защиты растений в нашей стране получили распространение лишь несколько препаратов. Одна из причин -запрет на применение в сельском хозяйстве всех тех препаратов (независимо от их высокой эффективности), которые применяются в медицине (Новикова и др., 2009).
Для защиты растений и животных от насекомых и грызунов применяются, помимо антибиотиков, около 50 микробных препаратов, относящихся к трем группам: это бактериальные, грибные и вирусные препараты.
Среди бактериальных форм широко распространены препараты, созданные на основе бактерий родов Psendomonas и Bacillus. Они способны усваивать различные органические субстраты, обладают более быстрым ростом по сравнению с другими обитателями ризосферы, легко внедряются в корневую систему различных культур растений. Бактерии способны также синтезировать регуляторы роста, растворять минеральные фосфаты. Они продуцируют антибиотики и сидерофоры, которые связывают катионы железа в комплексы, недоступные фптопатогенам. Обработка семян суспензиями бактерий повышает энергию прорастания семян, ограничивает развитие болезней, способствует повышению продуктивности растений (Dowling, CTGara, 1994; Gravston, Campbell, 1995; Shishido et al.,1996, Tombolini et al., 1999).
В нашей стране разработаны биопрепараты псевдобактерин-2 {Pseudomonas aureofaciens BS 1393), ризоплан, РИЦ, планрнз {Pseudomonas fluorescens АР-33) Алирип-Б {В. subtilis 10-ВИЗР), Гамаир {В. subtilis М-22 ВИЗР) (Ченкин и др., 1990; Ярошенко, 1996).
Из зарубежных продуктов известны препараты на основе Burkholderia cepatica (Blue Circle, Deny, Intercept), а также препараты на основе P. fluorescens (BlightBan A506, Conquer, Victus).
Бактериальные препараты эффективны также в борьбе с вредителями растений. К настоящему времени описано свыше 90 видов бактерий, инфицирующих насекомых. Большинство промышленных штаммов принадлежит к роду Bacillus, и основная масса препаратов (свыше 90 %) изготовлена на основе Bacillus thuringiensis (Bt), имеющих свыше 22 серотипов. Препараты на основе Bt относятся к токсинам кишечного действия. Бактерии группы Bacillus thuringiensis эффективны в отношении 400 видов насекомых, включая вредителей полей, леса, садов и виноградников; наибольший эффект от применения данных препаратов получают при борьбе с листогрызущими вредителями. Известно более 100 штаммов Bt, объединенных в 30 групп по серологическим и биохимическим признакам. Микробиологическая промышленность многих стран выпускает различные препараты на основе Bt, способных образовывать споры, кристаллы и токсические вещества в процессе роста: энтобактернн, инсектин, дендробацнллин, битокснбациллин, Dipel (США, Канада), Biothur (Испания), Vectobac, Thuricide, AquaBac (США) (Bravo et al., 2011; Булушова и др. 2011).
Использование живых культур бактерий-антагонистов для борьбы с грибными заболеваниями растений не получило широкого распространения в связи с непостоянством наблюдаемого защитного эффекта. Причинами этого является сложность взаимоотношений между микроорганизмами ризосферы и растениями, а также неустойчивость во внешней среде (Полянская и др., 1994).
Были предприняты попытки создать более устойчивые биопрепараты, показывающие стабильные результаты. Научная группа Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН и ООО НПФ «Альбит» разработала препарат Альбит, содержащий очищенные действующие вещества из бактерий Bacillus megaterium и Pseudomonas aweofaciens. В состав препарата также входят хвойный экстракт (терпеновые кислоты), сбалансированный стартовый набор макро- и микроэлементов. В отличие от биопрепаратов, содержащих живые микроорганизмы, действие Альбита стабильнее, менее подвержено влиянию условий внешней среды (Янушевская, Карпуп, 2011; Скоробогатова и др. 2010).
