Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Клостридиальные формы бактерий 9
1.1 Общая характеристика клостридий 9
1.2 Физиология и биохимия клостридий 12
ГЛАВА 2 Сульфатредуцирующие бактерии 34
2.1 Общая характеристика сульфатредукторов 34
2.2 Физиология и биохимия сульфатредукторов 36
ГЛАВА 3 Углеводороды микроорганизмов 59
заключение 63
экспериментальная часть 67
ГЛАВА 4 Объекты и методы исследований 67
4.1 Объекты исследований 67
4.2 Питательные среды 67
4.3 Культивирование бактерий 71
4.4 Газовые смеси 71
4.5 Определение количества клеток сульфатредукторов и клостридий 72
4.6 Определение содержания белка в культуральной жидкости 72
4.7 Определение удельной скорости роста бактерий (и) 73
4.8 Определение длительности лаг-фазы 73
4.9 Получение экстрактов клеток бактерий 74
4.10 Определение рН и Eh в культуральной жидкости 74
4.11 Анализ газообразных соединений 74
4.12 Определение углеводородов газохроматографическим методом 76
4.13 Определение кислородсодержащих продуктов (кислот и спиртов) методом газо-жидкостной хроматографии 77
4.14 Тонкослойная хроматография 78
4.15 Определение активности СО-дегидрогеназы 78
4.16 Аналитические методы 79
4.17 Математическая обработка результатов исследований 80
ГЛАВА 5 Результаты исследований 81
5.1. Способность к синтезу внеклеточных углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium 81
5.1.1. Синтез углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium на стандартных питательных средах 81
5.1.2. Синтез углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium на модифицированных питательных средах 88
5.2. Сравнительная характеристика спектров внутри- и внеклеточных углеводородов у бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium 96
5.3. Изменения газовой фазы в процессе роста бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium 101
5.4. Влияние физико-химических факторов на рост и образование углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium 104
5.4.1. Влияние рН среды на рост штаммов и образование углеводородов 104
5.4.2 Влияние окислительно-восстановительного потенциала среды на рост штаммов и образование углеводородов 114
5.5 Определение редуктазной активности у бактерий рода Desulfovibrio и рода Clostridium 119
5.6. Синтез углеводородов различными таксономическими группами анаэробных бактерий 125
5.6.1. Выделение бактерий рода Clostridium из природных объектов и идентификация их видового состава 125
5.6.2. Способность к синтезу внеклеточных углеводородов представителей других таксономических групп анаэробных бактерий 128
Обсуждение результатов 13 5
Выводы 144
Литература 145
- Общая характеристика клостридий
- Физиология и биохимия сульфатредукторов
- Определение количества клеток сульфатредукторов и клостридий
- Способность к синтезу внеклеточных углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение способности анаэробных бактерий синтезировать углеводороды актуально, прежде всего, из-за энергичного потребления горючих ископаемых, с одной стороны, и возможного участия бактерий в процессах восстановления запасов углеводородов, с другой. Кроме того, повышение требований к охране окружающей среды ставит перед исследователями задачи по разработке эффективных и экологически безопасных способов получения энергоносителей.
Среди продуцентов жидких углеводородов наиболее перспективной считается зеленая водоросль Botryococcus braunii (Kitasato et.al., 1989; Metzger et.al., 1991; Жила и др., 2001; Byung-Woo, Sang-Jim, Jin-Young, 2001). Однако, большой интерес вызывают и анаэробные бактерии, способные осуществлять важнейшие процессы трансформации веществ в анаэробных зонах биосферы (Розанова, Кузнецов, 1974; Gibson, 1990; Иванов и др., 1991; Заварзин, Колотилова, 2001). Из многообразия анаэробов наиболее вероятными продуцентами жидких углеводородов являются клостридии и сульфатредукторы, которые широко распространены в природе, обладают определенной устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, осуществляют различные процессы брожения, окисления органических веществ, гидролиза растительных остатков и другие реакции. Кроме того, бактерии указанных физиологических групп способны к биологической конверсии С-1 соединений, в частности, СОг.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось сравнительное определение способности бактерий рода Clostridium и рода Desulfovibrio к синтезу внеклеточных углеводородов, а также анализ
зависимости продукции углеводородов от условий культивирования штаммов.
