Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нитроцеллюлоза, ее структура и микробный метаболизм 9
1.1 Структура нитроцеллюлозы 9
1.2 Проблемы утилизации нитроцеллюлозы 11
1.3 Разложение нитроцеллюлозы микроорганизмами 13
Глава 2, Современные представления о сульфатредуцирующих бактериях 17
2.1 Трансформация природных соединений сульфатредуцирующими бактериями 18
2.1.1 Окисление углеводов 18
2.1.2 Разложение углеводородов и их производных 20
2.2 Трансформация неприродных соединений сульфатредуцирующими бактериями 22
2.2.1 Разложение простых полиэфиров 22
2.2.2 Трансформация нитроароматических соединений 23
2.3 Неорганические акцепторы электронов 25
2.4 Некоторые физиологические аспекты функционирования сульфатредуцирующих бактерий в природных экосистемах 29
Глава 3. Материалы и методы
3.1 Объекты исследования и условия культивирования 32
Материалы 32
Объекты исследования 32
Питательные среды 32
Культивирование сульфатредуцирующих бактерий 33
3.2 Определение ферментативных активностей 34
Получение экстрактов клеток 34
Определение содержания белка в клетках 34
Определение локализации ферментов 34
Определение нитроэстеразной активности 35
Определение активности щелочной и кислой фосфатаз 35
Определение нитрат- и нитритредуктазной активности 36
3.3 Аналитические методы 36
Количественное определение нитроцеллюлозы 36
Определение нитратов 37
Определение нитритов 37
Определение аммония 37
Определение азота нитроцеллюлозы 37
Определение сульфатов 38
Определение сероводорода 38
Определение лактата 38
Определение ацетата 39
Анализ газовых смесей 39
3.4 Спектральный анализ нитроцеллюлозы 39
ЯМР-спектроскопия 39
FTIR-спектроскопия 40
3.5 Микрокалориметрические исследования 40
3.6 Определение параметров роста 41
Определение удельной скорости роста 41
Определение экономического коэффициента 41
Математическая обработка экспериментальных данных 41
Результаты исследований 42
Глава 4. Физиологические аспекты трансформации нитроцеллюлозы сульфатредуцирующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388 42
4.1 Использование нитроцеллюлозы в метаболизме D. desulfuricans 1388 43
4.2 Влияние нитроцеллюлозы на теплообмен D. desulfuricans 1388 48
4.3 Влияние нитроцеллюлозы на метаболизм D. desulfuricans 1388 в органотрофных условиях роста 55
Глава 5. Биохимические аспекты трансформации нитроцеллюлозы сульфатредуцнрующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388 60
5.1 Гидролиз нитроэфирных связей нитроцеллюлозы 60
5.2 Восстановление нитратов клетками D. desulfuricans 1388 65
5.3 Гидролиз р-1,4-гликозидных связей 67
Глава 6. Анализ изменений в молекуле нитроцеллюлозы, происходящих под действием Desulfovibrio desulfuricans 1388 69
6.1 ЯМР-спектроскопия 69
6.2 FTIR-спектроскопия 72
Глава 7. Биотехнологические аспекты трансформации нитроцеллюлозы сульфатредуцнрующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388 77
7.1 Влияние дробного добавления субстрата на трансформацию нитроцеллюлозы 77
7.2 Разложение отходов производства нитроцеллюлозы 79
Обсуждение результатов 85
Выводы 95
Литература 96
- Разложение нитроцеллюлозы микроорганизмами
- Трансформация нитроароматических соединений
- Использование нитроцеллюлозы в метаболизме D. desulfuricans 1388
- Гидролиз нитроэфирных связей нитроцеллюлозы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Характерной особенностью современного развития биосферы является высокая интенсивность и широкий спектр антропогенных загрязнений, поступающих в природные экосистемы.
Накопление в окружающей среде неприродных материалов даже с минимальной токсичностью не может быть безопасным для биоты (Alexander, 1994), так как влечет за собой смещение биологического равновесия в сторону доминирующего развития видов-утилизаторов, и, как следствие, прямые или опосредованные изменения трофических связей: микроорганизмы -животные - человек. В результате разложения ксенобиотика могут образовываться природные продукты, не характерные для данной экосистемы и вызывающие вторичное угнетение микрофлоры. Всё это может явиться причиной экологического стресса, последствия которого должны быть просчитаны заранее с использованием как новых, так и традиционных методов и модельных систем.
