Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. НИТЧАТЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ
1Л .Таксономическая характеристика нитчатых бесцветных серобактерий
1.1.1 .Характеристика рода Beggiatoa
1.1.1. Метаболизм соединений углерода, серы, азота
1.1.2. Экология
1.1.3. Филогенетическое положение
1.2. Характеристика рода Thioploca
1.2Л. Таксономический состав
1.2.2. Метаболизм
1.2.3. Экология
1.2.4. Филогенетическое положение
1.3. Характеристика рода Thiothrix
1.3 Л. Метаболизм соединений углерода и серы
1.3.2. Экология
1.3.3. Таксономический состав и филогенетическое положение
1.4. Характеристика рода Leucothrix
1.4.1. Филогененетическое положение
1.4.2. Экология
ГЛАВА 2. ОДНОКЛЕТОЧНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ
СЕРОБАКТЕРИИ
2.1. Краткая характеристика одноклеточных бесцветных серобактерий
2.1.1. Характеристика рода Achromatium
2.1Л Л. Метаболизм
2.1 Л.2. Филогенетическое положение 22
2.1.2. Характеристика рода Thiomargarita 67
2.1.3. Характеристика рода Thiobacterium 6 8
2.1.4. Характеристика рода Thiovulum 69
2.1.5. Характеристика рода Macromonas 72
2.1.6. Характеристика рода Thiospira 75
2.1.7. Характеристика рода «Thiodendron» 16
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 83
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 89
ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Объекты исследования 89
3.2. Состав питательных сред для культивирования бактерий 89
3.3. Разработка техники микроаэробного культивирования 93
3.4. Методы изучения морфологии, ультрастуктуры и внутриклеточных включений 95
3.5. Получение клеточной суспензии, ферментных препаратов и мембранных фракций бактериальных клеток 95
3.6. Методы определения активности ферментов 97
3.6.1. Ферменты углеродного метаболизма 97
3.6.2. Определение активности ферментов, участвующих в превращениях восстановленных соединений серы 101
3.6.3. Определение активности ферментов, участвующих в синтезе и детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода 102
3.7. Очистка и изучение свойств МДГ ] 04
3.8. Физико-химические методы анализа 1
3.8.1. Радиоуглеродный метод 104
3.8.2. Методы определения растворенного кислорода 105
3.8.3. Определение хинонов 106
3.8.4. Анализ жирнокислотного состава 106
3.8.5 Анализ неорганических соединений серы 106
3.8.6. Метод определения концентрации внутриклеточной АТФ 107
3.8.7. Определение продуктов брожения 107
3.8.8. Определение Н202 108
3.8.9. Определение метаболитной антиокислительной активности 109
3.9. Методы молекулярной биологии 109
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 111
ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ 111
ГЛАВА 4. ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ 111
4.1. Филогенетическое положение штаммов серных спирилл 111
4.1.1. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК 113
4.1.2. Генотипические свойства 118
4.1.3. Состав жирных кислот и хинонов 120
4.2. Таксономическое положение некоторых бактерий рода Aquaspirillum и Spirillum 122
4.3. Филогенетическое положение штаммов Д-401 и Д-402 пресноводных Beggiatoa 134
4.3 Л. Генотипические свойства 134
4.3.2. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК 135
4.4. Филогенетическое положение бактерий рода Macromonus 138
II УГЛЕРОДНЫЙ И СЕРНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ 141
ГЛАВА 5. Л ИТОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ 142
5Л. Пресноводные нитчатые серобактерии Beggiatoa leptomitiformis Д-402 142
5.1.1. Механизм окисления восстановленных соединений серы 142
5.1.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай 142
5.1 Л .2. Активность ферментов серного метаболизма 144
5.1.1.3.Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ 145
5.1.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ 150
5.1.2. Углеродный метаболизм и пути его регуляции 152
5.1.2.1. Углеродного метаболизма при органотрофном и миксотрофном росте 152
5.1.2.2. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов 155
