Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности местообитания и видовой состав группы умеренно-термофильных ацидофилов 6
ГЛАВА 2. Характеристика бактерий рода Sulfobacillus 9
2.1 Видовое разнообразие представителей рода Sulfobacillus 9
2.2 Филогенетическое положение рода Sulfobacillus 10
2.3 Морфологическая характеристика сульфобацилл 13
2.4. Образование эндоспор 18
2.5 Физиологические свойства 19
2.6 Метаболизм 24
2.6.1. Приспособление к низким значениям рН среды 24
2.6.2. Окисление/восстановление железа 26
2.б,З.Метаболизм углерода 29
2.6.3.1. Пути автотрофной фиксации СОз 30
2.6.3.2 Миксотрофия и ее распространение 33
2.6.3.3. Метаболизм глюкозы 40
2.6.3.4. Цикл трикарбоновых кислот и анаплеротические реакции 42
2.6.4. Окисление серы 46
ГЛАВА 3. Нахождение в природе и практическое применение сульфобацилл 56
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 63
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 63
4.1. Объекты исследования и условия их культивирования 63
4.2. Методы анализов , 66
4.2.1. Определение железа 66
4.2.2. Определение глюкозы 67
4.2.3. Летучие жирные кислоты и этанол 67
4.3. Ассимиляция клетками штамма К1 меченной углекислоты 68
4.4. Определение активности ферментов 69
4.4.1. Определение карбоксилирующих ферментов 69
4.4.2. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта 71
4.4.3. Определение активности ферментов углеводного метаболизма 74
4.4.4. Ферменты серного метаболизма 78
4.4.5. Определение белка 82
4.4.6. Математическая обработка результатов . 83
ГЛАВА 5. CLASS Результат CLASS ы 84
5.1. Рост сульфобацилл в разных условиях. 84
5.1.1. S.thermosulftdooxidans, штамм41 ...84
5.1.2. S.sibiricusmJ 92
5.1.3. "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotoierans "штшм Kl 94
5.2. Морфология сульфобацилл 99
5.3. Фиксация мС-бикарбоната суспензиями клеток "S,thermosulfidooxidam subsp thermotoierans " штамм Kl ПО
5.4. Активность ферментов углеродного метаболизма 114
5.4.1. S-thermosulfidooxidans штамм 41 114
5.4.2. S.sibiricus штамм N1T 126
5.4.3. "SJhermosulfidooxidans subsp. thermotoierans "штамм Kl 130
5.5. Активность ферментов, участвующих в метаболизме серы у SLthermosuljidooxidans subsp. asporogenes 41 136
Обсуждение 139
Выводы 154
Список литературы 155
- Морфологическая характеристика сульфобацилл
- Летучие жирные кислоты и этанол
- S.thermosulftdooxidans, штамм41
- Активность ферментов, участвующих в метаболизме серы у SLthermosuljidooxidans subsp. asporogenes 41
Введение к работе
Сульфобациллы представляют собой уникальную малоизученную группу умеренно-термофильных спорообразующих ацидофильных бактерий, широко распространеньгх в зонах спонтанного разогрева руд. Они используют в качестве источников энергии Fe2+, S27S, сульфидные минералы и органические вещества, которые наряду с углекислотой также ассимилируются как источник углерода. При исследовании этой группы бактерий основное внимание уделялось роли сульфобацилл в переработке сложных руд и концентратов, систематическому положению и распространению в различных биотопах. В то же время отмечалось, что штаммы грамположительных умеренно-термофильных бактерий, выделенных в лаборатории хемолитотрофных организмов ИнМи РАН, различаются по морфологическим свойствам, способности окислять неорганические субстраты и некоторым другим характеристикам. Однако особенности углеродного и серного метаболизма сульфобацилл, позволяющие оценить их вклад в процессы окисления Fe34, S27S, сульфидных минералов в естественных и техногенных местообитаниях, практически не изучены.
Микроорганизмы, получающие энергию при окисленин восстановленных соединений серы, выделены и описаны еще в конце XIX века. Отправной точкой для их изучения явились исследования СН.Виноградским бактерий из рода Beggiatoa, окисляющих сероводород с накоплением в клетках серы. Первый микроорганизм, окисляющий закисное железо, был выделен и описан позднее, в 1947 г (Colmer, Hinkle). Первоначально хемолитотрофия обязательно связывалась с автотрофией, и термин Виноградского "аноргоксидация" подразумевал не только жесткую связь получения энергии при окислении неорганических веществ и синтеза материала клетки исключительно из диоксида углерода, но и токсичность органических соединений. Однако было обнаружено, что метаболическая гибкость является основой успешного роста и выживания у довольно большого числа организмов.