К перспективной группе биопрепаратов (группа контактного действия) относятся грибные. Многочисленные виды энтомопатогенпых грибов широко распространены в природе; они поражают широкий круг насекомых, обладая для этого различными механизмами, включая контактный, что облегчает их применение. Однако грибные препараты не применяются пока достаточно широко. Это связано, во-первых, с определенными технологическими трудностями, возникающими при их культивировании и, во-вторых, -обусловлено жесткими требованиями к факторам окружающей среды (высокая активность грибных препаратов проявляется только в условиях высокой и стабильной влажности). Известны сотни видов энтомопатогенных грибов, но наиболее перспективными считаются две группы грибов -мускардинные грибы из класса Euascomycetes и энтомофторовые из семейства Entomophtohraceae. Основное внимание привлекают следующие грибные патогены: возбудитель белой мускардииы (род Beauveria), возбудитель зеленой мускардииы (род Metarrhizium) и Enthomophthora, (поражающий сосущих насекомых). Заражение насекомых грибными патогенами, в отличие от других микроорганизмов, может происходить на различных стадиях развития - в фазе куколки или имаго (Климова, 2002; Сергеев, Лачшшнскнй, 2007; Lewis et al., 2002)
Для защиты растений от фитопатогенных грибов часто используются высокоактивные штаммы из рода Trichoderma. У видов рода Trichoderma наблюдается множественное взаимодействие с другими грибами, включая конкуренцию за питание, образование антибиотиков и паразитизм (Якименко, Гродницкая, 1996; Wardle et al., 1993; Сейкетов, 1982; Sivan, Chet, 1989).
Trichodenna образует разнообразные литические ферменты: Р-1-3-глюканазу, хитиназу, манназу, ламипариназу, целлюлазу и протеазы, которые способны разлагать основные полимеры, входящие в состав клеточной стенки хозяина, и способствуют поглощению питательных веществ микопаразитами. Разные виды рода Trichoderma выделяют токсические вещества, обладающие антибиотическими свойствами: триходермин, соцукаллин, дермадин, виридин, глиотоксин, алламицин и др. В основе их действия лежит механизм вмешательства в процессы биосинтеза белка или хитина в клетках фитопатогенов. (Di Pietro et al., 1993; Lorito et al., 1994; Baek et al., 1999; Cruz et al., 1993; Mondal et al., 1996; Великанов и др., 1994; Ghisalberti, Sivasithamparam, 1991).
Последствия взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкосистемах
Микроорганизмы по своей физиолого-биохимической природе являются наиболее чувствительными индикаторами любого изменения химико-экологической обстановки окружающей среды (Наливайко, 2000; Macler, 2000). Искусственное внесение в почву любого субстрата вызывает сдвиги в составе и структуре микробного сообщества. Высокая активность той или иной функциональной группы может служить индикатором деградационных процессов, протекающих в почве.
В работе оценивали последствия внесения образцов ПГА в почвенные лабораторные микрокосмы и влияния полимера в процессе биоразрушения в качестве субстрата на численность и состав микроорганизмов. В целом, присутствие ПГА в почве стимулировало рост численности микроорганизмов, не снижало видового разнообразия микробных сообществ и приводило к селективному формированию микробных комплексов в пленках обрастания на поверхности образцов полимера.
Микробиологический анализ контрольных почвенных проб и соскобов с поверхности полимерных образцов на 30 сутки экспонирования выявил различия в количественном и качественном составе микробиоценозов. Было установлено положительное влияние ПГА на развитие микроорганизмов, обнаружено увеличение количества бактерий, в том числе актинобактерий, на поверхности полимерных образцов (пленок и объемных форм) по сравнению с контролем - фоновой почвой (табл. 3.5).
Полимер как дополнительный источник углеродного питания в почве стимулировал развитие этих групп микроорганизмов. В то же время количество пропагул микромицетов во всех образцах оставалось на контрольном уровне. Вероятно, основную роль в деструкции полимеров в данном микробиоценозе играли бактерии.
По соотношению функциональных групп микроорганизмов исходная почва характеризовалась законченностью процессов минерализации и зрелым микробным сообществом: коэффициент минерализации составлял 1,25, олиготрофности - 0,03. Сравнительный анализ показал изменение соотношения функциональных групп в структуре микробиоценов, сформировавшихся в виде пленок обрастания на поверхности образцов ПГА относительно микробноценоза фоновой почвы (табл. 3.6).
Присутствие ПГА в почве стимулировало развитие копиотрофов и прототрофов; в результате этого коэффициенты минерализации уменьшились до 0,02-0,04. Это является свидетельством активных процессов деструкции органического вещества в почве и накопления продуктов распада ПГА в виде ди- и мономеров в качестве дополнительного и доступного для микроорганизмов субстрата.