5.1.3. Регуляторная роль кислорода в метаболизме В, leptomitiformis штамм Д-402 160
5.1.3.1. Влияние концентрации кислорода в среде культивирования на урожай клеток и активность ферментов углеродного и серного метаболизма при миксотрофном росте 161
5.1.3.2. Условия литоавтотрофного роста В. leptomitiformis Д-402 163
5.1.3.3. Автотрофная фиксация С02 и активность ключевых ферментов цикла Кальвина 167
5.1.4. Структура электронтранспортных цепей в мембранах при различных типах питания и режимах аэрации культуры 170
5.2. Серобактерии рода Leucothrix 175
5.2.1.Механизм окисления соединений серы и углерода у Leucothrix thiophita и Leucothrix sp 176
5.2.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай 176
5.2.1.2. Изучение активности ферментов, участвующих в превращении соединений серы 178
5.2.1.3. Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ 179
5.2.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ 181
5.2.1.5. Изучение особенностей углеродного метаболизма 182
5.2.2. Изучение физиолого-биохимических процессов, связанных с окислением соединений серы Leucothrix mucor DSM 2157 188
5.2.2.1. Использование восстановленных серных соединений в энергетическом метаболизме L. тисог 188
5.2.2.2. Изучение активности ферментов серного метаболизма в клетках L. тисог 191
5.2.2.3. Взаимосвязь ферментативного окисления восстановленных серных соединений, состава ЭТЦ, окислительного и субстратного фосфорилирования 192
5.2.2.4. Связь окисления восстановленных соединений серы с синтезом АТФ 194
5.2.2.5. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в клетках L. тисог 197
5.2.2.6. Состав цитохромного участка ЭТЦ 200
5.3. Окислительный метаболизм соединений серы и углерода у серобактерий Thiothrix arctophila IN 205
5.3.1. Окислительный метаболизм соединений серы 205
5.3.2. Метаболизм соединений углерода 207
ГЛАВА 6. ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ 211
6.1. Окисление восстановленных соединений серы 211
6.1.1. Способность гетеротрофных серобактерий к окислению соединений серы и их влияние на рост бактерий 211
6.1.2. Влияние восстановленных соединений серы на синтез АТР
у гетеротрофных серобактерий 213
6.2. Окислительный стресс и механизм антиоксидантной защиты 216
6.2.1. Скорость образования HJOJ, концентрация и локализация 217
6.2.2. Особенности роста гетеротрофных серобактерий в условиях окислительного стресса 222
6.2.3. Системы зашиты клеток от кислорода 2
6.2.3.1. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода 226
6.2.3.2. Неферментативные способы защиты от токсичных форм кислорода 229 1
6.2.4. Механизм окисления соединений серы у гетеротрофных 236 серобактерий
6.2.5. Регуляция углеродного метаболизма 239
6.2.5.1. Особенности функционирования ЦТК 239
6.2.5.2.Потребность в анаплеротической последовательности 244
ГЛАВА 7. РОЛЬ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА АЭРОТОЛЕРАНТНЫХ СПИРОХЕТ - ОСНОВНОГО КОМПОНЕНТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СЕРНЫХ МАТОВ «THIODENDRON» 250
7.1. Влияние кислорода на рост и эффективность использования глюкозы 251
7.2. Образование НгОэ и окисление соединений серы 257
7.3. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода 259
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 264
ВЫВОДЫ 275
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 277
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют группу микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Представители бесцветных серобактерий широко распространены а водоемах разного типа- пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах. В природе серобактерии занимают уникальные экологические ниши - они существуют в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, где играют важную роль в окислении токсичных серных соединений органической и неорганической природы, предотвращая их поступление в вышележащие слои воды. Участвуя в окислении сульфида, они способствуют рециклизации процесса превращения соединений серы,в водоемах, что имеет большое значение для анаэробной минерализации в пресных водоемах.