Искусственные полимеры на основе нитратов целлюлозы находят широкое применение в производстве порохов, фильтрующих материалов, лаков, красок, искусственных кож, целлулоида. Отходы производства нитроцеллюлозы, являясь нетоксичным материалом (Wang et al., 1982,а), в больших объемах приравниваются к веществам с выраженным мутагенным действием ( Ильинская, 1987). Ди- и тринитраты целлюлозы с содержанием азота свыше 10 % являются взрывоопасными. Применяемые в настоящее время методы обработки отходов производства нитроцеллюлозы имеют ряд существенных недостатков. Физико-химические методы: мембранная фильтрация с применением коагулирующих агентов, химический гидролиз, сжигание (Wendt, Kaplan, 1976, Wang et al., 1982,6,) - дороги и экологически небезопасны. Компостирование и захоронение отходов (White et al, 1993), в силу непредсказуемости биохимических процессов, вызываемых случайной микрофлорой, не дают точного прогноза результатов ее ферментативной актив-
ности в отношении как самой нитроцеллюлозы, так и продуктов ее разложения.
Сведения, имеющиеся на сегодняшний день в литературе по вопросу деструкции нитроцеллюлозы микроорганизмами, касаются в основном аэробных процессов трансформации ксенобиотика (Brodman, Devine, .1981; Черкасова, Лихогрудова, 1985; Ильинская, Лещинская, 1988; White et al., 1993) или анаэробной трансформации нитроэфиров целлюлозы накопительными культурами, полученными из производственных очистных сооружений (Freedman et al., 1996; 2002), Практически не изучены физиолого-биохимические основы протекания процесса трансформации синтетического полимера чистыми культурами анаэробных микроорганизмов.
В связи с вышесказанным становится очевидной необходимость изучения взаимного воздействия нитроэфиров целлюлозы и микроорганизмов для научного прогнозирования поведения этого соединения в различных экологических условиях. Поскольку стоки производства НЦ содержат значительные количества сульфатов, сульфатредуцирующие бактерии являются перспективной моделью для изучения анаэробной трансформации НЦ.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение процесса трансформации нитроэфира целлюлозы сульфатредуцирующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Провести скрининг среди сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio на способность к трансформации нитроцеллюлозы.
Исследовать физиолого-.биохимические и термодинамические параметры роста бактерии Desulfovibrio desulfuricans 1388 в присутствии нитроцеллюлозы.
Определить характер изменений в молекуле нитроцеллюлозы под влиянием сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio desulfuricans 1388.
4. Исследовать возможность использования сульфатредуцирующих бактерий при биологической очистке заводских стоков, содержащих нитроцеллюлозу.
Научная новизна. Впервые на чистых культурах сульфатредуцирующих бактерий p. Desulfovibrio показано, что исследованные микроорганизмы способны вести трансформацию нитроцеллюлозы с высокой степенью нитрованности. Обнаружено, что расщепление нитроэфирных связей в молекуле нитроцеллюлозы происходит под действием неспецифической эстеразы. Установлена корреляция между нитроэстеразной активностью и активностью щелочной фосфатазы Desulfovibrio desulfuricans 1388. Образовавшиеся в результате денитрации полимера нитраты восстанавливаются до аммония по диссимиляторному пути.
Установлено, что изменения физиологических и термодинамических параметров роста Desulfovibrio desulfuricans 1388 в присутствии нитроцеллюлозы определяются, прежде всего, свободными нитратами.
Методами ІЗС ЯМР- и FTIR-спектроскопии показано, что в результате контакта нитроцеллюлозы с Desulfovibrio desulfuricans 1388 в молекуле полимера происходит замена нитрогрупп на гидроксилы, приводящая к трансформации нитроцеллюлозы в целлюлозу, доступную для расщепления цел-люлолитическими микроорганизмами. Данные ІЗС ЯМР свидетельствуют, что биологический процесс денитрации полимера бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388 затрагивает нитрогруппы, вне зависимости от их положения в глюкопиранозном остатке.