В физиологической группе экстремально ацидофильных умеренно термофильных железо-/сероокислителей представители рода Sulfobacillus на момент описания (Головачева, Каравайко, 1978) были единственными грамположительными спорообразующими представителями. Другой характерной чертой этих бактерий явилось то, что в отличие от
микробов с однозначно определяемым типом питания, они способны расти как автотрофы, за счет фиксации углекислоты, так и как гетеротрофы, используя органические вещества как источники углерода и энергии. Однако в обоих случаях рост бактерий продолжается ограниченное число пересевов. Стабильное развитие культур сульфобацилл возможно только в миксотрофных условиях, когда в качестве источника энергии используется элементная сера, восстановленные соединения серы, закисное железо, сульфидные минералы, а источником углерода служат некоторые органические соединения и углекислота. В связи с этим, для выяснения возможных причин отсутствия стабильного роста данных организмов в авто- и гетеротрофных условиях представляло интерес изучение у представителей рода SulfobaciUus как ферментных систем, отвечающих за рост в автотрофных условиях, так и путей использования органического вещества.
Целью настоящей работы было изучение в различных условиях культивирования особенностей роста и ферментов углеродного и серного метаболизма бактерий рода Sulfobacillust отличающихся по ряду признаков от ранее изученных представителей сульфобацилл.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
Изучить особенности роста S-thermosulfidooxidans sxfosp.asporogenes штамм 41, S.sibiricus штамм N1 и "SJhermosulfidooxidans subsp. thermotolerans" штамм К1 в различных условиях культивирования.
Провести определение в бесклеточных экстрактах культур штаммов 41, N1 и К1 активностей различных ферментов, участвующих в метаболизме углерода: карбоксилаз, ферментов цикла трикарбоновых кислот и ферментов метаболизма углеводов.
Выявить закономерности изменения активностей ферментов в зависимости от состава среды культивирования у трех изученных штаммов.
Выяснить особенности метаболизма соединений серы в клетках штамма 41.
На основе молекулярно-биологических данных и изучения особенностей роста и активности ферментов углеродного метаболизма уточнить систематическое положение "S.thermosulfidooxidans, subsp. thermotolerans" штамм Kl.
Морфологическая характеристика сульфобацилл
Представители рода SulfobacUlns являются грамположительными эубактериями. Морфология изученных видов представлена в табл. 2. S. thermosulfidooxidans штамм 1269 на плотных средах с Fe2+ образует округлые блестящие колонии, изменяющие цвет от светло-желтого до красно-коричневого и инкрустированные гидратом окиси железа (Головачева, Каравайко, 1978).
При культивировании бактерии S.thermosulfidooxidans 1269 на жидких средах с сульфидными минералами и элементной серой среда подкисляется и мутнеет, вследствие окисления энергетического субстрата. На среде с закисным железом наблюдается интенсивное побурение из-за образования окисного железа (Головачева, Каравайко, 1978; Головачева, 1984).
S.thermosulfidoaxidarts довольно подробно изучен в плане морфологии. Клетки палочковидные, неподвижные, размножаются бинарным делением, образуют эндоспоры (Головачева, 1984). Вегетативные клетки представляют собой палочки с округлыми или заостренными концами, размером 0,6-0,8 х 1,0-3,0 мкм (Головачева, Каравайко, 1978). Размер клеток S.thermosulfidooxidans зависит от условий роста: они увеличиваются от 0,6 х 2,0-3,5 мкм во время автотрофного роста в присутствии Fe2+ до 0,8-1,8 х 3,0-6,5 мкм при росте с закисным железом с добавлением дрожжевого экстракта или с дрожжевым экстрактом как единственным субстратом (Norris et al., 1996).
Деление клеток бинарное равномерное или неравномерное. Последнее приводит к формированию кокковидных или нитевидных форм (Karavajko et al., 1988). Разделение клеток может происходить путем разлома материнской клетки по сформированной перегородке. Если разломы неполные, то формируются сложные клеточные агрегаты в виде палисадов, изогнутых цепей, колец и V-образных форм (Головачева, 1979 в)
При культивировании SJhermosulfidoaxidans 1269 в автотрофных условиях, когда в качестве источника энергии использовались различные сульфидные минералы, значительная часть клеток была прикреплена к поверхности кристаллов. Возможно, прикрепление осуществляется с помощью отростков кистевидного или ризоидного типа диаметром около 18 нм, а таже посредством обильного формирования слизи (Головачева, 1979 а).