В соответствии с основной целью работы были определены следующие задачи:
-изучить возможность бактерий рода Clostridium и рода Desulfovibrio синтезировать внеклеточные углеводороды и определить физиологическое состояние микробной популяции в период образования углеводородов,
-определить период образования углеводородов бактериями,
-установить зависимость образования углеводородов от условий культивирования штаммов,
-определить состав внеклеточных и внутриклеточных углеводородов, образуемых бактериями,
-выявить наиболее активных продуцентов внеклеточных углеводородов среди различных видов клостридий в сравнении с сульфатредукторами.
Научная новизна. Впервые показана способность бактерий рода Clostridium - коллекционных и природных штаммов - к синтезу внеклеточных углеводородов. Выявлен наиболее активный продуцент внеклеточных углеводородов штамм Clostridium pasteurianum ВКМ-1774.
Установлена зависимость синтеза углеводородов бактериями рода Clostridium и рода Desulfovibrio от стрессовых изменений в составе питательной среды. Показано, что максимальная продукция углеводородов характерна для физиологически активной культуры синтез осуществляется в экспоненциальной и в начале стационарной фазы роста популяции, существенно опережая во времени период лизиса клеток.
Определены различия в характеристике спектров внутриклеточных и внеклеточных углеводородов клостридий, а также в сравнении с углеводородами, образуемыми сульфатредукторами.
Показано усиление синтеза внеклеточных углеводородов при введении Н2 и СО2 в газовую фазу среды культивирования. Установлена зависимость синтеза внеклеточных углеводородов от рН и Eh питательной среды.
Практическая значимость. Результаты проведенных
исследований раскрывают новые аспекты жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов. Они способствуют расширению сведений о физиологии и биохимии клостридий и сульфатредукторов и позволяют по-новому рассмотреть процесс участия бактерий в образовании углеводородов в природе.
Полученные результаты являются теоретической основой для оценки и выбора наиболее перспективных штаммов, активно синтезирующих углеводороды, с целью создания биотехнологического процесса синтеза жидких углеводородов с помощью анаэробных бактерий.
Основные защищаемые положения диссертации
Бактерий рода Clostridium и рода Desulfovibrio способны к синтезу внеклеточных углеводородов; они продуцируют жирные кислоты и альдегиды, которые способны вступать в реакции конденсации с образованием углеводородов, обладают высокой редуктазной активностью, способствующей осуществлению реакций восстановления веществ.
Внеклеточные углеводороды клостридий и сульфатредукторов синтезируются штаммами в процессе роста популяции и не являются продуктами разрушения клеток.
Синтез углеводородов зависит от условий культивирования бактерий. Наиболее интенсивный процесс образования алканов наблюдается при изменении оптимальных условий роста бактерий в сторону стрессового воздействия. Для сульфатредукторов - это снижение в питательной среде сульфатов, для клостридий - удаление мела. Тем не менее, синтез углеводородов возможен только при нормальном росте клеток. Наибольшее количество внеклеточных углеводородов образуется, когда в питательной среде присутствуют органические соединения, обеспечивающие питательные потребности и рост бактерий, т.е. в гетеротрофных условиях. Кроме того, введение в среду культивирования штаммов газовой смеси Н2+СО2, ускоряет и активирует процесс образования алканов.
Синтезируемые бактериями внутриклеточные и внеклеточные углеводороды отличаются по своему составу. Внеклеточные углеводороды представлены, главным образом, алканами нормального и изостроения с длиной углеродной цепи Сц-С24, внутриклеточные углеводороды состоят из высокомолекуляных алканов С25-С35
Синтез углеводородов и их количество зависит от физико-химических факторов среды, наиболее значимым из которых является окислительно-восстановительный потенциал. Повышение Eh способствует смещению реакций в сторону окислительных процессов, что снижает, а затем и прекращает образование углеводородов бактериями.
Общая характеристика клостридий
Род клостридий является одним из самых крупных в мире прокариот. Отнесенные к этому роду, соответствуют трем основным критериям: 1) обладают способностью к формированию эндоспор; 2) обладают облигатным типом анаэробного метаболизма; 3) неспособны к осуществлению сульфатредукции.
Первый критерий отделяет клостридий от всех других организмов не образующих эндоспоры. Существуют некоторые сложности в оперировании этими критериями, так как отдельные виды клостридий не спорулируют в условиях искусственно созданных для их культивирования. Кроме того, могут появляться аспорогенные мутанты. С другой стороны, формируют эндоспоры и облигатно-анаэробные сахаролитические сарцины. Они легко дифференцируются от клостридий уникальной способностью формировать свои округлые клетки в «пакеты».
