Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время большое внимание уделяется разработке и внедрению биотехнологических методов синтеза разнообразных химических соединений. Способность ферментов трансформировать органические вещества в более мягких по сравнению с химическими процессами условиях (невысокие температура и давление) позволяет выделить биокаталитические технологии в число приоритетных направлений (Vejvoda, et al., 2006, Cantarella, et al., 2010, Яненко, 2006). В биотехнологических производствах чаще всего используют целые микробные клетки, т.к. в этом случае не требуется проведение дорогостоящего процесса выделения и очистки фермента (Халгаш, 1991).
Цианопиридины – это ароматические нитрилы, в составе которых цианогруппа связана с пиридиновым кольцом. В результате гидролиза цианопиридинов образуются пиридинзамещенные амиды и карбоновые кислоты, которые являются витаминами, предшественниками фармацевтических препаратов и различных химических соединений.
Витамины группы PP (никотинамид и никотиновая кислота) являются необходимым элементом питания и распространенным лекарственным средством. Изоникотиновая кислота - промежуточный продукт в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты (изониазид, фтивазид, метазид и др.), антидепрессантов – ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств (фенкарол, оксилидин, ацеклидин); пиколиновая кислота – предшественник 6-метилпиколиновой кислоты, промежуточного продукта синтеза димеколина.
Основным природным источником пиридиновых соединений являются продукты коксования каменного угля. В химико-фармацевтическом производстве -пиколиновую фракцию (предшественник никотинамида и никотиновой кислоты), содержащуюся в коксовом газе, подвергают конденсации в жестких условиях под давлением с формалином. Присутствующую в ней -пиколиновую фракцию (предшественник изоникотиновой кислоты) отделяют формалином с последующей отгонкой и окислением азотной кислотой (Патент РФ № 2175968) Также возможно прямое окисление -пиколина кислородом воздуха на ванадий-титановом катализаторе в температурном диапазоне 250-480С, при этом в настоящее время чаще используют синтетический -пиколин (Bhalla, et al., 2009, Патент РФ № 2371247). Известен также химический гидролиз цианопиридинов, который инициируется повышенной температурой и характеризуется неконтролируемой экзотермичностью (Патент РФ № 2175968, Натрадзе, 1983). Кроме того, никотиновую кислоту получают химическим синтезом, включающим стадию окисления 2-метил-5-этилпиридина, или гидролизом 3-цианопиридина при высоких температурах (330С) и давлении (290 атм.) (Almatawah, et al., 1999). Биологический способ получения ароматических амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, основанный на ферментативном гидролизе, выгодно отличается от химического мягкими условиями проведения процесса, экологической безопасностью и высокой степенью конверсии.
Ферментативный гидролиз цианопиридинов до соответствующих амидов и карбоновых кислот осуществляется ферментами нитрилгидратазно-амидазной и нитрилазной систем микроорганизмов. Способность к трансформации ароматических нитрилов встречается как у представителей родов бактерий Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter, Agrobacterium, Microbacterium, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter (Almatawah, et al., 1999, Kamble, et al.,2008,
Cantarella, et al., 2012, Забазная, и др., 1998), так и среди грибов родов Fusarium, Giberella, Aspergillus, Pinicillum, Talaromyces и др. (Bhalla, et al., 2009, Kaplan, et al., 2006). Известны биотехнологические процессы, основанные на гидролизе алифатических нитрилов. Так, компанией «Биоамид» (г. Саратов, Россия) был внедрен процесс, заключающийся в биокаталитическом производстве акрилата аммония из нитрила акриловой кислоты штаммом Alcaligenes denitrificans C-32 – продуцентом нитрилазы (КФ 3.5.5.1) (Глинский, и др., 2010). Крупнотоннажное производство акриламида основано на гидратации акрилонитрила клетками штамма R. rhodochrous J1 (Япония) (Asano, 2002) и штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Россия) (Астаурова, и др., 1993), обладающими высокой нитрилгидратазной активностью. Промышленно значимый штамм R. rhodochrous J1 также применяется в биокаталитическом производстве никотинамида, тогда как в научной литературе не содержится сведений о биокаталитическом синтезе изоникотиновой и пиколиновой кислот с выходом на промышленный уровень.