Клеточная стенка S.thermosulfidooxidans 1269 выглядит как двухслойная структура толщиной в среднем 40-45 нм. Примыкающий к цитоплазматической мембране электронно-плотный слой (20 нм) соответствует муреиновому слою (Головачева, 1979 б). Внешний структурированный слой может быть определен как гликопротеиновый или S-слой. В составе белков данной структуры преобладают дикарбоновые и оксиаминокислоты, по сравнению с мезофильными бактериями увеличено содержание гидрофобных аминокислот (Северина и др., 1995). Снаружи от S-слоя лежит капсульный полисахаридный материал. Количество образующегося полисахарида зависит от состава среды и максимально в гетеротрофных условиях (Сенюшкин и др., 1997). Организация S-слоя не меняется в зависимости от условий культивирования (Северина и др., 1998). Цитоплазматическая мембрана имеет толщину 7 нм. На ультратонких срезах наблюдается система внутриклеточных мембран, В случае образования септы формируется структура типа мезосомы. Для молодых клеток характерно наличие электронно-плотных, сферических гранул диаметром 240-260 нм, расположенных по одной в полярных районах клетки и содержащих полифосфаты. Карбоксисомы отсутствуют (Головачева, 1984; Karavajko et al., 1988). В активно растущих клетках внутри гидрофобной зоны ЦПМ обнаруживаются внутримембранные структуры, организованые в виде пластин или «листков», проявляющие свойства, характерные для инвертируемых мембран (Duda et. al., 2001).
Морфология представителей двух подвидов вида SJhermosulfidooxidans в общих чертах сходна с морфологией типового штамма (табл. 2).
"S,thermosulfidooxidans subsp, thermotoleram" штамм К1 на твердой среде, содержащей Fe2+, образует точечные бесцветные колонии, с ровным краем, пастообразной консистенции; середина колоний ярко-оранжевая, состоящая из тонкой корки оксида железа (III). Клетки представителей термотолерантного подвида имеют форму правильных палочек размером 0,9-1,0 х 3,0-6,0 мкм, одиночных, в парах или коротких цепочках. Они проявляют тенденцию к полиморфизму, и при повышенных температурах (50-55 С) в культуре появляются гигантские длинные нити. Деление клеток бинарное, с помощью септы (Коваленко, Малахова, 1983; Karavajko et al., 1988; Богданова и др., 1990).
S.thermosulfidooxidam subsp. asporopenes штамм 41 на плотной среде с Fe2+ образует бурые колонии диаметром 0,2-0,5 мм, инкрустированные гидратом окиси железа. Клетки этой сульфобациллы на средах с закисным железом, элементной серой или сульфидными минералами в экспоненциальной фазе представляют собой неподвижные палочки с округлыми концами размером 0,5-0,9 х 2,0-4,0 мкм. Молодые клетки делятся бинарно, нитевидные формы подвергаются множественному делению (Вартанян и др., 1988; Вартанян, 1989). Как и типовой вид, клетки аспорогенного штамма окружены S-слоем и полисахаридной капсулой (Сенюшкин и др., 1997).
S.acidophilus штамм ALV при автотрофном росте с элементной серой или при гетеротрофном росте с дрожжевым экстрактом формирует клетки, представляющие собой правильные палочки. При окислении бактериями закисного железа наблюдаются цепочки изогнутых клеток. Размер клеток варьирует в пределах 0,5-0,8 х 3,0-5,0 мкм. У этого штамма отмечается тенденция к образованию нитевидных форм (Norris et al., 1996).
S. disulfidooxickms штамм SD-11 не способен расти в чистой культуре на твердых средах. В жидкой среде при росте с серой бактерии образуют палочковидные клетки, одиночные или в парах. На среде с окисленным глутатионом появляются нитевидные формы (Dufresne et al., 1996).
Летучие жирные кислоты и этанол
Содержание глюкозы в среде определяли антроновым или фенольным методом.
Антроновый метод (Ashwell, 1957). К 1 мл пробы прибавляли 5 мл антронового реагента, для приготовления которого 200 мг антрона растворяли в 100 мл концентрированной H2SO4. Пробирку помещали на 6 мин в кипящую водяную баню, охлаждали до комнатной температуры в холодной воде и определяли оптическую плотность раствора при 625 нм при длине оптического пути 1 см. Содержание глюкозы определяли по калибровочной кривой.
