Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1.1. Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов 9
1.2. Микроорганизмы, осуществляющие биодеградацию и биотрансформацию полиароматических углеводородов 11
1.3. Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями.. 15
1.4. Условия, влияющие на биоконверсию ПАУ микроорганизмами 25
Заключение : 28
Материалы и методы
2.1. Микроорганизмы и методы их выделения 28
2.2. Культивирование штаммов, осуществляющих деградацию и трансформацию полиароматических углеводородов 30
2.3. Методы, использованные при изучении биоконверсии ПАУ 32
2.4. Методы кинетического анализа 36
Результатыи обсуждение
3.1. Штаммы-деструкторы ПАУ, отобранные из лабораторной коллекции и выделенные из природных образцов 38
3.2. Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus 39
3.3. Кометаболизм флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 41
3.4. Трансформация флуоренола и флуоренона штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 45
3.5. Превращение бактериями фенантрена и антрацена 52
3.3. Деградация фенантрена штаммом Arthrobacter sp. КЗ 54
3.4. Потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp. КЗ. 56
3.5. Деградация ПАУ накопительными культурами, поддерживаемыми в среде с экстрактом каменноугольного пека 62
3.6. Конверсия полиароматических соединений штаммом Sphingomonas sp. Маг-33 65
3.7. Конверсия ПАУ штаммом Mycobacterium sp. Mar-59 74
Заключение 80
Выводы 82
Список литературы 84
- Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов
- Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями..
- Культивирование штаммов, осуществляющих деградацию и трансформацию полиароматических углеводородов
- Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) образуются в неспецифических процессах деструкции различных органических веществ при высоких температурах, например, при лесных пожарах, коксовании угля. С развитием промышленности, когда к природным источникам ПАУ прибавились антропогенные (сжигание топлива, проливы нефти и каменноугольных продуктов), возникла проблема загрязнения окружающей среды этими токсичными веществами. Присутствием ПАУ в биосфере на протяжении всей истории органической эволюции нашей планеты обусловлено существование живых организмов, способных к использованию ПАУ в качестве источника энергии для жизнедеятельности. Это бактерии различной систематической принадлежности. В настоящее время ПАУ-деградирующие бактерии интенсивно изучаются в связи с разработкой технологий детоксикации промышленных отходов и биоремедиации загрязненных почв, донных осадков и грунтовых вод. Особое внимание уделяется выделению и исследованию штаммов, способных к деградации так называемых высокомолекулярных ПАУ, молекулы которых содержат больше трех ароматических колец. Высокомолекулярные ПАУ более устойчивы к биодеградации, чем ПАУ с меньшей молекулярной массой, и число известных бактерий, способных их окислять, существенно меньше. Многие высокомолекулярные ПАУ оказывают мутагенное и канцерогенное воздействие на человека и животных, в связи с чем их концентрация в окружающей среде является объектом постоянного мониторинга. Биоремедиация считается наиболее перспективным методом очистки почвы и других сред от ПАУ.
С другой стороны, многие живые организмы, осуществляют относительно "неглубокие" превращения молекул ПАУ (трансформация), часто без непосредственного использования ПАУ в качестве источника энергии для роста. Трансформация ПАУ имеет большое значение для функционирования микробных сообществ. Поскольку превращение ПАУ бактериями в большинстве случаев отличается от реакций химического окисления ПАУ, бактериальное окисление ПАУ может использоваться для получения соединений, трудно доступных химическим путем.