Абсолютная численность олиготрофов в образцах почвы с поверхности пленок достоверно не различалась, однако из-за высокой численности копиотрофов коэффициенты олиготрофности микробиоцеиозов на поверхности полимерных образцов значительно снизились по сравнению с контрольными пробами почвы, до 0,0003-0,0004. В микробиоценозах пленок обрастания на поверхности образцов полимера увеличивалось количество азотфиксаторов: в 20 раз - на пленках и несколько ниже, - в 13,5 раз на объемных компактах. Вероятно, это связано с изменением соотношения углерод/азот в почве в результате обогащения последней углеродсодержащими продуктами биораспада ПГА.
Из почвенных образцов было выделено и проанализировано 40 изолятов бактерий и 28 изолятов микроскопических грибов. В сравнительном аспекте исследован качественный состав контрольных и сформировавшихся экспериментальных микробиоценозов; выделены и идентифицированы доминирующие бактерии и микромицеты (табл. 3.7).
В микробном комплексе фоновой почвы доминировали грамотрицательные бактерии (до 50 %); также выделены грамположительпые неспорообразующие бактерии (32 %), споровые формы бактерий (12 %) и грамположительные кокки (9 %). Во всех образцах с поверхности полимеров зафиксировано увеличение количества спорообразующих бактерий (в том числе актинобактерий) (до 40 %) на фоне снижения относительно контроля грамотрицательных палочек. В то же время в микробиоценозах, формирующихся на поверхности образцов полимера, увеличивалось видовое разнообразие микроорганизмов. В контрольных пробах почвы обнаружены представители Pseudomonas sp., Bacillus megaterium, Bacillus sp., Flavobacterium sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp., Acinetobacter sp., Coiynebacterium sp., Arthrobacter sp., Streptomyces sp (рис. 3.11).
Оценка влияния наличия ПГА в почве на численность и состав микромицетов показала иную динамику (табл.3.9). Сравнительный анализ количества микромицетов в контрольной почве и на поверхности полимера не выявил различий, однако в качественном составе обнаружены существенные изменения. В контрольной почве преобладали грибы из рода Penicillium (67 %); встречались также Aspergillus (12 %), Trichoderma (9 %), Mucor (7 %), Cladosporium (5 %).
На поверхности образцов полимера сообщество микромицетов было более разнообразным, тем не менее, грибы рода Penicillium сохранили доминирование, составляя 56 % от всех обнаруженных в данных пробах видов (табл. 3.7); на втором месте были грибы рода Асгетотит (11 %); реже встречались Trichoderma, Alternaria, Fusarium, Gliocladium, Monilia, Mucor, Cladosporium; грибов из рода Aspergillus не обнаружено.
В микробиоценозах на поверхности ПГБ отмечено большое разнообразие микроорганизмов, включая Pseudomonas sp., Celhdomonas sp., Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus sp., Flavobacterium sp., Micrococcus sp., Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Mycobacterium sp., Acinetobacter sp., Corynebacterium sp., Arthrobacter sp., Planomonospora sp., Streptomyces sp.
Несмотря на высокую численность бактерий в пленках обрастания на поверхности образцов полимера, деструкторов среди них было значительно меньше. Исследование ПГБ-деполимеразной активности у микроорганизмов на диагностической среде с единственным источником углерода мелкодисперсным порошком ПГА, позволило выявить истинных деструкторов. Среди них идентифицированы представители Bacillus cereus П4, Mycobacterium sp. П8, Streptomyces sp. ПІ 2, Pseudomonas sp. П6.
Остальные бактерии, выделенные из пленок обрастания, не обладали ПГА экзодеполимеразой. Вероятно, они могли усваивать продукты биораспада полимера, представляя, таким образом, второй и последующие трофические уровни в сформированном микробиоценозе.
Следует отметить, что доля истинных ПГА-деструкторов в фоновой почве была низкая, около 4 % от общей численности; в пленках обрастания количество ПГА-деструкторов возросло до 38 %. В литературе нет сведений относительно того, к какому типу ферментов относятся ПГА-экзодеполимеры (конститутивному или индуцибельному). Обнаруженный факт значительного увеличения количества микроорганизмов-деструкторов ПГА в микробиоценозах, формирующихся на поверхности образцов полимера в течение короткого периода времени (30 суток), позволяет рассматривать индуцибельную природу фермента.
В исследованных условиях микроскопические почвенные грибы наряду с бактериями участвовали в биодеградации полимера. Из 28 изученных штаммов деполимеразной активностью в отношении ПГБ обладали 9 штаммов (рис. 3.12): из них 3 штамма, выделенные из контрольной почвы, отнесены к роду Penicillium; из почвы с поверхности полимера выделены представители родов Penicillium (2 штамма), Acremonium (3 штамма), и Trichoderma (1 штамм).
Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах в тропических условиях
Исследования проведены в тропических условиях в почве на климатических испытательных станциях (КИС), расположенных вблизи Ханоя (КИС «Хоа Лак») и Нячанга (КИС «Дам Бай»).
Исследовали образцы полимеров двух типов: гомополимера поли-3-гидроксибутирата (ПЗГБ), и сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (ЗГБ/ЗГВ) в виде пленок - 2D (диаметр 30 мм, толщина 0,08-0,12 мм) и объемных форм - 3D (диаметр 10 мм, толщина 3 мм). В качестве контроля сравнения использовали полиэтиленовые пленки ПВД ГОСТ 10354-82 (диаметр 30 мм, толщина 0,1 ± 0,01 мм). Образцы полимеров каждого типа были помещены в чехлы из мелкоячеистого мельничного газа и размещены в почве на глубине 5 см. Эксперимент длился с 14 мая 2010 по 15 марта 2011 на КИС Хоа Лак и с 7 мая 2010 по 28 мая 2011 на КИС Дам Бай.
Почвенно-климатические условия в районах исследования различались по ряду показателей (табл. 4.6). Температура и влажность воздуха, температура почвы были близкими в течение периода экспозиции. Однако количество осадков на станции Хоа Лак было практически на порядок выше, чем на станции Дам Бай. Кроме того, для почвы Хоа Лак были характерны более низкие значения рН (5,5), чем для почвы Дам Бай (6,6). Эти различия оказали влияние на микробиологические показатели почв и, соответственно, на процессы биоразрушения ПГА.
Биоразрушение образцов ПГА обоих типов происходило активнее в почвах Хоа Лак: пленки из гомополимера разрушились более чем на 98 % через 6 месяцев экспозиции на КИС Хоа Лак и только на 48 % через год на КИС Дам Бай (рис. 4.7). Кривая динамики убыли массы пленок из ПЗГБ имеет вид, отличный от аналогичных кривых, полученных в других экспериментах: в этом случае из-за быстрого разрушения образцов не удалось зафиксировать латентную фазу, уже через месяц экспозиции остаточная масса пленок составила около 57 %. Вероятно, длительность латентного периода могла составлять не более 7-10 суток. Во всех остальных случаях масса образцов уменьшалась постепенно. При этом скорость убыли массы пленок из сополимера была сопоставима со скоростью разрушения объемных прессованных форм.
Объемные прессованные формы ПЗГБ за 10 месяцев экспозиции разрушились на 60 и 28 % на Хоа Лак и Дам Бай соответственно. Следует отметить, что в обоих районах исследований зафиксировано более быстрое разрушение образцов пленок и объемных форм, изготовленных из гомополимера ПЗГБ по сравнению с сополимерными образцами ПЗГБ/ЗГВ. Так, длительность периодов, за которые масса пленок уменьшилась на Уг от исходной, составила для ПЗГБ - 46, а для ПЗГБ/ЗГВ - 260 суток в почвах на Хоа Лак. В районе станции Дам Бай образцы из сополимера за год разрушились лишь на 8-14 %.
Полученные результаты отличаются от аналогичных показателей характера деградации ПГА в почвах Сибири, где биоразрушение образцов из сополимера происходило быстрее, чем из гомополимера. Однако есть ряд работ, в которых отмечено более быстрое разрушение ПЗГБ по сравнению с ПЗГБ/ЗГВ изолятами бактерий-деструкторов (Manna, Paul, 2000), актиномицетов (Manna et al., 1999) и грибов (Sanyal et al., 2006; McLellan, Hailing, 1988). Такое расхождение связано с различием микробиоценозов почв и, соответственно, субстратной специфичностью ПГА-экзодеполимераз, продуцируемых микроорганизмами-деструкторами (Manna, Paul, 2000).
В условиях тропиков происходило значительное падение средневесовой молекулярной массы всех образцов ПГА, а также возрастала полидисперсность, что свидетельствовало о протекании процесса деструкции С-цепей полимера и образовании более мелких фрагментов с различной степенью полимеризуемости (табл. 4.7).
