Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Представления о нефтяных месторождениях как экосистемах и о развитии в них микробных процессов с. 11.
1.1. Экологические условия нефтяных пластов с.12.
1.2. Распространение и количественная оценка скоростей современных биогеохимических процессов сульфатредукции в месторождениях нефти ...с.17.
Глава 2. Общая характеристика и систематика сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) с.20.
2.1. Систематика с.21.
2.2. Метаболизм с.22.
2.2.1. Доноры электронов (протонов) и углерода с.27.
2.2.2. Акцепторы электронов с.28.
Глава 3. Галофильные и термофильные СВБ .
3.1. Галофильные СВБ с.32.
3.1.1. Классификация галофильпых СВБ с.32.
3.1.2. Галофилия. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям солей с.ЗЗ.
3.1.3. Таксономическое положение и метаболизм умеренно-галофильных СВБ с.37.
3.2. Термофильные СВБ с.42.
3.2.1. Классификация термофильных микроорганизмов с.42.
3.2.2. Механизмы термофилии с.43.
3.2.3. Таксономическое положение и метаболизм термофильных СВБ: с.44.
Выводы по обзору литературы с.53.
Экспериментальная часть
Глава 4. Объекты и методы исследования с.55.
4.1. Объекты исследования с.55.
4.2. Характеристика источников выделения бактерий с.55.
4.2.1. Характеристика нефтяного месторождения района Персидского залива с.55.
4.2.2. Месторождения Западной Сибири с.56.
4.2.3. Характеристика нефтяного месторождения Китая с.56.
4.3. Состав питательных сред, условия для выделения, поддержания, культивирования и учета микроорганизмов с.57.
4.4. Получение клеточной суспензии с.59.
4.5. Микроскопические методы с.59.
4.6. Аналитические методы с.60.
4.7. Методы определения активности ферментов с.66.
4.8. Молекулярно - биологические методы с.67.
Результаты и обсуждение
Изучение и описание микроорганизмов выделенных из нефтяных месторождений
Глава 5. Галофильные СВБ с.70.
5.1. Морфология клеток с.70.
5.2. Параметры роста с.70.
5.3. Метаболизм с.72.
5.4. Биохимические характеристики с.91.
5.5. Генотипичесике характеристики и филогенетический анализ с 92.
5.6. Описание рода Desulfovermiculus gen. nov с.98.
5.6.1. Описание вида Desulfovermiculus halophilus gen. nov., sp. nov c.99.
Глава 6. Термофильные СВБ c.100.
6.1. Морфология клеток с. 100.
6.2. Параметры роста с. 100.
6.3. Метаболизм с.104.
6.4. Краткая характеристика штамма Д-4 с. 114.
6.5. Генотипическая характеристика и филогенетический анализ с.116.
6.6. Хемотаксономический анализ с.119.
6.7. Описание вида Desulfotomaculum salinum sp. nov с. 121.
Глава 7. Возможности функционирования исследованных микроорганизмов в природных экотопах с. 126.
Заключение с.134.
Выводы с. 136.
Литература с. 137.
- Распространение и количественная оценка скоростей современных биогеохимических процессов сульфатредукции в месторождениях нефти
- Галофилия. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям солей
- Состав питательных сред, условия для выделения, поддержания, культивирования и учета микроорганизмов
- Описание рода Desulfovermiculus gen. nov
Введение к работе
Сульфатвосстанавливающие бактерии (СВБ) являются постоянными членами микробных сообществ, развивающихся в эксплуатируемых залежах углеводородов, в частности нефтяных месторождениях, подвергающихся заводнению поверхностными и оборотными пластовыми водами. Как правило, вторичное заводнение нефтяных пластов приводит к появлению или увеличению содержания сульфатов, появлению доступного органического вещества и биогенных элементов, в том числе азота и фосфора. Все это способствует активизации СВБ, обитающих в нефтяных месторождениях. Их жизнедеятельность приводит к изменению состава пластовых вод и вмещающих пород. Образуемый ими сероводород растворяется в пластовой воде, нефти, и входит в состав попутного газа, что активизирует коррозию нефтепромыслового металлического оборудования. Продукт реакции сероводорода и растворенного двухвалентного железа (II) -сульфид откладывается в порах пласта и уменьшает приемистость нагнетаемой воды. Таким образом, изучение СВБ нефтяных пластов, их свойств, позволяющих им функционировать в нефтяных пластах, является актуальной проблемой.