Таким образом, изучение бактерий-деструкторов ПАУ актуально, во-первых, с точки зрения разработки методов биоремедиации и, во-вторых, для получения веществ, труднодоступных химическим путем. Состояние проблемы. Известно, что главную роль в деградации ПАУ в загрязненных почвах играют аэробные бактерии. Среди них имеются представители десятков родов (Juhasz et Naidu, 2000). Количество выделенных штаммов и систематическое разнообразие бактерий, способных к деградации высокомолекулярных ПАУ, значительно меньше (Kanaly et Harayama, 2000). Для ряда высокомолекулярных ПАУ не известно ни одного штамма, способного к их использованию в качестве единственного источника углерода и энергии, но есть штаммы, осуществляющие деградацию данных ПАУ в соокислительных условиях. Задача выделения и исследования новых штаммов-деструкторов высокомолекулярных ПАУ является по-прежнему актуальной (Но et al, 2000; Bastiaens et al, 2000; Willison, 2004; Lopez et al, 2005). Наибольший прогресс достигнут в описании метаболических путей деградации ПАУ. Описанные ранее пути метаболизма фенантрена (Evans et al, 1965; Kiyohara et al., 1976), антрацена (Evans et al., 1965), аценафтена и аценафтилена (Schocken et Gibson, 1984), флуорена (Grifoll et al, 1994; Trenz et al, 1994; Casellas et al, 1997), флуорантена (Weissenfels et al, 1991; Kelley et al, 1993) и пирена (Heitkamp et al, 1988) впоследствии находили подтверждение при изучении других штаммов и уточнялись. Ряд модификаций ранее известных метаболических путей и альтернативные метаболические пути обнаружены относительно недавно (Rehmann et al, 2001; Story et al, 2001; Vila et al, 2001; van Herwijnen et al, 2003; Lopez et al, 2006; Keum et al, 2006; Poonthrigpun et al, 2006 и др.), это свидетельствует о том, что исследование бактериального метаболизма ПАУ еще не завершено. Другим стимулом для описания новых метаболических путей является выделение новых штаммов, способных к деградации устойчивых высокомолекулярных ПАУ, метаболизм которых прежде не изучали (Willison, 2004). Гораздо меньше известно о влиянии различных условий на конверсию ПАУ микроорганизмами. Есть данные о влиянии на скорость бактериальной деградации ПАУ следующих факторов: одновременного потребления культурой другого органического субстрата (Kanaly et al, 2002), ингибирования продуктами конверсии ПАУ (Casellas et al, 1998; Kazunga et Aitken, 2000), перекрестной индукции (Molina et al, 1999), конкурентного ингибирования другими ПАУ (Stringfellow et Aitken, 1995), ограниченной доступности ПАУ для микроорганизмов (Johnsen et al, 2005). Важным условием, влияющим на конверсию ПАУ конкретным микроорганизмом, является присутствие в экосистеме других микроорганизмов, которые могут изменять концентрации субстратов, продуктов и других веществ в среде. Исследований по конверсии ПАУ смешанными культурами известного состава выполнено мало (Casellas et al, 1998; Bouchez et al, 1999; Boonchan et al, 2000). В большинстве работ по изучению конверсии ПАУ бактериями объектом является чистая культура, растущая на среде с одним ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии, т.е. в условиях, резко отличающихся от условий в естественной среде (например, в почве), где наблюдается ограниченная биодоступность субстрата, наличие многих ПАУ и разнообразных микроорганизмов, нестабильность физических и химических параметров (Johnsen et al, 2005). С другой стороны, процессы в почве слишком сложны для анализа, поэтому решением проблемы могла бы стать разработка методов культивирования, лучше моделирующих естественные условия. В некоторых работах предприняты попытки кинетического анализа конверсии ПАУ бактериями (Stringfellow et Aitken, 1995; Wick et al, 2001; Lotfabad et Gray, 2002). Учитывая, что кинетические исследования необходимы для понимания механизма изучаемых процессов, такого рода работ выполнено недостаточно. Много публикаций по деградации ПАУ бактериями появилось уже во время выполнения данной работы. Были более детально описаны пути метаболизма ПАУ относительно малой молекулярной массы (Moody et al, 2001; van Herwijnen et al, 2003; Keum et al, 2006; Poonthrigpun et al, 2006), флуорантена (Rehmann et al, 2001; Story et al, 2001; Lopez et al, 2006), пирена (Vila et al, 2001) и ПАУ большей молекулярной массы (Moody et al, 2004; Moody et al, 2005). Выделен целый ряд штаммов, осуществляющих деградацию высокомолекулярных ПАУ (Rehmann et al, 2001; Vila et al, 2001; Dean-Ross et al, 2002; Bogan et al, 2003; Dandie et al, 2004; Habe et al, 2004; Sho et al, 2004; Willison, 2004; Zhang et al, 2004). Изучалась биодоступность ПАУ (Garcia-Junco et al, 2001; Kanaly et al, 2002; Wick et al, 2002; Miyata et al, 2004; Vacca et al, 2005). Проводились эксперименты по биодеградации сложных смесей ПАУ (Dean-Ross et al, 2002; Lotfabad et Gray, 2002; McLellan et al, 2002) и биоремедиации (Ramirez et al, 2001; Eriksson et al, 2003; Harper et al, 2005; Hickey et al, 2007).
Цель и задачи исследования.