Установлено, что в результате микробной трансформации нитроцеллюлозы бактерией D. desulfuricans 1388 происходит расщепление углеродной цепи полимера с образованием нитроолигосахаридов.
Впервые обнаружена способность сульфатредуцируюшей бактерии Desulfovibrio desulfuricans 1388 использовать целлобиозу как донор электро-нов.
Полученные результаты расширяют представления о физиологии сульфатредуцирующих бактерий, их способности в условиях дефицита питательных веществ использовать нетрадиционные субстраты для поддержания своей жизнедеятельности.
Практическая значимость. Приведенные данные позволяют рассматривать бактерии p. Desulfovibrio в качестве первичного звена в микробном консорциуме при утилизации неприродного полимера — нитроцеллюлозы: бактерии могут инициировать процесс разложения нитроэфиров целлюлозы в условиях заводских стоков, снижая степень нитрованности полимера и делая его доступным для других членов сообщества.
Биологическая очистка отходов производства нитроцеллюлозы, в основу которой положена трансформация полимера сульфатредуцирующими бактериями рода Desulfovibrio, может явиться альтернативой физико-химической обработке. Это позволит сделать отходы безопасными и не исключать их из общего круговорота веществ в природе.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Разложение нитроцеллюлозы микроорганизмами
Большинство исследователей приходит к выводу об устойчивости НЦ к биодеградации (White et al, 1993) и необходимости предварительного химического гидролиза (Whendt et al, 1976, Riley et al, 1984). Бродман с соавторами в 1981г. (Brodman et а1Д981), изучив способность микроскопического гриба As. fumigatus к биологической денитрации НЦ, показали, что НЦ с содержанием азота 11% не может служить единственным источником углерода и азота для микробного метаболизма. В присутствии доступного углеродного источника - глюкозы, - НЦ используется как источник азота, причём биомасса микромицета в этих условиях на порядок ниже, чем при росте на эквимолярном количестве нитрата. Авторы подчёркивают, что As. fumigatus не способен гидролизовать нитроэфирные связи НЦ и утилизирует азот, освободившийся в результате спонтанного химического гидролиза нит-роэфирных связей полимера, вызванного зачислением ростовой среды. Авторы считают также, что микромицет не оказывает воздействия на углеродный скелет НЦ, а проявление слабой гидролитической активности в отношении гликозидных связей НЦ в присутствии микроорганизмов объясняется образованием органических кислот - естественных метаболитов микроскопических грибов.
Интересны результаты исследовательской работы, проведённой в конце 80-х годов О. Н. Ильинской (Ильинская, 1987), где показана принципиальная возможность ферментативного гидролиза р-1,4-гликозидных связей НЦ ферментами целлюлолитического комплекса Aspergillus fumigatus с образованием следовых количеств редуцирующих Сахаров и некоторого количества водонерастворимых нитроолигосахаридов. В целом же автор подтверждает данные зарубежных исследователей о том, что высокозамещённая НЦ не может служить единственным источником углерода для микроорганизмов.
Трудности в использовании углерода НЦ определяются конформационной жёсткостью этой макромолекулы, которая весьма высока из-за сильных взаимодействий ONO2 -групп при степени замещения близкой к 3. Ферментативный гидролиз НЦ с образованием глюкозы возможен лишь на тех участках макромолекулы, где имеются не замещенные на нитрогруппы гидро-ксилы. При этом следует отметить, что НЦ с содержанием азота менее 4% усваивается так же, как и незамещённая целлюлоза.
Что касается использования микроорганизмами азота НЦ, то даже вы-сокозамещенныи синтетический полимер может служить источником азота при наличии доступного углеродного питания. Однако процесс усвоения азота НЦ протекает медленно и не обеспечивает такого же накопления биомассы, как на среде с нитратами. Показано, что целлюлолитический микро-мицет As. fumigatus использует азот НЦ в отсутствии других источников азотного питания, бактерия Pseudomonas fluorescens - и в присутствии нитрата (Ильинская, Лещинская, 1988).
Скрининг микроорганизмов на наличие нитроэстеразной активности выявил активных продуцентов экзогидролазы, гидролизующей нитроэфир-ные связи ксенобиотика среди различных таксономических групп про- и эу-кориотов: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Bacillus circulans, Rhodo-coccus rubropertinctus, Rhodotorula mucilaginosa, Aspergillus fumigatus. Однако, эффективность процесса гидролиза нитроэфирных связей низка, и аэробная биологическая очистка сточных вод, содержащих частицы НЦ, невозможна без предварительной физико-химической обработки.