Следующий критерий отделяет клостридий от бацилл, которые являются аэробами и содержат электрон-транспортную цепь с кислородом в качестве конечного акцептора электронов. Установлено, что некоторые бациллы являются факультативными анаэробами, например, Bacillius polymyxa. Несмотря на то, что клостридий облигатные анаэробы, многие виды обладают способностью расти в присутствии незначительных количеств кислорода в среде (Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002). Спектр чувствительности к молекулярному кислороду у клостридий достаточно широк, что связано с обнаружением в клетках большинства видов ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы, помогающих нейтрализовать токсические эффекты молекулярного кислорода и его производных (Mortimer et.al., 1981; Horn, 1987; Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002).
Третий критерий был введен в результате выявленной способности рода Desulfotomaculum сульфатредуцирующих бактерий к спорообразованию, что позволило отделить клостридий от сульфатредукторов.
Вегетативные клетки бактерий рода Clostridium имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек размером 0.3-1.6 на 1-14мкм, с закругленными концами. Исключение составляет C.coccoides. В отличие от внешнего вида бацилл, клостридиальные клетки содержат споры диаметр которых, как правило, превышает диаметр вегетативной клетки. Некоторые образуют терминальную спору, другие образуют споры субтерминально или по центру. У отдельных видов обнаружены клетки с двумя и более спорами (Gylswyk, Toorn, 1987). Расположение спор является одним из главных признаков видовой специфичности данных бактерий.
Подавляющее большинство клостридий грамм положительны. Клеточные стенки содержат пептидогликан с мезо-диаминопимелиновой кислотой, а также тейхоевые кислоты. Однако и в данном случае встречаются исключения.
Бактерии рода Clostridium обладают подвижностью благодаря перитрихиальному жгутикованию. По мере старения клетки теряют свою подвижность, накапливают гранулезу и переходят к спорообразованию.
Как отмечалось выше, род Clostridium гетерогенный. Он включает в себя виды относительно аэротолерантные C.carnis, С.durum, C.histoliticum, C.tertiiim и экстремально чувствительны к кислороду такие, как - C.aminovalericum. Некоторые виды клостридий содержат цитохромы, функции которых окончательно не выяснены. Содержание G+C пар оснований колеблется от 21 до 57%. Представители рода Clostridium широко распространены в почве, воде, а также, в пищеварительном тракте животных и человека. Среди них обнаруживаются как психрофильные виды - C.vincentii (Mountfort et.al., 1997), C.fimetarhim (Коцюрбенко с соавт., 1995), так и термофильные - C.thermoaceticum, C.sterararium (Bronnenmeier, 1995), C.paradoxum (Cook et.al., 1996).
Подобно другим представителям семейства Bacillacieae, клостридии предпочитают расти при нейтральной (или щелочной) реакции питательной среды. Влияние внутри- и внеклеточного рН на развитие клостридии рассмотрено на алкалофильной культуре C.paradoxum (Cook et.al., 1996). Было установлено что, повышение внутриклеточного рН от 7,6 до 9,8 увеличивало рН-градиент проницаемости клеточной мембраны на 1,3 единицы. При более высоких значениях рН (больше 10,0) наблюдалось снижение рН-градиента, а внутриклеточное значение рН увеличивалось в значительной степени. При значении рН среды больше 10,2 и внутриклеточном - более 9,9, рост клеток прекращался. В диапазоне внеклеточных рН от 8,0 до 10,3 концентрация АТФ внутри клеток составила 1 мМ, величина, которая понижалась при более высоких и более низких значениях рН.
Физиология и биохимия сульфатредукторов
Сульфатредуцирующие бактерии составляют физиолого биохимическую группу микроорганизмов совершенно разных по морфологии, но объединенных способностью использовать в энергетических реакциях метаболизма сульфат и восстанавливать его до сульфида, т.е., осуществлять диссимиляторную сульфатредукцию.
В настоящее время известно более пятидесяти видов сульфатредуцирующих прокариотических микроорганизмов, которые распределены по 23 родам (Кондратьева, 1996). Среди них есть сферические, овальные и палочковидные формы, а также извитые в виде вибрионов и спирилл. Размеры клеток составляют от 0.3 до 2.4 мкм ширина и от 0.8 до 10.0 мкм длина. Среди сульфаредуцирующих бактерий встречаются и кокковые формы, например, Desulfosarcina. Кроме того, отмечено, что не всегда представители одного рода сульфатредуцирующих бактерий включают микроорганизмы с одинаковой морфологией. Имеется и трихомный тип организации клеток, например бактерии рода Desulfonema.