Изучение серобактерий активизировалось в последнее десятилетие благодаря проведению широкомасштабных экологических исследований морских экосистем в районах гидротермальной активности, что значительно расширило представления о биологии серобактерий в галофильных сообществах. Установлено, что серобактерии, такие как Beggiatoa, Thiophca Thiomargarita, содержащие вакуоли, в которых накапливаются нитраты в высокой концентрации, и выполняющие роль терминального акцептора электронов, часто являются инициаторами существенной доли общей морской нитратредукции. В связи с этим бактерии этих родов оказались важным связующим звеном между циклами серы, азота и углерода.
Особый интерес представляют маты, в которых доминируют бесцветные серобактерии (Beggiatoa, Thioploca, «Thiodendron»), Бактериальные маты характеризуются высокой продуктивностью, широким распространением в водных экосистемах и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении и преобразовании соединений углерода, серы и азота.
Таксономический состав группы бесцветных серобактерий слабо изучен из-за трудности выделения и поддержания чистых культур. Большинство так называемых «морфологических видов», известных по наблюдениям за природными популяциями, не удалось выделить в чистую культуру. Применение современных методов молекулярной биологии показало, что представители бесцветных серобактерий относятся к различным таксономическим и филогенетическим группам. Филогенетическое положение для ряда представителей серобактерий до сих пор не определено из-за отсутствия чистых культур, хотя для некоторых серобактерий из природных популяций был проведен филогенетический анализ с применением флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) и анализа последовательности 16S рРНК.
Несмотря на пристальное внимание к этим микроорганизмам и их геохимической деятельности, количественных данных, отражающих роль бесцветных серобактерий в круговороте веществ в природе, недостаточно. Необходимо изучение метаболизма новых изолятов для понимания их функциональной роли в микробиальных сообществах. В настоящее время существует ограниченное количество доступных данных по метаболическому разнообразию бесцветных серобактерий. У подавляющего большинства серобактерий не известны пути метаболизма углерода и серы, не изучены механизмы регуляции метаболических путей в быстро меняющихся градиентных условиях.
Поскольку бесцветные серобактерии обитают в неравновесных условиях среды, то выявление факторов внешней среды, оказывающих воздействие на их ферментативные функции, является абсолютно необходимым и будет способствовать выявлению «уязвимых» мест в метаболизме клетки, а также позволит понять стратегию их биохимической адаптации к условиям внешней среды.
Большинство бесцветных серобактерий являются микроаэрофилами, чем и объясняется специфика их экониши и трудности с выделением чистых культур. Однако практически отсутствуют сведения о механизмах регуляции клеточного обмена веществ у бесцветных серобактерий при смене кислородного режима среды, также не изучены реакции стресс-лимитирующей антиоксидантнои системы бактерий на процессы образования активных форм кислорода (АФК).
Надо отметить, что в целом группа бесцветных серобактерий остается весьма мало изученной.
Состояние вопроси. Среди микроорганизмов, участвующих в окислении неорганических соединений серы,, особую группу составляют так называемые бесцветные серобактерии. Они включают представителей разных физиологических., таксономических и филогенетических групп. Единственным общим признаком;. объединяющим их, является способность откладывать внутриL- клеток : элементную серу.
Многие бесцветные серобактерии: с:давнего времени привлекают внимание исследователей благодаря І массовому развитию в природе в; определенных условиях, где они доминируют в отдельных сообществах, особенностям: физиологии, гигантским размерам;. своеобразной морфологии клеток. Достаточно вспомнить, что именно с изучением: бесцветных серобактерий Beggiatoa и Thiothrix в конце XIX века связано- создание G.H; Виноградским; концепции; хемолитоавтотрофии. Однако роль соединений серьь в метаболизме бесцветных: серобактерий до конца: не: ясна. Высказывается две точки зрения: восстановленные соединения серы могут выполнять роль доноров электронов для -энергетического метаболизма, а, также они могут участвовать в детоксикации-АФК.