Цель работы - поиск в коллекции и выделение из природных образцов штаммов бактерий, обладающих способностью к превращению широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных ПАУ), и изучение биоконверсии ПАУ данными штаммами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- отбор из лабораторной коллекции, а также выделение из загрязненных почв и донных осадков штаммов бактерий, способных к трансформации и полной деградации ПАУ;
- идентификация продуктов биоконверсии ПАУ новыми и ранее выделенными бактериальными штаммами; установление путей метаболизма ПАУ;
- качественное и количественное описание влияния различных факторов на конверсию ПАУ исследуемыми культурами;
- изучение биоконверсии интермедиатов метаболизма ПАУ.
Научная новизна работы. Выделены из природных образцов и охарактеризованы a3 новых штамма бактерий, способных к конверсии широкого спектра ПАУ: Arthrobacter sp. КЗ, способный к быстрой деградации фенантрена в высоких концентрациях; Sphingomonas sp. Mar-33, осуществляющий конверсию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорена, аценафтена, флуорантена, пирена и бензо[а]антрацена; Mycobacterium sp. Mar-59, растущий в минеральной среде с фенантреном или пиреном, и осуществляющий конверсию ряда ПАУ в соокислительных условиях. В качестве продуктов бактериального окисления флуорена впервые идентифицированы инданонкетоуксусная кислота, 2-гидроксифлуоренон и 2,7-дигидроксифлуорен. Показано, что соотношение концентраций двух главных продуктов конверсии флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 -флуоренола и флуоренона - четко зависит от удельной скорости роста биомассы; предложено объяснение наблюдаемого эффекта. Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacler sp. КЗ; показано, что добавление субстрата в растущую культуру вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей. Установлено, что процессы превращения фенантрена и антрацена в 1-гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно культурой Sphingomonas sp. Mar-33 являются высокоселективными реакциями, и описан метод получения продуктов в препаративных количествах. Показано, что накопительные культуры, а также штамм Sphingomonas sp. Mar-33, способны осуществлять превращение широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных) при культивировании в среде с экстрактом каменноугольного пека. Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы для биоремедиации почв и промышленных отходов нефтеперерабатывающих и коксохимических производств, загрязненных высокомолекулярными, особо устойчивыми ПАУ. Штамм Sphingomonas sp. Mar-33 представляет наибольший интерес, поскольку осуществляет деградацию широкого спектра ПАУ, в том числе в среде с экстрактом каменноугольного пека. Выделенные штаммы интересны также с точки зрения производства ценных соединений, трудно доступных химическим синтезом (например, гидроксипроизводных фенантрена, перспективных для применения в медицине). Полученные накопительные культуры, эффективные в отношении деградации высокомолекулярных ПАУ, могут быть использованы для выделения новых штаммов-деструкторов. Предложенная методика культивирования в среде с экстрактом каменноугольного пека может применяться для поддержания накопительных культур и в качестве тест-системы для исследования биоконверсии высокомолекулярных ПАУ. Разработанные методы кинетического анализа могут применяться для анализа реакций биоконверсии независимо от объекта исследования.
Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов
Молекулы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) содержат конденсированные ароматические кольца - циклы с общими атомами углерода. Простейшим ПАУ является нафталин, молекула которого состоит из двух конденсированных ароматических колец. У соединений большей молекулярной массы наблюдается изомерия положения колец. Кольца могут соединяться линейно, под углом, либо посредством пери-сочленения, этим обусловлено наличие многочисленных изомеров (рис. 1.1). ПАУ химически весьма стабильны, исключение составляют длинные молекулы линейного строения, например, тетрацен (Клар, 1971). Летучесть большинства ПАУ очень мала. Химические и физические свойства ПАУ благоприятствуют их длительному сохранению в загрязненных почвах и донных отложениях. Растворимость ПАУ в водных растворах крайне низка (таблица 1.1). Микроорганизмы, однако, способны потреблять субстрат из столь разбавленных растворов, поскольку субстратные константы ферментов и микроорганизмов (Ks) лежат в пределах 10" ...10 моль/л (Варфоломеев, Калюжный, 1990), т.е. сопоставимы с растворимостью большинства ПАУ в воде.