Состояние вопроса, цели и задачи
Впервые СВБ были выявлены в нефтяных пластах в 1926 году Бастином в Америке и Гинзбург-Карагичевой в Советском союзе. Затем вклад в изучение этой группы микроорганизмов, обитающих в углеводородных залежах, внесли исследования Зо Белла в Америке и исследователи школы СИ. Кузнецова в СССР (Кузнецова, Горленко, Розанова, Назина и др.). В последние десятилетия, в связи с проблемой разработки микробиологических методов увеличения нефтеотдачи пластов, изучение микрофлоры нефтяных месторождений интенсифицировалось и в нем приняли участие европейские ученые — Франции, Норвегии, Америки, Японии и других стран (Назина, Беляев, 2004). В результате всех этих исследований было обнаружено значительное биологическое разнообразие СВБ, обитающих в нефтяных месторождениях. Среди них были выявлены мезофильные и термофильные представители, галофильные и галотолерантные. Если термофильные представители нефтяных пластов составили довольно большую группу, то известные галофильные представители нефтяных месторождений немногочисленны. Все галофильные бактерии, известные на сегодняшний день, и выделенные из различных засоленых экосистем оказались хемолитогетеротрофами и окисляли органические вещества
неполностью - до ацетата и СОг (исключение Desulfobacter halotoleranse (Brandt, Ingvorsen, 1997)). Вопрос о существовании автотрофных галофильных СВБ, полностью окисляющих органические вещества до СОг, способных развиваться в гиперсоленых условиях, оставался открытым. В тоже время, большинство нефтяных месторождений, расположенных на больших глубинах, характеризуются высокой соленостью пластовых рассолов. Это месторождения Волго-Уральского региона, регионов Каспийского Моря, стран Персидского залива и другие. По литературным данным, в гиперсоленых экосистемах, в том числе в нефтяных месторождениях, накапливается ацетат. Поэтому.* представляло интерес выявить существование галофильной СВБ, способной развиваться в условиях высокой солености пластовых вод, выделить чистую культуру и исследовать ее метаболизм, в частности возможность автотрофного роста и полного окисления органических соединений.
С точки зрения изучения биоразнообразия термофильных СВБ было целесообразно продолжить исследование термофильной микрофлоры высокотемпературных нефтяных месторождений. В Советском Союзе такие исследования проводились на месторождениях Апшеронского п-ва (Назина, Розанова, 1978). Термофильная сульфатредуцирующая микрофлора высокотемпературных месторождений углеводородов Западной Сибири оставалась недостаточно изученной. В то же время, было известно, что заводнение месторождений Западной Сибири значительно активизирует биогенные процессы сульфатредукции и приводит к накоплению сероводорода в пластовых водах.
Значительную часть всех изученных термофильных СВБ, обитающих в разных экосистемах, представляют споровые формы рода Desulfotomaculum. Среди представителей нефтяных пластов описаны Desulfotomaculum thermocisternum (Nilsen, Torsvik, Lien; 1996), Desulfotomaculum kusnetzovii (Назина, Иванова; 1988), Desulfotomaculum nigrificans (Werkman, Weaver; 1927). Термофильные виды рода Desulfotomaculum значительно различаются по характеру метаболизма органических соединений и водорода. Некоторые из них способны развиваться в хемолитоавтотрофных условиях за счет Н2/СО2, но окисляют органические соединения не полностью, таковыми являются - Desulfotomaculum australicum, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum (Plugge, Balk, Stams, 2002). Другие полные окислители органических соединений не окисляют водород. D. nigrificans, является хемолитогетеротрофом и не полностью окисляет органические соединения до ацетата и СОг.
В коллекции ИНМИ имелись два представителя рода Desulfotomaculum - штаммы 435 и 781, выделенные из высокотемпературных углеводородных залежей Западной Сибири,
tf'
ч*
*
которые на основании некоторых изученных свойств были отнесены к виду D. nigrificans (Назииа, Розанова, 1978). В настоящее время эти данные оказались недостаточными, чтобы полностью охарактеризовать эти СВБ, поэтому возник вопрос об уточнении систематического положения этих микроорганизмов и выявлении метаболических особенностей с привлечением современных методов исследования, ^то позволило бы внести ясность в характеристику рода Desulfotomacuhim и объяснить возможность их существования в нефтяных месторождениях Западной Сибири.
Практические аспекты выделения и изучения свойств СВБ, обитающих в нефтяных пластах, определяются возможностью использования их при испытании бактерицидов, применяемых в качестве тест-объектов в технологиях, разрабатываемых с целью борьбы с сероводородной коррозией нефтепромыслового оборудования.
Цель и задачи исследования Цель:
Исследование метаболизма и таксономии ряда штаммов сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов с высокой температурой или соленостью пластовых вод.
Основные задачи исследования:
1. Поиски выделение чистой культуры галофилыюй сульфатвосстанавливающей
і бактерии из нефтяного месторождения с высокой соленостью пластовой воды;
исследование ее морфологии, определение параметров роста, особенностей
метаболизма.
Установление филогении и систематического положения галофильной сульфатвосстанавливающей бактерии - штамма 11.
Определение параметров роста термофильных СВБ - штаммов 435, 781 выделенных ранее из высокотемпературных газового и нефтяного месторождений углеводородов Западной Сибири, а также штамма Д-4, выделенного из высокотемпературного месторождения углеводородов Китая. Выявление особенностей метаболизма этих штаммов.
Установление филогении и систематического положения термофильных
сульфатвосстанавливающих бактерий штаммов 435 и 781.
Научная новизна
Расширены знания о биологическом разнообразии галофильных и термофильных СВБ, обитающих в экотопах нефтяных месторождений.