Фенольный метод (Хансон, Филлипс, 1984). Для приготовления реагента 5 г фенола растворяли в 100 мл дистиллированной воды. Перед определением исходную пробу разводили в 2 раза 0,05 М NaOH и освобождались от соединений железа центрифугированием. К 1 мл пробы прибавляли 1 мл фенольного реактива и 5 мл концентрированной H2SO4. Тщательно перемешав, оставляли пробирки на 10 мин при комнатной температуре, затем помещали на водяную баню с температурой 25С и определяли оптическую плотность раствора при 488 нм при длине оптического пути 1 см. Содержание глюкозы определяли по калибровочной кривой.
Для определения продуктов метаболизма органических субстратов использовали культуру, находящуюся в середине стационарной фазы роста. Культуральную жидкость объёмом 3-4 л подщелачивали твердым NaOH до значения рН 8,0, освобождались центрифугированием от нерастворимых гидроксидов железа и упаривали при комнатной температуре под вытяжным шкафом до возможно меньшего объёма, равного нескольким миллилитрам. Полученную пробу подкисляли 10 N H2SO4 до рН=2 и анализировали с помощью газо-жидкостной хроматографии на приборе «Газ-хром 3700», колонка «Sovpol» -1,5 м; температура колонки 190С; газ-носитель - аргон; детектор пламенно-ионизационный.
43. Ассимиляция клетками штамма К1 меченой углекислоты.
Клетки из экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста концентрировали, центрифугируя культуру при lOOOOg 40 мин. Осадок ресуспендировали в среде, не содержащей источника энергии, и освобождались от нерастворимых соединений железа, осаждая последние при 2000g в течение 1-2 мин. Затем клетки ресуспендировали в 10 мл среды, не содержащей источника энергии. Опыты по ассимиляции углекислоты проводили в герметически закрытых флаконах объёмом 100 мл. Фиксацию 1 СОг изучали в авто-, миксо-и гетеротрофных условиях. Контролем служил вариант, где клеточная суспензия была внесена в среду, не содержащую источников энергии и органического углерода. Объём жидкости в сосуде составлял 20 мл, соотношения компонентов сред, применявшихся в опытах, были аналогичны средам, используемым для культивирования бактерий, за исключением варианта с тиосульфатом, когда данный субстрат был добавлен в количестве 10 мкмолъ к солевому фону. В качестве неорганического окисляемого субстрата использовали Fe2+ (FeSOWbkO) или S. Последними во флаконы, закрытые резиновыми пробками с помощью шприца и иглы вносили 50 мкл раствора NaHI4COj исходной концентрации 0,06 мкКи/мкл в 1 мл (1%) раствора немеченого бикарбоната. Для того чтобы значение рН соответствовало оптимуму роста культуры, равному 2,5-2,7, его устанавливали заново в каждом опыте, эмпирически находя соотношение количеств растворов кислоты и щелочи, которых необходимо прибавить к каждому варианту среды. Для этого к 20 мл среды, содержащей все компоненты, добавляли используемый в основном опыте раствор немеченого бикарбоната и фиксировали объемы растворов 10 N H2SO4 и 5% №НСОз, необходимые для поддержания рН на соответствующем уровне в герметично закрытом сосуде. Температура инкубации в разных экспериментах составляла 25, 28, 37С. Через промежутки времени, равные 3-4 часа, отбирали по 1 мл суспензии, фиксировали 1 мл 4н HCI. Полученный объём смеси в 2 мл фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры (Сынпор №6).
Определение радиоактивности препаратов. Радиоактивность препаратов определяли, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик импульсов «LKB RacBeta 1127». Фильтры, на которые были нанесены пробы, содержащие радиоактивно меченые 14С-вещества, высушивали на воздухе, помешали в специальные флаконы и заливали 6 мл сцинтиллятора ЖС-107 или ЖС-106.
Клетки собирали центрифугированием при 10000g в течение 40 мин, промывали средой, не содержащей источника энергии, ресуспендировали в 0,1 М трис-HCl буфере, рН 7,4. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе «УЗДН 1» при 22 кГц, в течение 5-7 мин с перерывами по 1 мин при охлаждении. Полученный гомогенат центрифугировали 20-30 мин, при 40000g. Супернатант использовали для определения активности ферментов.