В конце 90-х усиливается интерес к анаэробной деструкции нитратов целлюлозы на фоне возросшего внимания к анаэробным биохимическим процессам вообще и практического использования их в промышленности в частности. Работы, посвященные анаэробной биотрансформации НЦ, выполнены с использованием накопительных культур из очистных сооружений производства НЦ. Duran с соавторами (Duran, 1995) изучал способность инокулюма, полученного из сточных вод, содержащих НЦ, к биотрансформации этого соединения. В данной работе основное внимание уделено влиянию НЦ на физико-химические параметры этого процесса. По данным исследователя, НЦ в концентрации 36-54 г/л ингибировала образование газообразных продуктов, однако при снижении концентрации ксенобиотика происходило полное восстановление общего газообразования.
Серия работ Фридмана с соавторами (Freedman et.al., 1996, 2002) касается биотрансформации НЦ в различных модельных анаэробных системах. На основании полученных данных авторы пришли к заключению, что процесс микробной денитрации НЦ не требует предварительной химической обработки даже для предельнозамещенного полимера. Содержание азота в образцах НЦ снижается с 13,1 - 13,2% до 12,2 - 12,4% в денитрифицирующих и сульфидогенных условиях, а в метаногенных условиях с 13,3 до 10,1 %. Для осуществления процесса биотрансформации НЦ необходимо наличие в ростовой среде донора электронов (метанола, лактата), так как НЦ не может служить единственым источником углерода и/или донором электронов, а, по всей вероятности, является случайным акцептором электронов.
Присутствие синтетического полимера (10 г/л) не оказывает ингиби-рующего действия на скорость или степень продукции газообразного азота при денитрификации, однако вызывает уменьшение продукции метана в метаногенных условиях, которое компенсируется образованием газообразного азота и увеличением продукции углекислого газа. Таким образом, НЦ не влияет на общее газообразование. Нитроэфир целлюлозы снижает скорость потребления лактата, а также продукцию сероводорода.
Механизм такого ингибирующего действия НЦ остается неизвестным. Предполагается, что освобождение нитрат-ионов из молекулы полимера и последовательное его восстановление до нитрита, вызывает временное уве личение редокс-потенциалов культуры, чем и определяется угнетение образования восстановленных метаболитов - метана и сероводорода.В заключение подчёркивается, что степень отрыва нитрогрупп в денитрифицирующих и сульфидогенных условиях недостаточна, для того чтобы изменить физико-химические характеристики образцов НЦ, такие как взрывчатость и горючесть.
В литературе мы не встретили сведений о микробной трансформации нитроцеллюлозы чистыми культурами анаэробов.
Трансформация нитроароматических соединений
Простые синтетические эфиры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиглицерин и другие производятся в больших объемах и широко используются в промышленности. С химической точки зрения эфирные связи в алифатических соединениях являются очень прочными, Кроме того, ПЭГ и другие полиэфиры не имеют близких аналогов в природе. Несмотря на это, в биосфере не происходит накопления полиэфиров либо их производных, что предполагает полную минерализацию таких соединений (Kawai, 2002). Свой вклад в анаэробный метаболизм полиэфиров вносят и сульфатредуцирующйе бактерии, например, D.desulfuricans (Dwyer, 1986). Непосредственно перед реакцией гидролиза эфирной связи происходит внутримолекулярное ионное перераспределение: в результате мутазнои реакции при участии ПЭГ-мутазы свободная терминальная гидроксильная группа переносится на второй углеродный атом с образованием нестабильного гемиацеталя (Masuda, 1999). Далее, ацетальдегид-лиаза, которая, как предполагается, является единственным ферментом анаэробного разложения ПЭГ, отщепляет ацетальдегид от молекулы полимера (Schmid et al., 1991, Schink, 1992) (Рис. 1).