Использование иммобилизованных нерастущих каталитически активных клеток бактерий обеспечивает возможность перехода к гетерогенному биотехнологическому процессу. Преимущество гетерогенного биокатализа заключается в стабилизации активности ферментов, упрощении технологической схемы синтеза, более легком отделении и очистке образующихся продуктов, а также в возможности многократного или непрерывного использования биокатализатора в колоночном биореакторе, что позволит удешевить производство и снизить количество отходов. В связи с этим остается актуальным как поиск и изучение биологических свойств новых штаммов бактерий, осуществляющих трансформацию цианопиридинов, так и разработка гетерогенного процесса получения коммерчески значимых пиридинзамещенных амидов и карбоновых кислот.
Цель настоящего исследования – изучение процесса трансформации цианопиридинов свободными и адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий и оценка биотехнологического потенциала грамотрицательных цианопиридин-утилизирующих бактерий активного ила биологических очистных сооружений.
Основные задачи исследования:
-
Из активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г. Перми выделить и идентифицировать микроорганизмы, способные метаболизировать цианопиридины.
-
Провести ПЦР-анализ и секвенирование генов ферментов метаболизма нитрилов (амидаз, нитрилаз).
-
Оптимизировать среды и условия культивирования выделенных изолятов, проявляющих наибольшую нитрилгидролизующую активность.
-
Изучить динамику трансформации ароматических нитрилов свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад.
-
Провести скрининг носителей для адсорбционной иммобилизации цианопиридин-трансформирующих бактерий с целью создания эффективного гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов.
Научная новизна. Впервые изучено биоразнообразие нитрилутилизирующих грамотрицательных бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений. На основании параметров, характеризующих процессы роста, оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecalis. Секвенированы гены нитрилаз изолятов грамотрицательных бактерий, способных к утилизации цианопиридинов. Оптимизированы условия реакции трансформации
цианопиридинов штаммами родококков и псевдомонад, обладающими высокой нитрилгидролизующей активностью. Проведена совместная трансформация 4-цианопиридина до изоникотиновой кислоты разными видами родококков, проявляющими нитрилгидратазную и амидазную активности. Выявлены основные особенности носителей для адсорбционной иммобилизации клеток, позволяющие получить гетерогенный биокатализатор для эффективного гидролиза ароматических нитрилов.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о процессах трансформации цианопиридинов у бактерий. Обоснована предпочтительность использования неактивированных носителей для создания гетерогенных биокатализаторов гидролиза ароматических нитрилов. Изучено биоразнообразие грамотрицательных бактерий активного ила и осадков БОС, использующих цианопиридины как единственный источник углерода и азота. Секвенированы гены нитрилаз новых штаммов нитрилутилизирующих бактерий, выделенных из активного ила и осадков БОС. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами, на основании этого сравнения выделены гены нитрилаз двух типов.
Показана возможность получения никотинамида, никотиновой, изоникотиновой и пиколиновой кислот при конверсии соответствующих цианопиридинов целыми клетками родококков и псевдомонад, обладающими нитрилгидролизующей активностью. Получены гетерогенные биокатализаторы гидролиза цианопиридинов на основе клеток R. ruber gt1 и P. fluorescens C2, адгезированных на неактивированных носителях. Оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecalis, выделенного из активного ила БОС, с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза ароматических амидов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Грамотрицательные бактерии активного ила и осадков БОС, выделенные на 3-цианопиридине как единственном источнике углерода и азота, содержат гены нитрилаз двух типов и обладают амидазной активностью по отношению к ароматическим амидам.
-
Оптимальной средой культивирования выделенного из проб активного ила изолята A. faecalis является синтетическая минеральная среда с ацетамидом в концентрации 5,9 г/л как единственным источником углерода и азота. При этом наблюдается максимальный урожай, равный 1,56 мг сухих клеток/мл и экономический коэффициент использования субстрата 26,54%.
-
Наиболее эффективный гидролиз цианопиридинов осуществляется свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад при концентрации субстрата 200 мМ. В качестве носителей для создания гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов предпочтительно использование неактивированных адсорбентов.
Апробация работы и публикации
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж. 2011), I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011), Международной научной Интернет - конференции: "Биотехнология. Взгляд в будущее" (Казань, 2012), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ
студентов и аспирантов в области биологических наук (Ульяновск, 2012), Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012), VIII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва. 2012), V Всероссийском с международным участием медико-биологическом Конгрессе "Симбиоз-Россия 2012" (Тверь, 2012), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых учёных-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), V Конгрессе европейских микробиологов «FEMS 2013» (Лейпциг, 2013).
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 8 тезисов.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 108 наименований, в том числе 39 на русском и 69 на английском языках.