Впервые выделена и охарактеризована хемоорганотрофная и факультативно-хемолитоавтотрофная умеренно-галофильная сульфатвосстанавливающая бактерия - штамм 11, развивающаяся в средах с содержанием NaCI 30-230 г/л. Бактерия полностью окисляет бутират и развивается в хемолитоавтотрофных условиях за счет Н2/СО2 в средах с оптимальным количеством NaCI 80-100 г/л. На основании гено- и фенотипических свойств микроорганизм отнесен к новому роду и виду Desulfovermiculus halophilus gen. nov., sp. nov. и помещен на отдельную ветвь подкластера филогенетического дерева дельта-протеобактерий, в который включены микроорганизмы семейства Desulfohalobiaceae. Штамм 11 представлен грамотрицательными подвижными вибрионами, является мезофилом и нейтрофилом; в процессах сульфатредукции окисляет ряд органических соединений, в том числе лактат, аланин, жирные кислоты - формиат, бутират и пропионат. В клетках»выращенных на среде с бутиратомч обнаружена высокая активность СО-дегидрогеназы. Это позволило отнести изучаемый микроорганизм к метаболическому типу сульфатвосстанавливающих бактерий -полных окислителей, характеризующихся наличием ферментов пути Вуда, которые принимают участие в разложении ацетил-КоА до 2-х молекул СОг. Окисление бутирата в гиперсоленых условиях 200 г/л NaCI сопровождается образованием ацетата. Ряд других субстратов, в том числе пропионат, разлагались с накоплением ацетата. Ростовые характеристики и метаболические свойства штамма 11 дают основание заключить, что микроорганизм может являться обитателем ряда глубинных нефтяных месторождений с высокой соленостью пластовых вод, в том числе Волго-Уральского региона.
Охарактеризованы два штамма термофильных спорообразующих СВБ - 435 и 781, обитающих в высокотемпературных месторождениях углеводородов Западной Сибири. На основании генотипических свойств и филогении бактерии были отнесены к новому виду Desulfotomaculum salinum sp. nov. Исследованные штаммы располагаются в подкластере 1С филогенетического дерева 16S рРНК рода Desulfotomaculum. В процессах сульфатредукции бактерии разлагали широкий круг органических соединений, в том числе жирные кислоты и одноуглеродные соединения — метанол и формиат. Ряд органических соединений окислялись без накопления ацетата, что свидетельствует о принадлежности исследованных СВБ к метаболическому типу полных окислителей. Лактат окислялся с образованием ацетата. Кроме того, эти микроорганизмы росли в хемолитоавтотрофных условиях, используя в
процессах сульфатредукции Н2/СО2, образуя небольшие количества СН4. Выявлены некоторые особенности метаболизма, ранее не обнаруженные у представителей рода Desulfolomaculum: показано, что ацетат окислялся слабо, однако присутствие дрожжевого экстракта стимулировало потребление ацетата. Уменьшение содержания лактата в среде приводило к снижению образования ацетата на единицу окисленного субстрата. Новым свойством для представителей рода Desulfotomaculum являлось диспропорционирование тиосульфата.
По ростовым характеристикам и метаболическим свойствам бактерии приспособлены к средам обитания и это позволяет считать, что они функционируют в пластах заводняемых нефтяных месторождений Западной Сибири и участвуют в образовании сероводорода.
Практическая значимость работы
Полученные результаты могут быть применены в разработках технологий борьбы с сероводородной коррозией нефтепромыслового оборудования, где используют бактерициды, подавляющие развитие СВБ.
В качестве тест-объектов, как правило, применяют коллекционные СВБ, выделенные из слабосоленых вод. В то же время известно, что бактерии устойчивые к высокой солености, более устойчивы к воздействию бактерицидов. Поэтому, при апробации бактерицидов в случае разработки технологий подавления сульфатредукции для месторождений с пластовыми рассолами, в частности Волго-Урапьского региона, в качестве тест-объектов целесообразно использовать микроорганизмы, устойчивые к высоким концентрациям солей. Таким микроорганизмом является исследованный нами галофильный штамм 11.
Изученные термофильные СВБ также могут служить тест-объектами для разработки указанных технологий, применительно к месторождениям Западной Сибири. Известно, что клетки термофилов более устойчивы к различным неблагоприятным факторам, чем клетки мезофилов, а споры представителей рода Desulfotomaculum более устойчивы, чем вегетативные клетки.
По литературным данным известно, что биомасса бактериальных клеток является агентом, закупоривающим поры пластов. Поры наиболее проницаемых, промытых водой пропластков нефтяных залежей, закупориваются в первую очередь, что является причиной изменения направления потоков воды, поступающих в менее промытые пропластки, и приводит к увеличению нефтеизвлечения. Такая закупорка может быть составной частью механизмов, приводящих к увеличению нефтеотдачи пластов в разработанной в ИНМИ РАН
технологии повышения нефтеотдачи, основанной на активизации пластового бактериального сообщества. Существенную роль в избирательной закупорке могут оказывать СВБ, образующие сероводород, реакция которого с растворенным в воде железом приводит к образованию нерастворимых сульфидов. На Локбатанском месторождении Апшсрона, заводняемом морской водой, применялась указанная технология. Увеличение нефтеизвлечения сопровождалось здесь активизацией жизнедеятельности СВБ. Таким образом, изучение свойств СВБ нефтяных пластов приобретает важное значение в связи с вопросами, имеющими отношение к биотехнологиям нефтеизвлечения.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на всероссийском симпозиуме
^ «Биотехнология микробов» посвященном 120-летию со дня рождения академика В.Н.