В отличие от клостридий, большинство сульфатредуцирующих бактерий имеют клеточную стенку грамотрицательного типа. Грамположительны клеточные стенки характерные для бактерий рода Desidfotomacidum. Этот род характеризуется также способностью образовывать эндоспоры. Кроме того, установлено, что у некоторых штаммов сульфатредуцирующих бактерий, отнесенных к археям, например, VC-16, муреин клеточной стенки, отсутствовал (Gibson, 1990).
Многие одноклеточные сульфатредукторы передвигаются с помощью одного или нескольких полярно расположенных жгутиков. Встречаются клетки и с перетрихиальным жгутикованием. Кроме того, для бактерий рода Desulfonema отмечена скользящая форма движения.
Сульфатредукторы, также как и клостридии, весьма гетерогенны. На гетерогенность группы указывает широкий диапазон значений G+C пар оснований от 34-67% (Hardy, 1981).
У ряда штаммов сульфатредуцирующих бактерий {Desalfovibrio gigas, Desidfovibho vulgaris, Desulfovibrio desulfuricans) обнаружены плазмиды, фаги {Desulfovibrio vulgaris), газовые вакуоли {Desulfonema). Отмечено накопление поли-3-гидрооксибутирата (Desulfobotulus) и полиглюкозы {Desulfovibrio gigas, Desulfovibrio propionicus, Desulfovibrio desulfuricans) (Кондратьева, 1996).
Несмотря на то, что сульфатредукторы относят к облигатным анаэробам, для различных видов была показана их устойчивость к кислороду, которая как и у клостридии, зависит от активности в клетках -супероксиддисмутазы (Брюханов, Тауер, Нетрусов, 2002).
Большинство сульфатредуцирующих бактерий являются мезофилами. Однако, выделены и термофильные виды. Так, например, была выделена новая термофильная сульфатредуцирующая бактерия, из пластовой воды высокотемпературного нефтяного месторождения. Микроорганизм был представлен неподвижными, неспоробразующими грамотрицательными клетками овальной формы. Рост наблюдался при температуре от 45 до 65С, с оптимумом при 60С и при содержании в средах NaCl от 0 до 50г/л. В процессе сульфатредукции бактерии разлагали: лактат, пируват, малат, фумарат, этанол и соли жирных кислот: формиат, ацетат, пропионат, бутират, капронат, пальмилат. Кроме того, при восстановлении SO4 окисляли: дрожжевой экстракт, аланин, серии, цистеин и осуществляли автотрофный рост за счет Н2/С02. Помимо сульфатов, акцепторами электронов служили: сульфит, тиосульфат, элементарная сера. Содержание G+C- пар оснований ДНК составляло 60.8 мол.%. Уровень ДНК-ДНК-гибридизации выделенной бактерии не превышал 34%. По данным анализа последовательности генов 16S рРНК штамм относился к филогенетическому кластеру видов рода Desulfacinum (Розанова, Турова, Колганова и др., 2001).
Большинство сульфатредукторов растут при оптимуме рН 6.8-7.4. Однако, с возникновением интереса к биоразнообразию сульфатредуцирующих бактерий, увеличилось и число видов, выделенных из необычных мест обитания, в их числе гало- и алкалофильные виды (Пикута, Жилина, Заварзин, 1998; Заварзин, Колотилова, 2001).
Рост сульфатредукторов характеризуется низкими значениями редокс-потенциала питательной среды, но более высокими показателями, чем у клостридий. В среднем Eh среды должен составлять от (0 mV) до(-200mV). Однако, процесс сульфатредукции и накопления пиритов в иловых отложениях Индийского океана обнаруживался и при (+500mV) (Ванштейн и др., 1985).
Сульфатредуцирующие бактерии легко конкурируют за субстрат с другими микроорганизмами, в частности, с метанобразующими бактериями, если в окружающей среде присутствуют сульфаты. Тем не менее, сульфатредукторы способны развиваться в ассоциациях с другими микроорганизмами (Cord-Ruwisch, Alliver, Garcia, 1986).
Определение количества клеток сульфатредукторов и клостридий
Количество клеток сульфатредуцирующих бактерий определяли методом предельных разведений, фиксируя почернение в жидких средах, происходящее благодаря образованию сульфида железа (Postgate, 1984).