Определение карбоксили рующих ферментов {Романова, 1980; Ivanovsky, 1999). РБФК/О, ФЕПК, ФЕПКТФ, ФЕПКК, пируваткарбоксилазу определяли радиоизотопныи методом. Активность ферментов оценивали по скорости фиксации радиоактивного углерода из иС-бикарбоната экстрактами клеток. Активность ферментов выражали количеством наномолей СОг, фиксированного за минуту в пересчете на 1 мг белка. Реакции проводили при температуре 45-47С. Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа. (КФ 4,1,1.39, З-фосфо-D-глицераткарбокси-лиаза (димеризующая)): Рибулозо-1,5-бисфосфат+ ССЬ— 2 3-фосфоглицерат Реакционная смесь содержала: трис-НС1 буфер, рН 7,4 - 20 мкмоль; MgCh 6H20 - 2,5 мкмоль; дитиотреитол- 1 мкмоль; NaHCOj - 5 мкмоль; NaHl4COj -2,4 мкКи; экстракт- 0,2 0,5 мг белка. Конечный объем смеси 0,3 мл. Реакционную смесь прединкубировали 10 мин. Реакцию начинали добавлением 0,15 мкмоль рибулозо-1,5-бисфосфата. В контроле рибулозо-1,5-бисфосфат не содержался. Через 15с, 30с, 60с, 120с, 180с отбирали пробы по 0,05 мл, которые фиксировали 0,05 мл 4 N НС1. Полученную смесь (0,1 мл) наносили на бумажные диски; их высушивали и определяли радиоактивность, как описано выше. Фосфоенолпируват-карбоксилаза. (КФ 4.1.1.31, ортофосфат: оксалоацетат карбокси-лиаза (фосфорилирующая)): 2-фосфоенолпируват + НСОз" — оксалоацетат + Фа Реакционная смесь содержала: трис-НС1 буфер, рН 7,4 - 20 мкмоль; MgCh 6H20 - 2,5 мкмоль; МпСІ2«4РІ20 - 1 мкмоль; глутатион восстановленный - 12,5 мкмоль; глутарат Na -1,25 мкмоль; НАДН - 0,75 мкмоль; NaHCOj - 5 мкмоль; NaH14C03 - 1,2 мкКи; экстракт — 0,4-1,2 мг белка. Конечный объем смеси - 0,65 мл. Реакционную смесь прединкубировали 15 мин. Реакцию начинали добавлением 2,5 мкмоль фосфоенолпирувата. Контроль фосфоенолпирувата не содержал. Отобранные через 5мин, 15мин, 25мин, 35мин, 45мин пробы объёмом 0,02мл наносили на бумажные диски и фиксировались 0,02мл насыщенного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 4 N НС1. Диски высушивали и определяли радиоактивность, как описано выше.
S.thermosulftdooxidans, штамм41
Миксотрофные условия оптимальны для роста S,thermosulfidooxidans штамм 41 в случае, когда среда содержит 0,02% дрожжевого экстракта и 3-5 г/л закисного железа. Данная бактерия также способна расти в авто- и гетеротрофных условиях, однако, при этом культура выдерживала только ограниченное число пересевов. Миксотрофные условия использовались для выращивания посевного материала для всех вариантов опытов. При культивировании штамма 41 в колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды, в статических миксотрофных условиях через 60-70 ч культура достигала стационарной фазы роста (рис.3). Максимальная концентрация клеток была равна 4-5x10 кл/мл, время генерации составляло 30 ч, немного увеличивалось значение рН — от 1,7 до 2,0. Лаг-фаза не наблюдалась, Fe окислялось со скоростью 0,04 г/л/ч, при этом в среде оставалось к 100-120 ч культивирования до 15% закисного железа (рис. 3). При росте бактерии на среде того же состава в условиях интенсивной аэрации (1 объем воздуха/1 объем среды в 1 мин) время генерации было равно 4 ч, стационарная фаза наступала к 22-25 ч выращивания, и клетки достигали максимальной концентрации 5,0 - 5,5 х107 кл/мл (рис. 4). При этом также не наблюдалась лаг-фаза, железо окислялось с максимальной скоростью 0,2 г/л/ч в период экспоненциального роста культуры.