ПАУ образуются при пиролизе органических веществ в различных технологических и природных процессах. В наибольшей концентрации они содержатся в каменноугольной смоле, которая и является источником ПАУ для промышленности (Химическая энциклопедия, 1990). Из-за неспецифичности реакции образования ПАУ антропогенное загрязнение окружающей среды этими веществами является весьма общей проблемой, не связанной к какой-либо одной сферой деятельности. Главный источник поступления ПАУ в окружающую среду - сжигание топлива (Freeman et Cattel, 1990). В меньших объемах ПАУ образуются при лесных пожарах и извержениях вулканов (Sutherland et al, 1995). Наиболее опасны для здоровья человека проливы каменноугольных продуктов и нефти, такие локальные загрязнения следует подвергать очистке (Mueller et al, 1989). В качестве одного из перспективных методов устранения загрязнения рассматривается биоремедиация - метод очистки, предполагающий использование деятельности живых организмов (Bamforth et Singleton, 2005). Из-за наличия многих источников поступления в окружающую среду ПАУ обнаруживаются повсеместно - в воздухе (Greenberg et al, 1985), в донных отложениях (Yongblood et Blumer, 1975), в почве (Jones et al, 1989), в растениях и животных (Juhasz et Naidu, 2000). ПАУ токсичны для животных и человека (Sutherland, 1990). Многие из них, кроме того, обладают мутагенными и канцерогенными свойствами. Дибенз[о,Л]антрацен и бензо[а]пирен были первыми веществами, для которых была экспериментально показана канцерогенная активность (Шенталь, 1971). Сильным канцерогенным действием обладают, кроме того, дибензпирены, а также синтетическое нафтеноароматическое соединение - холантрен. Целый ряд ПАУ (хризен, бензо[а]антрацен, бензо[с]фенантрен и др.) проявляют канцерогенные свойства в меньшей степени; например, хризен активен лишь при подкожном введении (Клар, 1971).
Сопоставление скорости конверсии ПАУ в образцах загрязненной почвы и донных осадков со скоростью конверсии в стерильных контролях указывает на то, что деятельность микрофлоры играет главную роль в ремедиации территорий и акваторий, загрязненных полиароматическими углеводородами (Sutherland et al, 1995; Eriksson et al, 2003). Различные ПАУ подвержены биоконверсии в разной степени. Устойчивость ПАУ возрастает с увеличением молекулярной массы (Bossert et Bartha, 1986). ПАУ, молекула которых содержит более трех ароматических колец, проявляют повышенную устойчивость к биодеградации, в связи с чем их рассматривают отдельно, называя высокомолекулярными ПАУ (Kanaly et Harayama, 2000). Другие авторы (Johnsen et al, 2005) к высокомолекулярным относят ПАУ, содержащие 5-7 ароматических колец. Проблеме биодеградации высокомолекулярных ПАУ в последнее время уделяется особое внимание (Kanaly et Harayama, 2000; Juhasz et Naidu, 2000).
В аэробных условиях скорость конверсии ПАУ выше, а спектр ПАУ, подвергающихся конверсии, шире, чем в анаэробных условиях (Mihelcic et Luthy, 1988; Eriksson et al, 2003). Тем не менее, доказано, что ПАУ могут подвергаться биодеградации в условиях нитратредукции (McNally et al, 1998; Rockne et al., 2000) и сульфатредукции (Bedessem et al, 1997; Coates et al, 1997). Выделены штаммы, потребляющие нафталин, восстанавливая нитрат до нитрита (Rockne et al, 2000). Обнаружено микробное сообщество, осуществляющее анаэробную сульфат-зависимую минерализацию нафталина, фенантрена, флуорена и флуорантена (Coates et al, 1997).
К превращению. ПАУ способны самые разные живые организмы (бактерии, грибы, водоросли, животные), но, по-видимому, только некоторые бактерии осуществляют конверсию ПАУ с целью последующей ассимиляции образующихся продуктов. Смысл гидроксилирования ПАУ грибами и млекопитающими заключается, вероятно, в детоксикации (Cerniglia, 1984). Окисление ПАУ может быть также побочным эффектом работы мощных окислительных систем (например, лигнин-пероксидаз), предназначенных для другой цели (Casellas et al, 1998).
Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями..
Проникновение малых неполярных молекул ПАУ в клетку происходит путем пассивной диффузии и не требует специальных транспорных систем (Bateman et al, 1986). При переносе генов, кодирующих нафталин-диоксигеназу Pseudomonas sp. strain NCIB 9816, в E. coli полученный штамм-трансформант быстро окисляет нафталин, фенантрен и другие ПАУ, не нуждаясь в каких-либо особых генах для переноса субстрата через клеточную стенку (Resnick et al, 1996а; Parales et al, 2000). Тем не менее, в ряде работ выдвигаются аргументы в пользу существования систем активного транспорта ПАУ в бактериальную клетку (Whitman et al, 1998; Miyata et al, 2004).