Шапошникова (с международным участием) (г. Москва, МГУ, 2004 г), на третьем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 14-18 марта, 2005 г), на 9-й международной пущипской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 18-22 апреля 2005 г).
Публикации
Основные материалы диссертации опубликованы в 3-х статьях (4-я принята в печать) и 4-х тезисах.
' Объем и структура работы
Диссертация состоит из разделов: «Введения», «Обзора литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования» «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Материалы изложены на 154 страницах печатного текста и включают 38 таблиц, 17 рисунков. Список литературы содержит 54 наименования отечественных и 157 иностранных работ.
Место проведения работы
Работа проведена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в
^ лаборатории нефтяной микробиологии (зав. лаб. - д.б.н. проф. С.С. Беляев) под руководством
в.н.с, д.б.н. Е.П. Розановой. В работе по определению скорости сульфатредукции в средах с
различной соленостью принимал участие И.А. Борзенков. Электронно-микроскопические
исследования проводили в ИНМИ РАН совместно с Л.Л. Митюшиной; геносистематические
с A.M. Лысенко (ИНМИ РАН), Т.П. Туровой и А.Б. Полтараусом (ИМБ РАН); хемотаксоїіомические с Г.А. Осиповым (РАМН). Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю в.н.с. д.б.н. Е.П. Розановой за постоянное внимание, поддержку и ценные советы при обсуждении результатов, зав. лаб. проф. С.С. Беляеву, Т.Н. Пазиной, А.Е. Ивановой, а также всем коллегам и друзьям ИНМИ за содействие и поддержку.
Распространение и количественная оценка скоростей современных биогеохимических процессов сульфатредукции в месторождениях нефти
Современные биогенные процессы трансформации нефти и участвующие в них микроорганизмы в настоящее время интенсивно исследуются. Интегральную оценку активности микробного сообщества в эксплуатируемых залежах углеводородов в целом дают радиоизотопные методы определения скоростей терминальных процессов биодеградации нефти. В ряде нефтяных месторождений радиоизотопными методами измерены скорости современных биогенных процессов метаноокисления, ацетогенеза, сульфатредукции, метанообразования (Беляев, 1979; Иванов и соавт., 1983; Галушко и соавт., 1993; Борзенков и соавт., 1991). Эти результаты, наряду с анализом стабильных изотопов углерода метана и углекислоты, серы, сульфатов и сероводорода показали, что в месторождениях нефти микроорганизмы осуществляют активную геохимическую деятельность. Микробиологические процессы наиболее активно протекают на участках пластов, подвергшихся влиянию искусственного заводнения, особенно в зоне контакта закачиваемых вод с продуктивным горизонтом. (Беляев и соавт., 1982; Иванов и соавт., 1982, 1983; Беляев Иванов, 1990; Назинаи соавт. 1995, 1996; Борзенков и соавт., 1997). Процессы сульфатредукции были зарегистрированы радиоизотопными методами в пластах с температурой от 17 до 80 С. Скорость процессов восстановления сульфатов была максимальной вблизи нагнетательных скважин, что доказывает их приуроченность к зоне окисления нефти с участием аэробных микроорганизмов (Табл. 1). В настоящее время можно считать установленной решающую роль процессов бактериальной сульфатредукции в образовании сероводорода в заводняемых терригепных и карбонатных нефтяных коллекторах (Nazina, Xue, et al. 2000 a.; Nazina, Xue, et al. 2000 b; Тарасов, Борзенков и соавт. 2002; Bonch-Osmolovskaya, Miroshnichenko et al. 2003; Беляев, Лауринавичус, 1982). Подробно изучены скорости процессов восстановления сульфатов на месторождениях Волго-Уральского региона и Западной Сибири. На Ромашкинском (залежи 302 и 303) и Бавлинском месторождениях, воды которых обогащены сульфатами и биогенным сероводородом, сульфатредукция была доминирующим терминальным процессом. Численность СВБ в этих экосистемах колебалась от единиц до 105 клеток/мл. Однако, по мнению Нильсена и соавторов, а также других исследователей, численность не является показателем активности микробиологического процесса, а только свидетельствует о присутствии микроорганизмов в пластах (Nilsen et al., 1996). Таким образом, знание состава и функционирования микробного сообщества нефтяного пласта позволяет прогнозировать развитие протекающих здесь процессов, в частности процесса редукции сульфата, вызывающего ряд нежелательных явлений, связанных с коррозией обрудования. Ниже приведена таблица 1, характеризующая скорости сульфатредукции в нефтяных месторождениях с карбонатными и терригенными коллекторами.