Изучение таксономии, филогении: представителей зтойї группы: затруднено из-за сложности их, культивирования; хотя существенный? вклад: в изучение филогении некульти в ируемых на сегодня серобактерию позволили внести современные молекулярно-биологические и молекулярно-экологические методы при исследовании; природных сообществ. На основании морфологических признаков бесцветные серобактерии традиционно подразделяют на две группы — одноклеточные И нитчатые. Из известных по морфологическим описаниям более чем. 60 видов; в настоящее • время і удалось выделить, чистые культуры всего лишь несколько: видов: нитчатых и: одноклеточных: серобактерий: Детальное: физиологическое исследование выделенных штаммов показало; что представители этой1 группы существенно различаются І по типу энергетического! и І конструктивного метаболизма и по роли1 серных соединений в их жизнедеятельности.
На основании имеющихся данных предполагается возможность следующих путей использования неорганических соединении серы бесцветными серобактериями в процессах, не связанных с ассимиляцией в конструктивном обмене.
1. Использование восстановленных форм серы в качестве доноров электронов либо для фиксации углекислоты у хемолитоавтотрофов, либо для ассимиляции органических веществ при хемолитогетеротрофном росте. В физиологическом плане известные виды серобактерий изучены слабо. Такие бактерии, как Ahromatium, Thiovulum, Thioploca и Thiomargarita, не получены в чистых культурах. Однако исследования, проведенные с природными популяциями, показали способность этих организмов к литотрофному росту [112; 121; 170; 226; 315; 346; 364]. Удалось показать, что пресноводные бактерии рода Thiothrix [37; 150; 192; 214; 268] и морские штаммы Beggiatoa способны осуществлять наряду с орган о гетеротрофным, также лито гетеротрофный, миксотрофный и хемоавтотрофный метаболизм [151; 255; 256; 260]. Особенности метаболизма пресноводных представителей Beggiatoa изучены слабо. Для них не показана способность к литотрофному росту, хотя высказывается предположение о их способности к миксотрофному росту [151; 314].
Выявлена важная роль бесцветных серобактерий как хемолитоавтотрофных первичных продуцентов в сообществах гидротерм [150; 262]. В последнее время проблеме изучения функциональной роли бесцветных серобактерий в водных экосистемах уделяется значительное внимание. Было показано участие нитчатых серобактерий родов Thiothrix и Beggiatoa в продукции органического вещества за счет хемосинтеза в морских водоемах [1191. В районах проявления гидротермальной активности в океане установлено участие представителей рода Thiothrix во взаимодействиях с высшими звеньями трофической цепи, в частности, с креветками [62; 142], а также Beggiatoa - в продукции органического вещества в районах гидротермальной активности за счет хемосинтеза [106; 162; 212; 236; 254; 256].
Метаболизм таких одноклеточных серобактерий, как Macromonas, Thiovulum, Achromatium, Thiospira, Thiohacterium остается малоизученным. 2. Использование соединений серы для детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода,г Для всех выделенных к настоящему времени пресноводных штаммов Beggiatoa, включая типовой штамм В. alba, а также одноклеточных серобактерий - Macromonas bipitnctata,Thiospira spp. не удалось показать способность к использованию серных соединений в энергетическом метаболизме. В то же время для ряда представителей Thiothrix и Beggiatoa, а также для Macromonas bipunctata Thiospira spp. предполагается перекисный механизм окисления соединений серы [14; 15; 34; 37; 66; 95; 259; 263]: сероводород используется бактериями для удаления токсичного продукта метаболизма -пероксида водорода и супероксидного аниона, что сопровождается накоплением элементной серы в клетках. В связи с этим необходимы дополнительные исследования функциональной роли соединений серы.
Способность к автотрофному росту для многочисленных пресноводных штаммов Beggiatoa до сих пор не удалось доказать, несмотря на предпринимаемые исследователями попытки [ 151; 263].
3. Наряду с окислением восстановленных соединений серы, у Beggiatoa обнаружен обратный процесс редукция внутриклеточной серы до H?S. Имеются данные об использовании серобактериями соединений серы в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании [112; 162; 259; 263; 265]. Для некоторых серобактерий, содержащих вакуоль, в которой аккумулируются нитраты, показана способность к анаэробному дыханию и использованию последних в качестве терминального акцептора электронов.