Аэробные бактерии окисляют ароматическое кольцо, используя молекулярный кислород. Аэробная деградация ПАУ всегда начинается с замещения двух атомов водорода в ароматическом кольце двумя гидроксигруппами (Smith, 1990). Первую реакцию деградативного пути катализируют диоксигеназы, требующие НАД(Ф)Н в качестве донора электронов (Карасевич, 1982). Это многокомпонентные ферментные системы, состоящие из редуктазы, ферредоксина и оксигеназы (Parales et al, 1999). Первичным продуктом окисления ПАУ является дигидродиол. Реакция образования дигидродиола стереоспецифична; к примеру, при окислении нафталина получается (+)-IJUC-(IR,2S)-дигидрокси-1,2-дигидронафталин, при окислении фенантрена - (+)-i{uc-(3S,4R)-дигидрокси-3,4-дигидрофенантрен (Resnick et al, 1996а). Далее дигидродиол окисляется в дегидрогеназной реакции с образованием диоксипроизводного ПАУ, при этом происходит регенерация восстановительных эквивалентов, потраченных в диоксигеназной реакции. Диоксипроизводные ПАУ подвергаются действию дециклизующих диоксигеназ. Включение двух атомов кислорода в молекулу сопровождается разрывом ароматического кольца. Расщепление ароматического кольца может быть интрадиольным, т.е. между атомами углерода, несущими гидроксигруппы (его также называют o/wo-расщеплением), либо экстрадиольным (.ие/ш-расщепление), когда расщепляется другая С-С связь (как правило, прилежащая к соседнему ароматическому кольцу, что иногда обозначается термином «проксимальное расщепление»). Интрадиольный разрыв кольца приводит к образованию дикарбоновой ароматической кислоты, а экстрадиольный - к образованию монокарбоновой ароматической кислоты, чаще всего ароматического замещенного 2-кето-3-бутеновой кислоты. Этот продукт расщепляется в альдолазной реакции на пируват и производное ПАУ с числом колец, меньшим на единицу. При наличии у микроорганизма соответствующих ферментных активностей все кольца, составляющие молекулу ПАУ, последовательно расщепляются с образованием веществ центрального метаболизма. Пути деградации различных ПАУ на определенных этапах сходятся, различаясь лишь периферическими реакциями.
Ниже рассмотрены пути деградации флуорена, аценафтена, аценафтилена, фенантрена, антрацена, флуорантена и пирена; эти ПАУ использовались как субстраты в практической части работы.
Метаболизм флуорена Трансформацию флуорена способны осуществлять бактерии различной систематической принадлежности. Описан ряд штаммов грамположительных (Grifoll et al., 1992; Trenz et al., 1994; Monna et al., 1993; Boldrin et al., 1993) и грамотрицательных (Grifoll et al., 1994; Resnick et Gibson, 1996) бактерий, способных превращать флуорен. Некоторые штаммы растут в среде с флуореном в качестве единственного источника органического углерода, получая энергию исключительно в результате окисления флуорена (Grifoll et al., 1992). В отдельных случаях происходит полная деградация молекулы флуорена до углекислого газа и воды (Grifoll et al., 1994). Особенностью флуорена, как и других нафтеноароматических соединений, является высокая реакционная способность метиленовой группы. Флуорен легко окисляется по С9 в флуоренол и далее в флуоренон. Эту трансформацию осуществляют многие бактерии и грибы (Casellas et al., 1998). Нафталиндиоксигеназа из Pseudomonas sp. NCIB 9816 окисляет флуорен в 3,4-дигидродиол, но дает в качестве побочного продукта несколько процентов флуоренола (Resnick et Gibson, 1996). Существует два принципиально различных пути деградации флуорена бактериями: путь, начинающийся с окисления ароматического кольца, и путь, начинающийся с окисления метиленовой группы. В первом случае происходит окисление и расщепление одного из ароматических колец флуорена, аналогичное реакциям расщепления ароматического кольца у других ПАУ, приводящее к производным индана. Кольцо может окисляться по 3-4 -связи (рис. 1.2А), либо 1-2 -связи (рис. 1.2Б), оба варианта реализованы у штамма Arthrobacter sp. F101 (Casellas et al, 1997). Если процесс начинается с окисления метиленовой группы, в качестве интермедиата образуется флуоренон, который затем подвергается необычной реакции углового окисления (angular dioxygenation) и разрыву метиленового мостика с образованием производного дифенила, последующие реакции напоминают бактериальный метаболизм дифенила (рис. 1.2В). Путь реализован у Brevibacterium sp. DPO 1361 (Trenz et al, 1994), Pseudomonas sp. F204 (Grifoll et al, 1994), а также (кроме двух первых реакций) у штамма Pseudomonas mendocina МС2, использующего в качестве ростового субстрата флуоренон (Casellas et al, 1998). Метаболизм гетероциклических аналогов флуорена (дибензофурана, дибензотиофена и карбазола) аналогичен метаболизму флуорена (Bressler et Fedorak, 2000)
Культивирование штаммов, осуществляющих деградацию и трансформацию полиароматических углеводородов
В работе использовались штаммы Rhodococcus rhodochrous 172, R. opacus 4a. R. opacus 557, R.rhodnii 135 и Pseudomonas fluorescens 26k, отобранные из коллекции деструкторов ксенобиотиков лаборатории энзиматической деградации органических соединений по способности к превращению ПАУ, а также 3 новых штамма {Arthrobacter sp. КЗ, Sphingomonas sp. Mar-33 и Mycobacterium sp. Mar-59), выделенные нами при выполнении данной работы.