Трансформация нитроароматических соединений Принципиально иной класс ксенобиотиков - нитроароматические соединения - проявляет высокую устойчивость к биологической деструкции. Электрон-оттягивающие нитрогруппы этих соединений затрудняют действие окигеназ аэробных микроорганизмов. Более предпочтительным является, по-видимому, анаэробное восстановление подобных соединений, которое приводит к повышению окислительно-восстановительного потенциала полинит-роарилов, тем самым расчищая дорогу для последующего действия окислительных ферментов (Parales et al 2002). Для преодоления естественного барьера на пути аэробной трансформации нитроароматических соединений предложена смена акцептора электронов в дыхательной цепи псевдомонад (Наумова с соавт., 1988). Первые этапы нитроредукции тринитротолуола (ТНТ), ведущие к образованию диаминонитротолуола (2,4ДА) активизируются в условиях нитратного дыхания. Для дальнейших преобразований 2,4ДА, напротив, предпочтительны аэробные условия. Таким образом, принцип анаэробно-аэробного культивирования микроорганизмов может применяться для наиболее полного разложения различных неприродных нитросодержа-щих соединений.
Сульфатредуцируюшие бактерии используют широкий круг нитроароматических соединений, таких как тринитротолуол (ТНТ), 2,4-динитротолуол, 2,4-динитрофенол, тринитробензол (ТНБ), тетрил и циклические неароматические нитросоединения: гексагидро-1,3,5-тринитро-1,3,5-триазин (ГГТНТА), октагидро-1,3,5,7-тетранитро-1,3,5,7-тетроазоцин (ОГТ-НТА), соли тетразолия (Fukui et al, 1989, Hawari et al, 2000, Boopathy et al 1993, 2000) в качестве акцепторов электронов как в отсутствии, так и в присутствии сульфатов, а также в качестве единственного источника азота при наличии в среде доступного источника углерода.
Особенности строения неприродных нитросоединений, для которых характерна связь нитрогрупп непосредственно с атомом углерода, предполагают существование альтернативных способов их бактериальной атаки, один из которых включает восстановление нитрогрупп до аминов, другой - элиминацию нитрогрупп (Наумова с соавт., 1982). Трансформация таких нитро-соединений как ГГТНТА и ОГТНТА бактериями рода Desulfovibrio происходит путём восстановления нитрогрупп до соответствующих аминов с гоь следующим освобождением ионов аммония, в то время как нитраты и/или нитриты в культуральной среде не обнаруживаются (Boopathy, 1998).
Первые этапы разложения ТНТ сульфатредуцирующими прокариотами заключаются в последовательном восстановлении нитрогрупп ксенобиотика через образование изомерных моноаминодинитротолуолов (2А, 4А) и далее 2,4-диамино-6-нитротолуола (Рис.2).
Завершающие этапы метаболизма ТНТ у различных сульфатредуци-рующих бактерий могут протекать по-разному. Для Desulfovibrio sp. (штамм В) показано дальнейшее восстановление оставшейся нитрогруппы в С6-положении с образованием триаминотолуола и последующая элиминация аминогрупп. В этом случае метаболизм ТНТ не сопровождается разрывом арильного кольца и заканчивается образованием толуола (Boopathy, Kulpa, 1993). С другой стороны, бактериальный консорциум сульфатредукторов, состоящий из D. vulgaris, D. gigas и двух штаммов D. desulfuricans, способен к глубокой деградации ТНТ до жирных кислот (Boopathy et aL, 1996) через образование нитробензойной кислоты (Рис.3). При этом все промежуточные вещества, образовавшиеся в результате трансформации ТНТ, кроме ацетата, могут выступать в качестве единственных источников углерода для исследованных бактерий.
Восстановление сульфата у всех сульфатредуцирующих бактерий протекает через образование аденозин-5 -фосфосульфата (АФС). Из АФС образуется сульфит, который либо восстанавливается до сульфида через промежуточные политионаты - тритионат и тиосульфат, либо, согласно другой точке зрения, восстановление происходит в одну стадию, требующую затраты 6 электронов (Кондратьева, 1996). Процесс поглощения сульфатов у одних сульфатредукторов идет с затратами энергии, для других - показано, что ионы сульфата, проходят через бактериальную мембрану посредством электронейтрального анион-протонного симпорта без затраты энергии (Розанова, Назина, 1989).
Рост сульфатредуцирующих бактерий может осуществляться также за счёт восстановления сульфита, тиосульфата, дитионита, тетратионата, моно-и двуокиси серы, элементарной серы. Способность к восстановлению этих серосодержащих соединений является индивидуальным видовым признаком бактерий.