Из приведенного обзора можно заключить, что в разрабатываемых нефтяных пластах обитает многокомпонентное микробное сообщество. Активное развитие сульфатвосстанавливающих бактерий, также как и формирование микробного сообщества в целом, во многом зависит от физико-химических условий пласта и наличия доступных биогенных элементов. В заводняемых нефтяных пластах присутствуют органические вещества различного происхождения, доступные СВБ. Способность использовать насыщенные углеводороды, позволяет этим бактериям не зависеть от других микроорганизмов и вести одноступенчатый распад нефти, в иных случаях они включаются в пищевую цепь на конечном этапе, подобно метаногенам. Сульфатвосстанавливающие бактерии заселяют месторождения углеводородов с различными экологическими условиями и сульфатредукция является одним из основных процесов, развивающихся в обогащенных SO42" экотопах. Сульфатредукция доминирует в карбонатных и в песчаных нефтяных коллекторах, где в пластовых водах содержатся высокие концентрации сульфатов и сероводорода. В настоящее время из нефтяных месторождений выделено 20 видов сульфатвосстанавливающих бактерий, среди них 11 термофилов и 9 мезофилов (Назина, Беляев,2004). Облигатно-анаэробные сульфатвосстанавливающие бактерии, осуществляющие процесс диссимиляциониой сульфатредукции, являются одной из важнейших групп микроорганизмов, участвующих в процессах разрушения органического вещества. Эти бактерии представляют важное звено, связывающее потоки углерода и серы в анаэробных зонах, обогащенных сульфатами, а также осуществляют регуляцию потоков энергии в нишах, лишенных сульфатов (Розанова, Назина, 1989). Сульфатвосстанавливающие бактерии обнаружены среди эубактерий и архебактерий.
К сульфатвосстанавливающим эубактериям относятся организмы с различными морфологическими признаками. Среди них есть одноклеточные, нитчатые, трихомные формы; вибриоидные, палочковидные, кокковидные; неподвижные или передвигающиеся с помощью жгутиков, а трихомные — скольжением. Большинство имеют клеточную стенку грамотрицателыюго типа. Представители родов Desiilfotomaculum и Desulfosporosinus являются грамположительными бактериями и характеризуются способностью образовывать эндоспоры.
Число органических субстратов, используемых сульфатвосстанавливающими эубактериями в качестве источника углерода и энергии в процессе восстановления сульфата достаточно велико: сахара, спирты, органические кислоты, (в том числе жирные кислоты, содержащие до 18 углеродных атомов), аминокислоты, некоторые ароматические соединения, и многие другие. Полимерные соединения не используются. По типу метаболизма сульфатредуцирующие бактерии относятся к хемоорганотрофам, но могут развиваться в хемолитогетеротрофных или в хемолитоавтотрофных условиях, так как кроме органических субстратов они могут использовать энергию окисления молекулярного водорода.
Галофилия. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям солей
Согласно данным современных исследований, основным ионом среды, вызывающим галофилию, является ион Na+. Ион натрия в большем или меньшем количестве присутствует в средах. Галофилия, как правило, связана с требованием повышенной концентрации этого иона. Однако, многие СВБ требуют для роста присутствия ионов Са или Mg . Таким примером служат сульфатвосстанавливающая бактерия Desulfohalobium retbaense (Ollivier, Hatchikian, 1991) и метаноген - Methanococcoides euhalobius (Чарахчьян, Митюшина и др., 1989). С другой стороны, есть сведения о том, что ион СГ в ряде случаев оказывает специфическое воздействие на галофильные микроорганизмы (Larsen, 1962). В данном обзоре приведена классификация галофильных микроорганизмов Ларсена. По Ларсену (Larsen, 1962) в противоположность галотолераитпым бактериям, которые не требуют NaCl в средах для роста, но могут расти в условиях повышенной солености, галофилам NaCl для роста необходим. Галофильные организмы могут быть разделены на три группы на основании их потребностей к NaCl (Табл. 4).
К экстремальным галофилам относятся микроорганизмы (в частности представители рода Halobacterium - архей), развивающиеся при начальном содержании NaCl около 15 %.
Конкретная классификация существующих галофильных СВБ приведена Оливье и соавторами (Ollivier, Caumette, 1994) и дополнена с учетом новых данных (Табл. 5) по следующему принципу: слабо-галофильные бактерии: 1) нижняя граница - до 1% NaCl, 2) оптимум для роста - до 3% NaCl; умеренно-галофильные бактерии: 1) нижняя граница роста - более 1% NaCl, 2) оптимальные.значения содержания NaCl для роста от 4% и выше. Экстремалыю-галофильные СВБ не найденш Для большинства известных СВБ характерны невысокие или умеренные значения солености сред по NaCl, не превышающие 10 %. Верхняя граница содержания NaCl для отдельных представителей достигает 24 % (Табл. 5).