Выделение новых штаммов Для создания накопительных культур были использованы образцы почв и донных осадков, длительно загрязняемых полиароматическими углеводородами (таблица 2.1). Штамм Arthrobacter sp. КЗ выделен путем высева на богатую агаризованную среду из накопительной культуры, поддерживаемой в минеральной среде с фенатреном, инокулированной образцом № 9 (таблица 2.1). Штаммы Sphingomonas sp. Mar-33 и Mycobacterium sp. Mar-59 выделены из накопительной культуры, поддерживаемой в минеральной среде с экстрактом каменноугольного пека, инокулированной образцом № 7 (таблица 2.1). Из данной накопительной культуры, поддерживаемой далее в минеральной среде с флуорантеном, путем высева на богатую агаризованную среду был выделен штамм Sphingomonas sp. Mar-33; из этой же накопительной культуры, поддерживаемой далее в минеральной среде с пиреном, путем высева на агаризованную среду, содержащую ацетат натрия (0.5 г/л), был выделен штамм Mycobacterium sp. Mar-59. Все использованные в работе накопительные культуры были созданы внесением 5 г образца почвы или донных отложений в 100 мл соответствующей среды, инкубировались на качалке (29 С, 120 оборотов в минуту) с пересевом в свежую среду каждые две недели.
Идентификация новых штаммов Штамм Arthrobacter sp. КЗ идентифицирован но характерному изменению формы клеток в ходе развития периодической культуры и другим признакам, указанным в определителе Берджи (Bergey s Manual of systematic bacteriology, 1986).
Штаммы Sphingomonas sp. Mar-33 и Mycobacterium sp. Mar-59 идентифицированы на основании данных о нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Выделение ДНК проводили по методике, описанной ранее (Sambrook et ah, 1989). Амплификацию генов 16S рРНК осуществляли с универсальными праймерами 27f и 1492г на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems). Секвенирование амплифицированного фрагмента 16S рДНК проводили на автоматическом секвенаторе ДНК CEQ2000XL (Beckman Coulter) с использованием набора секвенирующих реагентов Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman Coulter) и прилагаемого к набору протокола. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК использовали программу ClustalX (Thompson et ai, 1994). Построение бескорневого филогенетического древа производили с помощью алгоритмов, реализованных в программе TREECON (Van de Peer et De Wachter, 1997).
Для культивирования микроорганизмов использовалась минеральная среда следующего состава (г/л): NH4N03 - 1.0, КН2Р04 - 1.0, К2НР04 - 1.0, MgS04-7H20 - 0.2, СаС12 - 0.02, FeCh - 2 капли насыщенного раствора; рН среды доводили до значения 7.5 с помощью 50% КОН. При выращивании накопительных культур в вышеуказанной минеральной среде нитрат аммония заменяли на нитрат калия (2 г/л), во избежание роста литотрофных бактерий. Для достижения требуемой концентрации ПАУ в среде инкубации (0.05-1 г/л) в минеральную среду вносили определенный объем раствора ПАУ в ацетоне (0.1-1 мл) с концентрацией 50 или 100 г/л; особо малорастворимые ПАУ (антрацен, бензо[ 7]антраиен. хризен) вносили в виде раствора в ацетоне с концентрацией 1-5 г/л. Колбы выдерживали на качалке перед инокуляцией в течение суток для испарения ацетона. Другие органические субстраты (сахара, карбоновые кислоты) вносили в виде 1 мл водного раствора с концентрацией 100 г/л, предварительно стерилизованного (0.5 атм., 30 мин.). Засев осуществлялся путем внесения 1 мл культуральной жидкости из культуры, свежевыращенной до стационарной фазы в минеральной среде, содержащей 1 г/л глюкозы (в случае Rhodococcus rhodochrous 172), 0.1 г/л фенантрена и 0.02 г/л L-метионина (в случае Arthrobacter sp. КЗ), 1 г/л ацетата натрия и 0.5 мкг/л витамина Вц (в случае Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ), либо 0.1 г/л пирена (в случае Mycobacterium sp. Mar-59). Культивирование проводилось на качалке (29 С, 120 оборотов в минуту) в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл культуральной жидкости.