Таким образом, можно заключить, что большинство серобактерий, в частности Beggiatoa, Thiothrix, TMoploca, Thiomargarita, Thiovulum, Achromatium обладают высокой физиологической приспособленностью к условиям среды и могут изменять характер метаболизма в зависимости от условий среды обитания. Знание ответных биохимических реакций бесцветных серобактерий на воздействие стрессорных факторов, возникающих в условиях их экотопов и способствующих функционированию или переживанию в гетерогенных условиях среды, позволит выявить механизмы устойчивости бесцветных серобактерий к существованию в неравновесных природных системах. Изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию серобактерий в неравновесных условиях среды, имеег теоретическое и практическое значение, так как позволяег приблизиться к пониманию механизмов функционирования микроорганизма, как целостной систехМЫ И благодаря этому создает условия, для понимания господствующего положения серобактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах серы, углерода, азота.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы явилась оценка; биоразнообразия: пресноводных представителей бесцветных серобактерий в отношении таксономического состава, метаболизма и путей его регуляции.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Определить таксономический состав и филогенетическое положение представителей пресноводных бесцветных серобактерий.
2. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы и механизмы их окисления в метаболизме различных представителей серобактерий.
3. Исследовать серный, углеродный метаболизм и биохимические механизмы их регуляции у различных представителей серобактерий,
4. Выявить специфические причины микроаэрофилии у различных физиологических групп бесцветных серобактерий: (миксотрофных, литоавтотрофных и облигатно гетеротрофных представителей)..
5. Определить роль кислорода в регуляции; метаболизма аэротолерантных спирохет - основного компонента бактериальных серных матов «Thiodendron».
Научная новизна и значимость работы
Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий. Показано, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательности 16S рРНК позволил отнести все изученные пресноводные серобактерии к альфа-, бета-, гамма - классам филума Proteobacteria. Изучен таксономический состав и филогенетическое положение серных спирилл, а также пресноводных штаммов Beggiatoa, Macromonas. Согласно опубликованным ранее данным [76; 125; 334] и полученным нами результатам на основе изучения штаммов серных спирилл была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum. Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum вид A. hipunctata sp. nov. вместе с типовым и единственным видом A. serpens, который, согласно филогенетическому анализу, группируется с A. hipunctata.
Бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер, включающий виды [Aquaspirillum] voronezhense, [Aquaspirillum] kuznetsovii, [Aquaspirillum] giesbergeri, [Aquaspirillum] sinuosum, [Aquaspirillum] anulus, предложено классифицировать как представителей нового рода Giesbergeria gen.nov. - Giesbergeria voronezhense sp. nov. (типовой вид), Giesbergeria kuznetsovii sp. nov., Giesbergeria giesbergeri comb, nov., Giesbergeria sinuosa comb, nov., Giesbergeria anula comb, nov., соответственно; бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophillum - как SimpUspira metamorpha comb.nov. (типовой вид) и SimpUspira psychrophilla comb.no v., соответственно; бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер подвидов [Aquaspirillum] itersonii: [Aquaspirillum] itersonii subsp. itersonii, [Aquaspirillum] itersonii subsp. niponicum - как Denitrospira itersonii comb, nov.: Denitrospira itersonii subsp. itersonii comb, nov., Denitrospira itersonii subsp. niponicum comb, nov., соответственно.
Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S. volutans\ в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum: Spirillum winogradskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.
Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S° внутриоеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, SimpUspira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria {Denitrospira). Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода Thiospira.
На базе уникальной коллекции бесцветных серобактерий, которая представлена бактериями, выделенными нами (19 штаммов) и любезно предоставленными коллегами: из коллекци уникальных микроорганизмов ИНМИ РАН (Россия), DSMZ (Германия), CIP (Франция) (18 штаммов) было показано, что бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются но функциональной роли и механизму окисления восстановленных соединений серы: литотрофные серобактерии используют восстановленные соединения серы в качестве: энергетического субстрата, а облигатные органотрофы используют соединения серы для снятия токсического эффекта, оказываемого продуктами неполного восстановления кислорода, на их метаболизм. Было выявлено, что у гетеротрофных бесцветных серобактерий в ответ на образование АФК возникает консолидированный адаптивный; ответ, включающий увеличение активности антиоксидантных ферментов, метабол итной антиокислительной активности, индукцию анаплеротических последовательностей, а также синтез экзополисахаридов (ЭПС).
