Введение к работе
Актуальность темы. В природных экотопах основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, определяемых общим термином «биопленки»: пространственно и метаболически структурированных сообществ, заключенных во внеклеточный полимерный матрикс и расположенных на границе раздела фаз [Николаев, Плакунов, 2007]. Между микробными компонентами биопленок существуют многообразные метаболические взаимоотношения, при которых взаимодействие имеет либо односторонний характер, например, потребление кислорода аэробными микроорганизмами, обеспечивает возможность сосуществования анаэробных форм [Costerton et al, 1994], либо наблюдается взаимное положительное влияние компонентов биопленок друг на друга [Wolin, Miller, 1988]. В таких случаях могут устанавливаться взаимоотношения, близкие к симбиозу, при которых образование или потребление какого- либо субстрата в биопленке происходит с большей интенсивностью, чем в случае свободных (планктонных) популяций. Это, например, происходит в рубце жвачных животных в биопленках, состоящих из целлюлолитиков и их спутников, неспособных к гидролизу целлюлозы. Последние потребляют продукты гидролиза, репрессирующие биосинтез целлюлаз, и, таким образом, повышают образование этих ферментов [Weimer, 2003].
Существование близкой ситуации можно предполагать в заводняемых
нефтяных месторождениях, где единственным источником углерода служит нефть.
Из пластовых вод таких месторождений наряду с нефтеокисляющими
микроорганизмами («продуцентами») можно выделить множество
хемогетеротрофных аэробных и анаэробных микроорганизмов-спутников (диссипотрофов), которые неспособны утилизировать компоненты нефти, но растут за счет продуктов ее деградации. Однако их влияние на микроорганизмы-нефтеокислители практически не изучено. Между тем, взаимодействия микроорганизмов в биопленках, которые, по данным ряда исследователей, формируются в нефтяном месторождении [Sanders, Sturman, 2005], может существенно влиять на их биогеохимическую активность, особенно в месторождениях с экстремальными условиями среды. Изучение воздействия микроорганизмов-спутников на нефтеокислители важно также при создании препаратов для очистки природных субстратов от нефтяных загрязнений. Поэтому изучение этих взаимоотношений представляет большой научный и практический интерес.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является частичная реконструкция биопленок, характерных для нефтяных месторождений с различными физико-химическими условиями, и изучение взаимодействия их микробных компонентов, связанных трофическими и другими связями. Особое внимание уделено возможности защитного и регуляторного воздействия спутников (неспособных к окислению нефти) на нефтеокисляющие микроорганизмы.
Задачи исследования:
1. Разработать методы частичной реконструкции биопленок из пластовых
вод нефтяных месторождений.
2. Изолировать из реконструированных биопленок чистые культуры
нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников, неспособных к
окислению нефти. Изучить их физиолого-биохимические свойства и
определить таксономическую принадлежность.
3. Изучить характер взаимодействия галотолерантных нефтеокислителей и
их галофильных спутников в модельных бинарных биопленках,
полученных из пластовых вод с повышенной соленостью.
4. Изучить возможность протокооперативных взаимоотношений между
нефтеокисляющими микроорганизмами и их неспособными к окислению
нефти спутниками.
Научная новизна. Впервые разработаны методы частичной реконструкции биопленок, содержащих ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов и их бактерий-спутников, неспособных к окислению нефти, из пластовых вод нефтяных месторождений.
Впервые установлено, что галофильный спутник (неспособный к окислению нефти) оказывает защитное действие против осмотического шока на входящий в общую с ним ассоциацию нефтеокислитель.
Впервые расшифрован механизм защитного действия галофильного спутника на нефтеокисляющий микроорганизм, состоящий в образовании осмопротекторного вещества эктоина, обеспечивающего рост нефтеокислителя при ингибиторных уровнях соли.
Впервые показано, что в реконструированных биопленках бактерии-спутники способствуют более полной утилизации углеводородов микроорганизмами-нефтеокислителями.
Научно-практическая значимость. Полученные автором результаты позволяют рекомендовать в случае биотехнологического использования нефтеокисляющих микроорганизмов (например, для повышения нефтеизвлечения или для биоаугментации природных субстратов: воды, почвы в экстремальных условиях и др.) использовать не только смеси нефтеокислителей, как в большинстве препаратов, предназначенных для очистки от нефтяных загрязнений, но и вводить в эти препараты микроорганизмы-спутники, повышающие активность нефтеокислителей и/или защищающие последние от стрессовых факторов среды. Использование дополнительных микробных компонентов, активирующих или защищающих основные микроорганизмы, формирующие такие биореакторы, в ряде случаев может существенно повышать эффективность всего биотехнологического процесса.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Молодежной международная школе-конференции: «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2006; IV Московском международном конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития». Россия. Москва. 2007; Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Россия. Москва. 2007; IV Молодежной школе-конференции с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2008.
Публикации. По теме диссертации, опубликовано 7 печатных работ, из них 3 экспериментальных статьи, а также 4 тезисов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (178 источников). Текст проиллюстрирован 28 рисунками и 7 таблицами.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю работы д.б.н. проф. Плакунову В.К., а также своим соавторам д.б.н., проф. С.С.Беляеву и Е.А.Стрелковой за консультации и помощь в работе; д.б.н. Т.Н.Назиной , к.г-м.н. И.А.Борзенкову, к.б.н. А.Л.Тарасову за предоставление проб пластовой воды, Б.Б.Кузнецову за анализ последовательности генов 16S рРНК, к.б.н. Н.А.Кострикиной за помощь в проведении электронномикроскопических исследований.
Работа проводилась при частичном финансировании в рамках проектов РФФИ 04-04-49118-а, 04-04-49710-а, 07-04-01011-а, а также Соглашения о предоставлении субвенций №01.168.24.049 от 18 августа 2006 года между Федеральным агентством по науке и инновациям и Институтом микробиологии им. СИ. Виноградского РАН.