В пробирки, содержащие по 18 мл жидкой среды Постгейта В, вносили по 2 мл из соответствующего разведения исследуемой суспензии бактерий, после чего пробирки закрывали стерильными пробками и инкубировали при 30С. Почернение среды свидетельствовало о наличии роста в том или ином разведении.
Количество клеток сульфатредуцирующих бактерий, содержащееся в 1 мл суспензии, рассчитывали используя таблицу Мак-Креди (Егоров, 1983).
Количество клеток клостридиальных форм бактерий определяли по калибровочной кривой зависимости оптической плотности культуральной жидкости от количества клеток содержащихся в ней. Оптическую плотность культуральной жидкости регистрировали используя фотоэлектроколориметр (ФЭК-56).
Содержание белка у сульфатредуцирующих бактерий определяли по модифицированному методу Лоури (Горина, Яковлева, 1980). К пробе объемом 1мл добавляли 0,1 мл 0,15% раствора дезоксихолата натрия, оставляли на 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 0,1 мл 72%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживали до растворения черного осадка и центрифугировали при 7.000 g 15 минут.
Осадок растворяли в 1 мл дистиллированной воды, затем к нему добавляли 1 мл реактива "А", приготовленного из 1 части раствора 0,2% тартрата калия и 0,1% CuS04x5H20 в 10% растворе карбоната натрия, 1 части 0,8N NaOH и 2 частей дистиллированной воды с добавлением додецилсульфата Na (2,5%). Через 10 минут инкубации в смесь вносили 0,5 мл реактива Фолина. Оптическую плотность белка определяли на спектрофотометре "СФ-26" при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 1см. Количество белка в пробе устанавливали по калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой в логарифмических координатах использовали трехкратное определение содержания белка в растворах бычьего сывороточного альбумина различной концентрации. Для получения экстрактов клеток с целью изучения внутриклеточных углеводородов и определения активности СО-дегидрогеназы, клетки сульфатредукторов, либо клостридий собирали центрифугированием при 7.000 g в течение 20 минут при температуре 4С, затем дважды промывали 0,02 М фосфатным буфером (рН 6,8 - 7,0).
Полученные клетки ресуспендировали в том же фосфатном буфере из расчета 2,0 -2,5 мг сырой биомассы на 10 мл буфера и разрушали с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-2Т при частоте 22 КГц в течение 6 минут (три раза по 2 минуты), затем центрифугировали при 18.000 g- 1 час.
В опытах использовали супернатантную фракцию. Газообразные соединения анализировали на хроматографах "Chrom-4" и Тазохром-3101" по методикам, принятым для анализа соответствующих газов (Вяхирев, Шушунов, 1987).
Для определения ССЬ использовали колонку, заполненную Полисорбом-1, длина колонки 3,5 м , внутренний диаметр 3,0 мм. Детектор - катарометр. Температура колонок - комнатная, катарометра -40оС, скорость газа-носителя (гелий) - 30 мл/мин .
Молекулярный водород определяли на колонке, заполненной активированным углем АГ-3. Длина колонки - 2,5 м , внутренний диаметр - 3,5 мм. Температура колонки и детектора - комнатная. Скорость газов-носителей (аргон и воздух) - 15 мл/мин и 30 мл/мин, соответственно.
Количество сероводорода определяли методом обратного йодометрического титрования (Лурье, Рыбникове 966). Сероводород предварительно осаждали в виде CdS, для чего в пробу добавляли уксуснокислый кадмий. Затем осадок сульфида растворяли в НС1, а выделившийся сероводород окисляли 0,0IN раствором йода. Избыток йода оттитровывали 0,01 N раствором тиосульфата натрия. Йод, израсходованный на окисление сероводорода, определяли по разности между добавленным количеством йода и избытком его. Содержание сероводорода в пробе рассчитывали по формуле и выражали в мг/л :
Способность к синтезу внеклеточных углеводородов бактериями рода Desulfovibrio и рода Clostridium
В работе использовали бактерии наиболее широко распространенные в природе - штамм сульфатредукторов Desulfovibrio desiilfuricans ВКМ 1799 и штамм клостридий Clostridium pasteurianum ВКМ1774.
Изучение синтеза углеводородов у исследуемых бактерий проводили в условиях гетеротрофного роста штаммов с введением в среду культивирования нейтрального газа - аргона или газовой смеси -Н2+С02.