Выявлено, что у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий: регуляция; метаболизма может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими: донорами электронов). При этом-может меняться метаболическая активность, а также тип питания. Впервые показано, что регуляция и переключение метаболических функций у некоторых факультативных лито гетеротрофных серобактерий может осуществляться за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, перераспределения потока восстановительных: эквивалентов и изменения состава электрон гранспор гной цепи (ЭТЦ),
Расширены представления о причинах микроаэрофилии и аэротолерантности бактерий. Установлено, что приуроченность к росту в микроаэробных условиях может быть обусловлена чувствительностью ферментов углеродного и серного диссимиляционного окислительного метаболизма к концентрации кислорода, АФК, а также потребностью факультативно лнтогетеротрофньгх серобактерий в дополнительных донорах электронов по причине низкой активности дегидрогеиаз, поставляющих восстановительные эквиваленты в ЭТЦ.
Аэротолерантность спирохет из симбиотической ассоциации «Thiodenclron», осуществляющих анаэробный тип метаболизма, обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. Практическая значимость
Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии бесцветных серобактерий и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах, в продукционных и деструкционных процессах и вкладе в круговорот углерода и серы в природе.
Создана уникальная коллекция новых бесцветных серобактерий, некоторые из которых можно использовать для очистки водных экосистем от токсичных соединений серы.
Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
1. Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды», Томск, 1995.
2. Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, МГУ, 2000.
3. Научной конференции «Водные экосистемы и организмы», Москва,
МГУЛ001.
4. Is1 FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.
5. Ш съезде биофизиков России, Воронеж, 2004.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение экспериментов с обсуждением и заключением, общее заключение), основных выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 307 страницах, содержит 74 таблицы и 62 рисунка, а также 30 страниц приложения. Список цитируемой литературы включает 366 работ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы: 35 экспериментальных статей, 8 тезисов. Место проведения работы
В основном работа проведена на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета и в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН при участии д.б.н. Дубининой Г.А., а также при участии студентов, аспирантов. Ряд совместных работ выполнены совместно с к.б.н. Мунтян М.С. (Институт физико-химической биологии им. Белозерского), к.б.н. Гавриш Е.Ю. (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН), проф. Рейни Ф. (Немецкая Коллекция Микроорганизмов (DSMZ), Брауншвейг, Германия), к.б.н. Лысенко А.М., к.б.н. Черных Н.А. и к.б.н. Туровой Т.П. (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН), д.б.н. Осиновым Г.А. (Академическая группа Академика РАМН Ю.Ф.Исакова).
Исследования, представленные в данной работе были финансированы грантами Госкомвуза России (94-10.7-117, 96-0-10.0-64), грантами Российского фонда фундаментальных исследований (94-04-11956; 96-04-48518; 96-04-64100к; 99-04-48686; 99-04-63022к; 00-04-63043к; 01-04-63022к; 02-04-49 Ї 85; 02-04-63078к; 03-04-63040к; 04-04-63081 к).
Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим участие на разных этапах работы.
Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.б.н. проф. Дубининой Г.А. за содействие в работе и помощь при обсуждении результатов. Основные положения, выносимые на зашиту
1. В филогенетическом отношении пресноводные бесцветные серобактерии гетерогенны по составу и относятся к альфа-, бета-, гамма - классам филума Proteobacteria,
2. На основе молекулярно-генетических исследований проведена ревизия представителей рода Aquaspirillum, к которому ранее были отнесены все штаммы серных спирилл.
3. Бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме.
4. Представители бесцветных серобактерий обладают широким спектром биохимических адаптационных механизмов, позволяющих им выживать и доминировать в нестабильных условиях кислородного режима в природных средах.
5. Микроаэрофилия бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма.
6. Аэротолерантность анаэробных спирохет обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы.