. Галофилия. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям солей 3.1.2.1. Биохимическое действие высоких концентраций растворенных веществ
Действие высоких концентраций растворенных веществ на микроорганизмы может быть обусловлено самим растворенным веществом или влиянием на активность воды, a w. Любое вещество, содержащееся в растворителе, притягивает молекулы этого растворителя, снижая их подвижность. Активность воды определяется согласно уравнению:
aw = р/ро= n2/n,-n2
где р - давление пара раствора, а р0 - давление пара растворителя (чистой воды), пьП2 -число молей растворителя и растворенного вещества соответственно (Кашнер, 1981). Организм, живущий при наличии высоких концентраций растворенных веществ, находится в условиях низкой активности воды. На рисунке 5 приведены величины активности воды в растворе NaCl, в которых возможен рост микробов. Рис. 5.
Жизнедеятельность микроорганизмов можно наблюдать в экосистемах с большим диапазоном солевых концентраций - от пресноводных и морских биотопов до экотопов с гиперсолеными условиями, вплоть до полного насыщения NaCl. Галофильиые и галотолерантные микроорганизмы были обнаружены среди архей, бактерий и эукариот. Популяционная плотность микроорганизмов в гиперсоленых местообитаниях, таких как соленые озера и рассолы продуктов питания - часто весьма высока (Oren., 1999). В таблице 1 было указано, что процессы сульфатредукции развиваются в нефтяных пластах с высокой соленостью пластовых вод.
Любые микроорганизмы, живущие в условиях высокой концентрации солей во внешней среде, подвержены действию физиологического стресса. Различают два вида стресса: осмотический - для микроорганизмов, находящихся в растворе, и матричный — для микроорганизмов, растущих на поверхностях, например, частицах почвы (Кашнер, 1981).
Осмотический стресс для микроорганизмов, обитающих в условиях высокого содержания солей в среде — является основным. В связи с этим, по обзору различных литературных источников, известно несколько механизмов защиты клетки от осмостресса: . изменение состава клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и других клеточных структур, поглощение осмолитиков из внешней среды, синтез осмолитиков, откачка из клетки ионов натрия и замена их на ионы калия, установление осмотического равновесия путем отдачи воды в окружающую среду, изменение скорости метаболизма.
Состав питательных сред, условия для выделения, поддержания, культивирования и учета микроорганизмов
Выделение, культивирование и изучение физиологических свойств сульфатвосстанавливающих бактерий осуществляли с применением анаэробной техники Хангейта. Микроорганизмы культивировали в пробирках Хангейта объемом 16 мл, содержащих - 10 мл жидкой среды, газовая фаза была представлена молекулярным азотом или аргоном (в особых случаях - Н2/СО2 - 80:20 об. %).
Штаммы 435, 781 и D. kuznetsovii 17т поддерживали путем последовательных пересевов (1 раз в три месяца) на среду Видделя солоноватую № 1 (Widdel, 1980), содержащую (г/л): NaCl - 5.0; MgCI2 х 6Н20 - 0.6; KCI - 0.3; СаС12 х 2Н20 - 0.1; NH4C1 - 0.3; КН2Р04 - 0.2; Na2S04 - 2.8; ЫаНСОз - 1.5; с двумя восстановителями (Na2S х9Н20-0.3 г/л HNa2S2O4-0.05 г/л) и фумаратом натрия (1.0 г/л), снабженную микроэлементами (10 мл/л) по рецепту Пфеннига и Липперта (Pfennig, Lippert, 1966). Состав раствора микроэлементов, мг/л: ЭДТА - 500, FeS04 х 7Н20 - 200, ZnS04 х 7Н20 - 10, MgCl2 х 4Н20 - 3, СоС12 х 6Н20 - 20, Н3В04 -30, СиС12х 6Н20 — 2, Na2Mo04x 2Н20 - 3, вода дистиллированная - 1 л. В среды вносили 1 мл/л этого раствора. Для выяснения интервала температуры, солености и рН для роста штаммов 435 и 781 использовали ту же среду.
Штамм Д-4 выделяли на среде того же состава, как и для выделения штаммов 435 и 781. Для очищения сульфатвосстанавливающих бактерий от спутников - метанобразующих бактерий, в среду добавляли БЭС (бромэтансульфонат) в концентрации 30 и 70 мМ. Минеральной основой для получения накопительной культуры, выделения чистой галофилыюй сульфатвосстанавливающей бактерии служила модифицированная по содержанию натрия, кальция и магния среда Видделя морская №2 (Widdel, 1980), имеющая в составе (г/л): NaCl - 150; MgCl2 X 6Н20 - 3; СаС12 X 2Н20 - 10; КС1 -0.5; NH4C1 - 0.3; КН2Р04 - 0.2; Na2S04 - 2.8; NaHCCb - 1.5. В среду вносили два восстановителя (Na2S х 9Н20 - 0.3 г/л и Na2S2C 4- 0.05 г/л), раствор селенита натрия (1 мл/л) (Widdel, 1980) и микроэлементы (10 мл/л), приготовленные как указано выше. Посевной материал вносили в пробирки Хангейта со средой содержащей 150 г/л NaCl, бутират-Na (1 г/л) и газовую фазу Н2/С02 (80:20 об.%). Посевы инкубировали при температуре 37 С.