Принципиально иной способ получения энергии за счет дисмутации тиосульфата и сульфита с образованием сульфата и сульфида обнаружен у D. sulfodismutans nDb. curvatis (Bak, 1986).
Наряду с растворимыми сульфатами сульфатредуцирующие бактерии способны восстанавливать нерастворимые соли, такие как CaSC , PDSG4, BaSC 4, а также CaS03. Количество образовавшихся сульфидов соответствующих металлов сопоставимо с количеством Na2S при росте бактерий на классической среде Постгейта Б (Karnachuk et al., 2002).
Использование нитроцеллюлозы в метаболизме D. desulfuricans 1388
Как следует из обзора литературы, в метаногенных, денитрифицирующих и сульфидогенных условиях накопительными культурами бактерий может осуществляться процесс трансформации НЦ (Freedman et al., 1996, 2002). В связи с этим представлялось интересным исследовать способность чистых культур сульфатредуцирующих бактерий к трансформации НЦ и изучить пути вовлечения устойчивого полимера в бактериальный метаболизм.
Нами были протестированы сульфатредуцирующие бактерии p. Desulfo-vibrio из коллекции Казанского института биохимии и биофизики РАН на способность к трансформации НЦ. Показано, что в процессе роста D. desul-furicans 1388, D, desulfuricans 1799, D. gigas 1382, D. vulgaris 1760 количество НЦ снижается на 4,9 - 9,3% (табл. 1). Удельная скорость трансформации ксенобиотика за 15 суток культивирования составляет 4,6 -7,3 мг НЦ/мг белка. Одновременно наблюдается снижение на 2 - 6% количества азота в остаточной НЦ.
Известно, что НЦ может подвергаться медленному спонтанному разложению под действием сульфидов и гидросульфидов (Закощиков, 1950): C6H702(ON02)3 + S2- + ЗН +302 = С6Н702(ОН)3 + 3N03 + S (реакция 1). Чтобы определить долю спонтанного химического гидролиза нитро-эфирных связей НЦ под действием сульфида, который является естественным метаболитом сульфатредуцирующих бактерий, нами были поставлены следующие эксперименты.
В стерильную бидистиллированную воду добавляли сульфид Na в концен-трации 12,5 мМ (по S "), поскольку максимальное количество S ", выделяемо го бактериальными клетками в процессе роста на органическом субстрате, достигает 12,5 мМ. В этот раствор вводили НЦ в количестве 10 г/л, бактерии в реакционную среду не вносили. Экспозиция НЦ в растворе сульфида показала, что за 30 суток количество НЦ снижается примерно на 2,0 %.
Таким образом, снижение количества НЦ в присутствии бактерий более чем на 4% свидетельствует о том, что трансформация полимера носит ферментативный характер. Способность к трансформации НЦ является, по-видимому, широко распространенным свойством бактерий p. Desulfovibrio.
Дальнейшие исследования были проведены на сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio desulfuricans штамм 1388.
Химический состав и строение нитроцеллюлозы таковы, что теоретически не исключено использование этого полимера микроорганизмами в энергетическом обмене в качестве донора и/или акцептора электронов, а также в конструктивном обмене как источник углерода и/или азота.
Чтобы выяснить, как может использоваться НЦ в метаболизме D. desulfuricans 1388, для культивирования бактерии была использована среда Постгейта Б, из которой удаляли те или иные элементы питания с добавлением НЦ в количестве 10 г/л. Длительность опытов составляла 30 суток.
При изучении роли НЦ в энергетическом обмене сульфатредуци-рующей бактерии в качестве донора электронов бактерия культивировалась на среде Постгейта Б без лактата (табл. 2, вариант 1). Источником углерода в этом случае служил входящий в состав среды высокопитательный дрожжевой экстракт в концентрации 1 г/л, который, как показано ранее, обеспечивает потребности D. desulfuricans 1388 в углеродном питании, но не используется как донор электронов (Золотухина с соавт., 1999). Установлено, что прирост биомассы бактерии с НЦ как донором электронов составляет всего 9,3 мг белка/л. Количество НЦ в среде при этом снижается на 2,8% .