По результатам рентгеноструктурного анализа установлено незначительное возрастание степени кристалличности практически всех исследованных образцов ПГА в ходе разрушения. При этом более выраженное изменение величины Сх зарегистрировано для сополимерных образцов, что свидетельствует о преимущественном разрушении аморфной фазы ПГА почвенной микрофлорой в условиях тропиков.
Внешний вид образцов в ходе их деградации представлен на рис. 4.8. Пленки из ПГА разрушались быстрее по сравнению с объемными формами. При этом нельзя не отметить, что для медленно разрушающихся прессованных форм получено более значительное снижение молекулярной массы ПГА.
Эти отличия можно объяснить тем, что при биоразрушении плотных и гладких пленочных образцов ПГА атаке микроорганизмами и экскретируемыми ими ферментами подвергается в основном поверхность; при этом экзодеполимеразы, не проникая внутрь образца, мало влияют на молекулярную массу оставшейся (недеградировавшей) части. Деградация пленок из ПГА посредством лишь поверхностной эрозии отмечена и другими исследователями (Lim et al., 2005). В то же время, наличие микропор на стыках порошкообразных микрочастиц ПГА, из которых спрессованы объемные формы, делает возможным проникновение ферментов внутрь и разрушение материала в толще образца.
Таким образом, в условиях тропиков механизм разрушения структуры полимера аналогичен протекающему в почвах Сибири, - имело место более быстрое разрушение под воздействием деполимеризующих ферментов микроорганизмов аморфной фазы и возрастание упорядоченной, которая, по мнению ряда авторов, как было отмечено выше, более «трудна» для атаки ферментов по сравнению с аморфными регионами полимера. Этот результат получен при исследовании образцов ПГА, разрушающихся в сибирских почвах. Однако падение величины средневесовой молекулярной массы ПГА (Мв) в тропических условиях было более выраженным по сравнению с результатами, полученными в условиях Сибири.
Выявленные отличия в кинетике и механизме биоразрушения ПГА связаны с особенностями микробной составляющей исследуемых почв. Анализ результатов исследования микробиоценозов контрольных образцов почвы двух исследуемых районов Вьетнама показал существенные различия. Так, общая численность бактерий в почвах Хоа Лак составила 16 млн. КОЕ в 1 г, тогда как в почвах станции Дам Бай - 8 млн. КОЕ в 1 г. Численность микромицетов различалась на порядок - 84 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Хоа Лак и 8,0 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Дам Баи (табл. 4.8)
Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира
Озеро Шира (республика Хакасия, Россия) является объектом многолетних и комплексных исследований, проводимых под руководством академика А. Г. Дегерменджи. Однако исследований по деградации ПГА или иных материалов или веществ в озере до настоящего эксперимента не проводили. Впервые задача исследования биоразрушения ПГА в озере Шира была поставлена в 2007 году.
Солноватоводное меромиктическое озеро Шира - термически стратифицированный водоем с сероводородной зоной в гиполимнионе. Глубина 3 м соответствует эпилимниону (теплые поверхностные воды, летние температуры порядка 20 С, оксигенные процессы); глубина 9 м-гиполимниону (холодные воды, летние температуры порядка 6"С, оксигенные процессы); глубина 13 м- хемоклину (температура порядка 2С, зона перехода от оксигенных к аноксигенным условиям); глубина 20 м монимолимниону (температура порядка 1С, неперемешивающиеся воды под хемоклином, анокснгенные процессы). Эпилимнион характеризуется высокой численностью бактериопланктона. В зоне хемоклнна наблюдается максимум развития пурпурных бактерий, в придонных слоях - сообщества метаногенов и сульфатредуцирующих бактерий, играющих решающую роль в процессах терминального разложения органического вещества (Пименов и др. 2003).
Исследование разрушаемости ПГА проведено на различных глубинах озера - 3, 9, 13 и 20 м - с учетом горизонтов стратификации. Образцы ПГА двух типов (гомополимера ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/ЗГВ с включение 3-гидроксивалерата 10 мол.%) в виде пленочных дисков диаметром 30 мм и толщиной 0,1 мм, аналогично другим экспериментам, помещали в чехлы и погружали в воду. Эксперимент проведен в период с 13 июня по 29 августа 2007 г. В ходе натурных наблюдений анализировали изменение массы полимерных образцов различной химической структуры в динамике, через каждые 20 суток, с учетом состояния водоема (температуры, концентрации кислорода, показателей рН и солености в каждом горизонте).