Для выделения чистой культуры, полученную накопительную культуру высевали в трубки Виньяля на плотную среду, содержащую - 110 г/л NaCI, бутират натрия - 1 г/л и 1.5 % агара «Дифко». Штамм 11 был выделен путем многократного пересева отдельных выросших в трубках колоний на жидкую среду в пробирки Хангейта и культивировался при температуре 37С. Проверку чистоты полученной культуры осуществляли визуальным наблюдением при микроскопировании препаратов живых клеток в световом микроскопе фирмы «Jenaval» с фазово-контрастным устройством, х 1000, а также высевом культуры на среды: А) предназначенную для выращивания ферментативных микроорганизмов, содержащую глюкозу, пептон и дрожжевой экстракт; Б) не содержащую органических субстратов и предназначенную для выращивания метаногенов, в пробирки со средой вводили Н2/С02 в качестве газовой фазы.
Дальнейшее культивирование чистой культуры осуществляли на среде, оптимизированной по содержанию NaCl (100 г/л), СаС12 X 2Н20 (1 г/л) и MgCl2 X 6Н20 (3 г/л). Для выяснения параметров температуры, рН, и солености, обеспечивающих рост штамма 11 использовали модифицированную среду, содержащую малат натрия и газовую фазу, представленную молекулярным азотом или аргоном.
При изучении метаболических особенностей роста исследуемых микроорганизмов использовали среды указанных выше составов, содержащие следующие субстраты: лактат, малат, пируват, фумарат, сукцинат, цитрат, формиат, ацетат, пропионат, бутират, валериат, кротонат, глицин, аланин, бетаин, дрожжевой экстракт, которые добавляли в среду из расчета 1 г/л; спирты (метанол, этанол, пропанол, бутанол, глицерин) - из расчета 1 мл/л; пальмитат вносили в среду в виде кальциевой солеи, приготовленных из жирных кислот (Widdel, 1980) в количестве 3 г/л.
Для проверки способности к хемолитоавтотрофному росту использовали основную минеральную среду без органического источника углерода с добавлением смеси газов Н2+С02 в соотношении 80:20 об. %. Рост микроорганизмов устанавливали по приросту сероводорода и увеличению оптической плотности в культуралыюй жидкости в трех последовательных пересевах.
При определении возможности восстановления сульфита, тиосульфата, элементной серы или нитрата в качестве акцепторов электронов использовали основные минеральные среды не содержащие сульфата, снабженные манатом натрия и соответствующим акцептором электронов.
Способность к сбраживанию органических субстратов определяли на основной минеральной среде, не содержащей сульфата, с добавлением соответствующих органических источников углерода. Развитие микроорганизмов устанавливали по образованию жирных кислот в культуральной жидкости, приросту Нг в газовой фазе и оптической плотности в культуральной жидкости.
Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры микроорганизмов на центрифуге К-70 при 5000 об./мин., 4С, в течение 30-50 минут. Клетки отмывали фосфатным буфером (рН 7.2) (Досон, Эллиот, 1991). Собранную биомассу осаждали на центрифуге марки Jouan (France) при 15000 об./мин, в течение 5 минут.
Морфологию клеток исследовали с помощью светового микроскопа «Jenaval» (Carl Zeiss, Германия), снабженного фазово-контрастным устройством, при увеличении 100x10. Размеры клеток определяли в логарифмической и экспоненциальной фазе роста культуры с помощью окулярно-виптового микрометра. При приготовлении препарата живых клеток для получения фото использовали предметные стекла с нанесенной пленкой 0.5% агара «Дифко».
Для подсчета живых клеток, в качестве фиксирующего агента также использовали 0.5% агар «Дифко». На предметное стекло наносили 0.02 мл клеточной суспензии и каплю агара. Смесь сразу накрывали покровным стеклом, площадью 2 см2 и оставляли подсыхать. Подсчет клеток производили в 20-ти полях зрения на всю глубину препарата. В таблицах указаны усредненные результаты.
Электронно-микроскопические методы.
С целью получения тотального препарата использовали биомассу живых бактерий и биомассу живых бактерий зафиксированных глутаровым альдегидом. В случае фиксации, перед центрифугированием добавляли 25% глутаровый альдегид до конечной концентрации 2%. Затем биомассу бактерий собирали центрифугированием при 15000 об./мин в течение 5 мин. Центрифугат в обоих случаях ресуспендировали в 0.2 М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением 2% NaCl для предотвращения отмирания клеток. Подготовленную биомассу помещали на микросетку и оставляли на 60-120 сек. для осаждения клеток. Затем подсушивали микросетку фильтровальной бумагой и оставляли препарат для полного высыхания на несколько часов. Препараты контрастировали окисью вольфрама.