Культивирование в среде с экстрактом каменноугольного пека Каменноугольный пек представляет собой самую высококипящую фракцию каменноугольной смолы. Для получения экстракта каменноугольного пека (далее - экстракт пека) использовался типичный заводской среднетемпературныи пек, предоставленный химическим отделом Углехимического института (г. Харьков). Характеристики пека: температура размягчения 65 С; массовые доли фракций, нерастворимых в толуоле и хинолине, соответственно 18.0 и 3.5 %. Навеску пека (10 г) экстрагировали в течение суток четырьмя объемами этилацетата по 100 мл при температуре 29 С и постоянном помешивании. Растворитель испаряли на роторном испарителе. Полученный таким образом экстракт пека представлял собой вязкую темно-коричневую жидкость с очень слабым характерным запахом. При нагревании он становился более текучим. Пек состоит главным образом из ПАУ с количеством ароматических колец от 3 до 7, с преобладанием молекул, содержащих 4-5 циклов (Гоголева, Шустиков, 1992). Концентрация флуорантена в используемом нами экстракте пека по данным ГЖХ анализа была около 45 мг/г, пирена - около 30 мг/г; концентрации фенантрена, антрацена, бензо[а]антрацена, хризена, бензо[6]флуорантена и бензо[а]пирена превышали 10 мг/г. Соотношение различных ПАУ в экстракте пека близко к таковому в почвах, длительно загрязненных каменноугольной смолой, где также преобладают высокомолекулярные ПАУ (Haeseler et ah, 1999).
В колбу объемом 750 мл помещали 5 г порошка силикагеля (многократно промытого водой и ацетоном, диаметр частиц 100-150 мкм). Колбу прогревали 2 часа при 150 С, охлаждали и наносили на силикагель 40 мкл экстракта пека, разбавленною ацетоном в пять раз. Для равномерного распределения экстракта пека силикагель перемешивали интенсивным покачиванием колбы. Затем в колбу приливали 100 мл стерильной минеральной среды и засевали. Силикагель применялся для предотвращения адгезии экстракта пека на стенках колбы. Инкубация осуществлялась в тех же условиях, как описано выше.
Культивирование на агаризованной среде, покрытой слоем ПАУ использовалось для проверки выделенных штаммов на способность к конверсии ПАУ и проводилось в двух вариантах (Kiyohara et al, 1982; Но et ah, 2000):
1). Чашки Петри с агаризованной минеральной средой опрыскивали насыщенным раствором ПАУ в диэтиловом эфире. При этом поверхность агара покрывалась пленкой углеводорода. Засев производился с помощью микробиологической петли; 2). Чашки Петри с агаризованной минеральной средой, содержащей пептон (0,1 г/л), засевали и инкубировали при 29 С в течение суток. Затем поверхность агара опрыскивали насыщенным раствором ПАУ в диэтиловом эфире и продолжали инкубацию. В обоих случаях колонии ПАУ-деструкторов легко обнаруживаются по растворению слоя ПАУ вокруг колонии, часто с появлением желтого окрашивания.
Непрерывное культивирование штамма Arthrobacter sp. КЗ Штамм Arihrobucier sp. КЗ культивировали при 29 С в ферментере объемом 0.45 л, в который при помощи перистальтического насоса с заданной скоростью подавалась минеральная среда, содержащая 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту (50 мг/л) и L-метионин (20 мг/л). Культуральная жидкость интенсивно перемешивалась магнитной мешалкой и вытекала из ферментера со скоростью, равной скорости подачи среды. Путем измерения динамики вымывания (Варфоломеев, Калюжный, 1990) было показано, что система удовлетворяет модели безградиентного проточного реактора с идеальным перемешиванием.
Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus
Скрининг 46 штаммов из лабораторной коллекции деструкторов ксенобиотиков с помощью анализа культуральной жидкости методом ТСХ позволил отобрать 5 штаммов, способных к превращению ПАУ: Rhodococcus rhodochrous 172, R. opacus 4a, R. opacus 557, R.rhodnii 135 и Pseudomonasfluorescens 26k.