Динамика гидрохимических показателей озера Шира в течение летнего сезона 2007 года представлена на рисунке 5.11. В эпилимнионе температура воды была подвержена наибольшим изменениям: в начале эксперимента (июнь) она составляла 13"С, в середине июля достигала мкеимальных значений 23-24 С, в конце августа опусклась до 18 С. На глубине 9 м температура была подвержена меньшим колебаниям - от 12 до 18 С в течение наблюдаемого периода. В хемоклине и монимолимнионе температура воды практически не изменялась и в среднем составляла 5,0-6,0 и 1,5-2,0 С соответственно. Соленость воды варьировала от 10,6-11 %о на верхних горизонтах озера до 12-12,5 %о - ниже хемоклнна; значения рН составляли от 8,9 в верхних горизонтах до 8,5 - ниже хемоклнна.
Наиболее активно разрушение образцов ПГА происходило на глубине 3 м, где через 50 суток экспонирования масса пленок из гомополимера (ПЗГБ) уменьшилась на 9,0 % от исходной, масса пленок из сополимера - на 15,8 %. По данным Н. В. Пименова с соавт. (2003) на этом горизонте регистрируется высокая концентрация бактерий планктона, а поскольку основной механизм разрушения ПГА в окружающей среде связан с ферментативной активностью бактерий, поэтому в верхних прогреваемых и аэрируемых горизонтах водоема возникали благоприятные условия для его деградации.
На глубине 9 м достоверного изменения массы образцов пленок обоих типов ПГА не обнаружено. Это объясняется преобладанием автотрофных микроорганизмов и небольшой долей органотрофных деструкторов, т.к. на данном горизонте озера Шира находится зона активного фотосинтеза с максимальной концентрацией хлорофилла и биомассы цианобактерий и зеленых водорослей (Gaevsky et al., 2002).
При дальнейшем увеличении глубины погружения до 13 м убыль массы образцов продолжала регистрироваться. Разрушение полимерных пленок было замедленным, по сравнению с верхним горизонтом, однако более быстрым, по сравнению с зоной активного фотосинтеза.
Примечательно, что деградация образцов зафиксирована также в монимолимнионе (20 м), для которого характерны отсутствие кислорода, наличие сероводорода и низкие температуры. В конце периода наблюдения на этом горизонте отмечено снижение массы гомополимера ПЗГБ на 9,2 %, сополимера — на 16,2% от исходных величин. Это свидетельствует об активном участии анаэробной микрофлоры в ассимиляции ПГА в водоемах, что подтверждается данными (Janssen, Schink, 1993). Однако в работах (Abou-Zeid 2001, 2004) показано, что гомополимер разрушался быстрее сополимера при участии анаэробных бактерий рода Clostridium.
В силу особенностей гидробиологических характеристик озера Шира, в целом, медленно реализуемая биодеградация ПГА проходила при периодах уменьшения массы образцов на !4 от 73 суток для сополимера до 120 суток для гомополимера в эпилимнноне и от 240 до 320 суток для соответствующих типов полимеров в хемоклине и монимолимнионе при сохранении существующей динамики биоразрушенпя и убыли массы образцов.
Ввиду незначительной убыли массы полимерных образцов, проанализированы (с использованием ВЭЖХ) средневесовая (Мв), среднечисловая (М„) молекулярная массы, а также степень полидисперсности полимера (ПД), достоверно отражающие течение процесса разрушения полимерных цепей (табл. 5.5). На всех горизонтах, за исключением 9 м, зафиксировано снижение М„и М„,при этом более значительное на глубине 3 м, что согласуется с динамикой уменьшения массы образцов. Более заметным было снижение молекулярной массы для образцов сополимера ПЗГБ/ЗГВ по сравнению с гомополимером. Полидисперсность ПГА при этом возрастала, что является показателем имеющего место процесса дефрагментации полимерных цепей и появления большего разнообразия фрагментов различной длины.
Зафиксированное снижение молекулярной массы на всех горизонтах является свидетельством протекания процесса биоразрушения ПГА в озере Шира на глубинах до 20 м, как в оксигенных, так и в аноксигенных зонах водоема. При этом показано, что в целом процесс замедлен по сравнению с пресноводными озерами, в которых аналогичные образцы ПГА разрушались значительно быстрее, однако этот процесс также зависел от гидротермических условий водоема и структуры бактериопланктона (Волова с соавт., 2006; Volova et al., 2007).
Похожие диссертации на Экологическая роль полигидроксиалканоатов - закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами
-