Рост сульфатредуцирующих бактерий оценивали по увеличению количества белка и сероводорода. Рост клостридиальных форм бактерий регистрировали по показаниям плотности культуральнои жидкости на ФЭК и по определению содержания белка, с целью сравнения результатов с ростом сульфатредуцирующих бактерий. Контролем служили пробы, взятые в начальной точке культивирования штаммов. Результаты анализа этих проб отражены при построении графиков в нулевых точках.
Накопление кислородсодержащих продуктов метаболизма (кислот, спиртов) и углеводородов регистрировали газохроматографическим методом. Содержание альдегидов определяли аналитическим методом.
Первоначально синтез углеводородов сульфатредукторов и клостридий исследовался на стандартных питательных средах. Среда Постгейта В для сульфатредуцирующих бактерий содержала лактат кальция, как основной окисляемый субстрат, дрожжевой экстракт и сульфаты (3,5 г/л) в качестве конечных акцепторов электронов. Среда Виноградского для Clostridium pasteurianum, содержала в качестве органического субстрата - глюкозу. Для нейтрализации синтезируемых растущими клетками кислот в нее был внесен карбонат кальция (4 г/л).
Исследования показали, что при культивировании штамма Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 на среде Постгейта В в атмосфере аргона наблюдался активный рост клеток. Удельная скорость роста популяции клеток составляла \i 0,14 ч-1 . Количество биомассы на 48 час развития штамма достигало показателей 245,0±2,5 мг/л (lg 2,39). Содержание сероводорода было 400,0±3,0 мг/л.
Параллельно увеличению биомассы штамма в культуральной жидкости наблюдалось накопление кислородсодержащих продуктов. Количество углеводородов было незначительно и оставалось без изменений в процессе роста клеток (рис. 1а).
При выращивании бактерий на среде Постгейта В в атмосфере газовой смеси Н2+СО2 рост штамма был близок к показателям роста бактерий в атмосфере аргона (рис. 16). Максимальное количество белка на 48 час составило 250,5±2,0 мг/л (lg 2,40). Количество сероводорода было выше и достигало показаний 452,0±3,2 мг/л.
Одновременно с приростом биомассы в культуральной жидкости наблюдалось увеличение количества кислородсодержащих продуктов и незначительное повышение синтеза углеводородов (рис.16).
Расчет продуктивности углеводородов сульфатредуцирующими бактериями относительно накопления биомассы на среде Постгейта В, показал их незначительное количество (табл. 1).
При росте Clostridium pasteurianum ВКМ 1774 на стандартной среде Виноградского в атмосфере аргона или в атмосфере Н2+СО2, так же как и в случае культивирования Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799, в культуральной жидкости наблюдалось накопление различных продуктов метаболизма клеток (рис.2).
В атмосфере аргона культура Clostridium pasteurianum ВКМ 1774 развивалась достаточно активно, прирост биомассы на 60 час развития популяции составил 250,0±2,0 мг/л (lg 2,40). Как и в случае с сульфатредуцирующими бактериями, параллельно с приростом биомассы в культуральнои жидкости, происходило накопление внеклеточных продуктов метаболизма (рис. 2а), но в отличие от сульфатредуцирующих бактерий количество кислородсодержащих продуктов было в 1,4-1,7 раз меньше. Это объясняется, по-видимому, тем, что образуемые клостридиями кислоты активно нейтрализуются добавленным в среду мелом. Количество углеводородов было на уровне контроля (рис.2 а).
При культивировании клостридий на стандартной среде Виноградского в атмосфере газовой смеси водорода и углекислоты наблюдалось некоторое удлинение lag-фазы (6 часов), прирост биомассы на 66 час культивирования штамма составил 260,0±2,2 мг/л (lg 2,41). Накопление кислородсодержащих продуктов в присутствии газовой смеси, так же как и у сульфатредукторов, повысилось. Количество углеводородов не изменялось и оставалось близким к исходному показателю (рис.26).
Продуктивность углеводородов клетками клостридий была меньше, чем у сульфатредуцирующих бактерий (табл.2).
Таким образом, как для бактерий рода Desulfovibrio, так и для бактерий рода Clostridium не зависимо от газовой фазы культивирования штаммов, основными продуктами метаболизма клеток, являются кислородсодержащие соединения. Введение газовой смеси Н2+СО2 в среду культивирования бактерий приводит к незначительному повышению прироста биомассы штаммов. Однако общее количество экзометаболитов увеличивается. Образование углеводородов на стандартной среде культивирования находится на уровне контроля.