В серии опытов по изучению использования НЦ в качестве акцептора электронов (табл. 2, вариант 2), сульфаты вносили в среду в минимальном количестве (0,066 мМ S042" против 14,6 мМ S042" в обычной среде Постгейта Б), необходимом для синтеза клеточного материала. Чтобы исключить процесс брожения, вместо органического субстрата - лактата - в газовую фазу вводили водород в концентрации 10 объемных %. По данным литературы, водород способен запускать процесс сульфатного "дыхания" при наличии акцептора электронов в среде (Thauer et al., 1977). Источником углеродного питания, как и в предыдущем случае, служил дрожжевой экстракт. Исследование роста бактерий в этих условиях показало, что в качестве акцептора электронов полимер может обеспечивать минимальные ростовые потребности D. desulfuricans 1388. Прирост биомассы при этом составил 37 мг белка/л, а убыль НЦ из среды - 4,3% (табл. 2, вариант 2). Для того, чтобы решить вопрос использования НЦ в конструктивном обмене D. desulfuricans 1388 в качестве источника углерода из среды Постгейта Б удалялись лактат и дрожжевой экстракт, донором электронов в этом случае служил водород (табл. 2, вариант 3). Прирост биомассы в условиях опыта достигает 12,2 мг белка/л, снижение количества НЦ в среде -3,9%. Низкий прирост клеточной массы свидетельствует о том, что НЦ не может служить единственным источником углерода для D. desulfuricans 1388. При изучении возможности использования НЦ в качестве единственного источника азотного питания бактерия культивировалась в среде без аммония (табл. 2, вариант 4). Показано, что в этих условиях прирост биомассы составляет 22,1 мг белка/л, убыль НЦ из среды - 4,1%. Полученные данные свидетельствуют о том, что, полимер не является полноценным источником азотного питания для D. desulfuricans 1388. Представленные результаты позволяют заключить, что НЦ не может служить единственным источником углерода, азота или энергии, обеспечивающим ростовые потребности D. desulfuricans 1388. В то же время НЦ, по-видимому, может выступать в качестве акцептора электронов, не являясь при этом полноценной заменой сульфатам. Во всех экспериментах зарегистрировано выделение ацетата и углекислого газа.
Гидролиз нитроэфирных связей нитроцеллюлозы
Такой путь показан для некоторых микроскопических грибов (Ильинская, 1987) и ведет к образованию нитрооли-госахаридов различной длины. Во-вторых, с элиминацией нитрогрупп, или денитрацией, что приводит к снижению степени нитрованности полимера (Duran et al, 1995). Исследование трансформации полимера в присутствии D. desulfuricans 1388 показало, что процесс в основном заключается в отщеплении нитрогрупп от молекулы полимера. Об этом свидетельствует появление свободных нитрат-ионов в среде культивирования бактерий. Данные ЯМР- и PtK-спектроскопии подтверждают, что в образце НЦ, подвергшейся воздействию D. desulfuricans 1388, появляются незамещенные глюкопиранозные фрагменты, а опытный образец характеризуется более низкой степенью нитрованности по сравнению с исходной НЦ. Биологический процесс денитрации ксенобиотика бактерией Desulfovibrio desulfuricans 1388 затрагивает нитрогруп-пы, вне зависимости от их положения в глюкопиранозном кольце. ИК-спектры сухих осадков, оставшихся после экстракции НЦ ацетоном, приближаются к спектру нативной целлюлозы. Таким образом, нерастворимый, устойчивый к деградации полимер — НЦ — в результате контакта с клетками сульфатредуци-рующих бактерий имеет тенденцию к переходу в природное соединение -целлюлозу, доступную для разложения многими микроорганизмами.
Гидролиз любого нерастворимого соединения определяется способностью микроорганизма синтезировать активные внеклеточные ферменты типа гидролаз, в частном случае эстераз, если соединение представляет собой эфир. Проведенные нами эксперименты показали, что как клеточные экстракты D. desulfuricans 1388, так и сама культуральная жидкость после бактериального роста способны гидролизовать нитроэфирные связи НЦ с образованием нитрат-ионов. Установлено, что способность к гидролизу нитроэфирных связей является конститутивным свойством бактерии. При этом внеклеточная нитро-эстеразная активность D. desulfuricans 1388 составляет около 33% от общей нитроэстеразной активности.