Из образцов почв и донных отложений, длительно загрязняемых нолиаромшичсскн.мп соединениями, выделены 3 штамма-деструктора ПАУ: Arthrobacter sp. КЗ, Sphingomonas sp. Mar-33 и Mycobacterium sp. Mar-59.
Штамм КЗ отнесен к роду Arthrobacter sp. по определителю бактерий Берджи. Для штамма Маг:33 была определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК длиной 1376 нуклеотидов. Поиск в GenBank с помощью программы BLASTn выявил близкое родство штамма с представителями рода Sphingomonas. Филогенетическое древо (рис. 3.1) показывает родство штамма Маг-33 по отношению к типовым штаммам ближайших видов данного рода. Штамм Маг-33 объединяется в единый кластер с типовыми штаммами видов S. cloaceae, S. chlorophenolicum, S. herbicidovoram и S. yanoikuyae, имея наибольший уровень сходства нуклеотидных последовательностей с S cloaceae - 97.0%. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма Sphingomonas sp. Маг-33 записана в GenBank под номером EF128173. Штамм сдан на хранение в ВКМ под номером VKM В-2434.
Была определена нуклеотидная последовательность (600 н.о.) гена 16S рРНК штамма Маг-59. Поиск в GenBank с помощью программы BLAST показал 99% сходство нуклеотидной последовательности 16S рРНК штамма Маг-59 с 16S рРНК типового штамма Mycobacterium gilvum. Нуклеотидная последовательность штамма Mycobacterium sp. Маг-59 записана в GenBank под номером EF128172. Штамм сдан на хранение в ВКМ под номером VKM В-2435.
Штамм Rhodococcus rhodochrous 172 был выбран для дальнейшего изучения, поскольку проявил способность к осуществлению наиболее разнообразных реакций трансформации и деградации флуорена среди четырех исследованных штаммов родококков. В минеральной среде, содержащей глюкозу, фруктозу, малат калия, пропионат натрия, сукцинат калия, лактат кальция или сахарозу штамм Rhodococcus rhodochrous 172 растет экспоненциально с удельной скоростью 0.20, 0.20, 0.19, 0.18, 0.13, 0.09 и 0.05 ч"1 соответственно. В жидкой минеральной среде с флуореном по данным турбидиметрии штамм не растет. При культивировании в минеральной среде, содержащей флуорен и один из вышеназванных ростовых субстратов, наблюдалась биоконверсия флуорена, проявляющаяся в убывании концентрации флуорена и появлении продуктов, отсутствовавших в стерильном контроле (данные ТСХ). Из всех исследованных ростовых субстратов только рост культуры на сахарозе приводил к конверсии флуорена в концентрации 100 мг/л и выше. На рисунке 3.4 показана динамика уменьшения концентрации флуорена при росте культуры на сахарозе по сравнению с культивированием в минеральной среде с флуореном в отсутствие косубстрата. При использовании сахарозы в качестве косубстрата высокая скорость превращения флуорена наблюдалась в широком диапазоне начальных концентраций сахарозы. Если начальная концентрация сахарозы была достаточна, происходило полное удаление флуорена из культуральной жидкости. Биоконверсия флуорена при использовании сахарозы в качестве косубстрата качественно отличалась от превращения флуорена при использовании других ростовых субстратов. На рисунке 3.5 показана динамика спектра культуральной жидкости при внесении флуорена в культуру, экспоненциально растущую в минеральной среде с сахарозой (А), глюкозой (Б) и пропионатом натрия (В). Добавление флуорена в культуру, растущую в среде с сахарозой, отличалось быстрым накоплением в среде соединений, поглощающих в видимой области спектра.
На рисунке 3.6 показаны кривые изменения концентраций биомассы, сахарозы и флуорена при инкубации штамма R. rhodochrous 172 в минеральной среде с флуореном и сахарозой в координатах время - концентрация и в координатах экспозиция - концентрация. Из графиков следует, что удельная скорость потребления сахарозы в ходе ферментации оставалась постоянной (кривая 2 на рисунке 3.6Б), тогда как удельные скорости конверсии флуорена и роста биомассы существенно снижались (кривые 1 и 3 на рисунке 3.6Б). Наиболее вероятным объяснением подавления роста и конверсии флуорена при постоянстве скорости потребления сахарозы представляется ингибирование метаболитами флуорена процессов, требующих затрат энергии (рост биомассы, кометаболизм флуорена). В пользу этого предположения говорит также наличие среди идентифицированных метаболитов флуорена (см. ниже) веществ, потенциально способных к разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования.