Описание рода Desulfovermiculus gen. nov
Представителю рода Desulfovermiculus (De. sul. fo. ver. mic. ul. us. -de — приставка, sulfur - сера, vermis - червь, ul - уменьшительный суффикс, us - окончание. Сульфатредуцирующая червеобразная вибриоидная бактерия) свойственны следующие признаки: облигатный анаэроб с вибриоидной формой клеток и грамотрицательным типом клеточной стенки. Характерен дыхательный тип метаболизма на средах с сульфатами или другими окисленными соединениями серы. Хемоорганотроф: использует различные органические субстраты как источники углерода и доноры электронов для анаэробного дыхания, в том числе натриевые соли отдельных жирных кислот. Разлагает органические соединения полностью (до СОг) или с образованием ацетата в больших или меньших количествах, в зависимости от концентрации субстрата в среде. Факультативный хемолитоавтотроф: растет за счет Н2/СО2 или формиата в отсутствие других органических соединений. Сбраживает некоторые органические субстраты. Умеренный галофил, нейтрофил и мезофил. Десульфовиридин в клетках отсутствует, присутствует менахинон 7. Роду Desulfovermiculus принадлежит вид Desulfovermiculus halophilus, sp. nov
(hal.o phil.us: halophil- галофильный, солелюбивый, us- окончание) Неспорообразующие вибрионы размером - 0.5-0.6 х 1.0-10 мкм, подвижные на ранней стадии роста за счет одного полярно расположенного жгутика. При длительном культивировании на среде с лактатом клетки достигают размеров 15-20 мкм в длину и принимают червеобразную или спиралевидную форму. Окраска клеток по Граму отрицательная и строение клеточной стенки типично для грамотрицательных бактерий. Тип клеточного деления - перетяжка. Температурный интервал роста от 25 до 47С с оптимумом 37С. Растет в интервале рН от 6.4 до 8.2 с оптимальным значением 7.2. Проявляет высокую толерантность к содержанию NaCl и растет при содержании в средах от 30 до 230 г/л NaCl с оптимумом 80-100 г/л. Строгий анаэроб. Восстанавливает сульфаты с образованием сероводорода в средах с лактатом, манатом, фумаратом, пируватом, пропионатом, бутиратом, формиатом, Н2/СО2, кротонатом, сукцинатом, этанолом, аланином. Бутират разлагается полностью без накопления ацетата. В клетках, выращенных на бутирате, обнаружена высокая активность СО-дегидрогеназы, составившая 6.75 мкмоль мин мг /белка. Другие субстраты разлагает с большим или меньшим накоплением ацетата. В дополнительных факторах роста не нуждается, однако при добавлении к среде с пропионатом дрожжевого экстракта скорость роста увеличивается в 2.5 раза. Растет в хемолитоавтотрофных условиях за счет формиата и Н2/СО2 в присутствии сульфата; в газовой фазе с Н2/СО2 обнаружен «мини-метан». Не использует серии, глицин, бетаин, дрожжевой экстракт, глюкозу, фруктозу, цитрат, глицерин, бутанол, пропанол, метанол, бензоат, ацетат, валериат, пальмитат. В отсутствие сульфатов сбраживает пируват и фумарат. Акцепторами электронов, помимо сульфата, служат сульфит, тиосульфат, и элементная сера. Десульфовиридин в клетках не обнаруживается, присутствует менахинон МК-7. Содержание ГЦ в ДНК - 55.2 мол. %. Филогенетически принадлежит к 5-подклассу Proteobacteria. Образует обособленную ветвь в подкластере представителей семейства Desulfohalobiaceae. Уровень сходства последовательностей оснований 16 S рРНК с Desulfohalobium retbaense составляет 90.2 %. Типовой штамм 11т (ВКМ-В 2364). Выделен из высокоминерализованной пластовой воды нефтяного месторождения. Глава 6. Термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии
Морфология и субмикроскопическая организация клеток обоих штаммов была детально исследована ранее (Назина, Розанова, 1978; Назина, Пивоварова, 1979). Было показано, что бактерии представлены грам положительным и (окрашивание по Грамму отрицательное) палочками с закругленными концами, размеры клеток составляли 0.9-1.3 х 2-5 мкм (435) и 0.6-1.0 х 2-5 мкм (781). В молодых культурах оба штамма передвигались за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Овальные споры, имеющие 0.5-0.7 мкм в диаметре, располагались в клетке терминально или субстерминально, расширяя клетку. Часть клеток имела веретеновидную форму. На ультратонких срезах была четко видна Я грамположительная структура клеточной стенки. . Параметры роста Температурные параметры. Результаты исследований показали, что штамм 435 рос и продуцировал H2S в интервале температур от 45 до 75 С, а штамм 781 - от 45 до 70 С. Оптимальные значения для роста и дыхания обоих штаммов составили 60-65 С. (Рис. 14). "Г Параметры рН среды. Оба штамма росли и накапливали H2S в интервалах рН сред от 6.0 до 8.5. Наибольший прирост оптической плотности наблюдали при рН 7.0, а максимум продукции сероводорода был сдвинут в сторону более высоких значений рН - 8.0 (рис. 15). Аналогичный сдвиг оптимальных значений рН для накопления H2S наблюдали также авторы, исследовавшие D. sapomandens (Widdel, 1992). 1