Предположение о природе нитроэстеразной активности изучаемого сульфатредуктора опиралось на сведения о том, что у некоторых микроорганизмов гидролиз нитроэфирной связи может осуществляться неспецифическими фосфомоноэстеразами (Ильинская, 1987). Участие фосфатаз в гидролизе нитроэфира представляется наиболее предпочтительным по сравнению с сульфатазами из-за широкого распространения фосфоэфиров в микробных клетках, схожести строения атомов азота и фосфора, а также в силу весьма широкой специфичности ферментов, ведущих гидролиз фосфоэфирных связей (Диксон, Уэбб, 1982). По данным литературы фосфатазы играют важную роль в деградации не только природных, но и синтетических эфиров - фосфорорга-нических пестицидов (Ecobichon, 1979). На основании результатов сравнительного анализа гидролитической активности клеточных экстрактов и куль-туральной жидкости D. desulfuricans 1388 по отношению к синтетическим нитро- и фосфоэфирам, нами показана прямая корреляция между нитроэстеразной активностью и активностью щелочной фосфатазы у изучаемой бактерии. Это позволяет предположить, что начальный этап трансформации НЦ, осуществляемый бактерией D. desulfuricans 1388, включает в себя реакцию гидролиза нитроэфирной связи, катализируемую, вероятно, щелочной фосфа-тазой широкого спектра действия.
Регенерируемая в процессе деэтерификации целлюлоза представляет собой одну из структурных модификаций целлюлозы - гидратцеллюлозу (Зако-щиков, 1950). При одинаковом химическом составе звенья D-глюкопиранозы у целлюлозы повернуты на 90, а у гидратцеллюлозы лежат в одной плоскости. Таким образом, в гидратцеллюлозе происходит ослабление межмолекулярных водородных связей, в результате чего, по-видимому, облегчается гидролитическое расщепление углеродного остова полимера. В ходе спектрального анализа образцов НЦ, находившихся в контакте с D. desulfuricans 1388, установлено появление низкополимерных нитроолигосахаридов, причем их количество со временем контакта возрастает. Образование короткоцепочечных фрагментов полимера в присутствии D. desulfuricans 1388 представляется интересным, так как в литературе мы не встретили сведений о способности сульфатредуци-рующих бактерий к гидролизу р-1,4 -гликозидных связей полисахаридов. С другой стороны, имеются данные о гидролитическом расщеплении гликозид-ных связей НЦ органическими кислотами микробного происхождения. Так, американские исследователи Бродман и Дивайн объясняют гидролиз р-1,4 -гликозидных связей НЦ в присутствии Aspergillus fumigatus образованием органических кислот в процессе роста микромицета (Brodman, Devine, 1981). Нами установлено, что в присутствии ацетата, который выделяется в ростовую среду как естественный метаболит D. desulfuricans 1388, идет спонтанный гидролиз 3-1,4 -гликозидных связей целлюлозы и НЦ с образованием растворимых редуцирующих Сахаров,
Возможно, появлением в среде и дальнейшим использованием редуцирующих Сахаров типа целлобиозы объясняется увеличение биомассы D. desulfuricans 1388 в присутствии НЦ на 8-сутки культивирования. В стационарную фазу роста бактерии, когда сульфатов в среде не остается, наблюдается и наиболее выраженная динамика накопления - потребления нитрат-ионов. Это может быть связано, на наш взгляд, с переключением электрон-транспортной системы D, desulfuricans 1388 на альтернативный акцептор электронов (нитраты) при наличии в среде донора электронов, в качестве которого по исчерпании лактата могут выступить редуцирующие сахара (целлобиоза). В литературе имеются данные о том, что сульфатредуктор Desulfobulbus mediterraneus может использовать целлобиозу в качестве донора электронов (Sass et al., 2002). Способность сульфатредуцирующей бактерии D. desulfuricans 1388 использовать целлобиозу в качестве донора электронов показана впервые. Использование целлобиозы в бактериальном метаболизме предполагает ферментативное расщепление гликозиднои связи дисахарида, поэтому не исключена возможность гидролиза гликозидных связей целлюлозы неспецифическими гидролазами D. desulfuricans 1388. Однако, это предположение требует дальнейших исследований.