Менее интенсивный рост бактерии в условиях интенсивной аэрации наблюдался, если в среду вносили не дрожжевой экстракт, а 0,02-0,05%, (1-3 мМ), глюкозы (рис. 5). В этом случае активному росту клеток предшествовала лаг-фаза длительностью 20-25 ч, в течение которой параметры роста сульфобацилл практически не изменялись. Потреблялось около 10% глюкозы, железо окислялось со скоростью 0,02 г/л/ч. Во время экспоненциальной фазы культура росла со временем генерации 17 ч, железо окислялось со скоростью 0,1 г/л/ч. К началу стационарной фазы роста к 55-60 ч культивирования концентрация клеток составляла 2,0 — 2,клеток; 2- концентрация Fe2 . При замене закисного железа, как источника энергии, на элементную серу в первом пассаже в миксотрофных условиях с 0,02% дрожжевого экстракта при аэрации методом интенсивного качания культура в экспоненциальной фазе росла со временем генерации 4 ч (рис.6). Максимальная концентрация клеток, равная 5,0 - 5,5 х107 кл/мл, была достигнута через 25-30 ч после начала культивирования. Лаг-фаза не наблюдалась, значение рН среды плавно изменялось от 2,1 - 2,2 в начальной точке после инокуляции до 1,8 - 1,7 к концу процесса выращивания бактерий (рис. 6). Во втором пересеве на среду с элементной серой и 0,02% дрожжевого экстракта значение времени генерации не менялось, но концентрация клеток начинала увеличиваться только спустя 15-18 ч после начала культивирования (рис. 7). Достигнутая через 32-35 ч концентрация клеток составляла 2,5-3,0 хЮ7 кл/мл. Значение рН изменялось на протяжении лаг-фазы незначительно и начинало понижаться одновременно с переходом культуры к фазе экспоненциального роста - от исходного 2,05-2,15 до конечного 1,6-1,5 (рис. 7).
При культивировании штамма 41 в миксотрофных условиях на среде с элементной серой при интенсивном качании, когда источником углерода являлась глюкоза (0,05%), наблюдался медленный рост культуры со временем генерации 11,5 ч (рис.8). Концентрация клеток начинала увеличиваться после 15-18 часовой лаг-фазы и достигала максимума 0,5 — 0,7 хЮ7 кл/мл к 50 - 60 ч выращивания. Значение рН медленно изменялось от 2,05 - 2,15 до 1,9 - 1,8. Потребление глюкозы происходило в фазу экспоненциального роста, по окончании культивирования — через 70-80 ч в среде оставалось 60-65% (0,72 - 0,84 мМ) от ее исходного количества (рис. 8).
В условиях с затруднённым доступом кислорода — при культивировании в бутыли объёмом 5 л с 4 л среды без аэрации, S.thermosuifidooxidans штамм 41 способен медленно расти в миксотрофных условиях, окисляя железо и ассимилируя глюкозу (рис.9). При этом лаг-фаза была очень длительной, и в течение 50-80 ч не происходило каких-либо заметных изменений соотношения компонентов среды и увеличения концентрации клеток. В экспоненциальной фазе минимальное время удвоения бактериальной массы составило 46 ч, максимальная скорость окисления Fe2+ — 0,009 r/л/ч, а максимальная концентрация клеток, равная 0,8-0,9x107кл/мл, была достигнута к 210-240 ч (рис. 9). По окончании роста бактерий к 270-300 ч в среде оставалось 50% закисного железа и 60% глюкозы от 10 20 ЗО 40
мМ. 20 начального содержания этих субстратов. При этом в среде обнаруживались промежуточные продукты неполного окисления глюкозы: ацетат в концентрации 0,001-0,01 мМ и следовые количества пропионата.
Таким образом, очевидно, что условия аэрации определяют скорости роста и окисления минерального субстрата культурой S.thermosulfidooxidans штамм 41. Так, в статических условиях культура растет в 7-8 раз медленнее, чем при активной аэрации, а при ограничении доступа кислорода в среду время генерации увеличивается в 11-12 раз по сравнению с минимальным -4 ч. Замена дрожжевого экстракта на глюкозу также снижает скорость окисления железа в 2 раза, а время генерации увеличивается в 3-4 раза.
В автотрофных условиях S.thermosulfidooxidans штамм 41 способен к росту на среде с закисным железом при интенсивной аэрации только в течение 1-2 пересевов (рис.10). Бактерии росли в таких условиях медленнее, чем в миксотрофных, а максимальная концентрация клеток была ниже. Окисление Fe2+ со скоростью 0,05 г/л/ч и увеличение концентрации бактерий начинались после суточной лаг-фазы. Время генерации составляло 16 ч. Концентрация клеток в конце экспоненциальной фазы роста к 48 часам достигала 1,4-1,5 xl О7 кл/мл, при этом было окислено около 80% закисного железа. Значение рН среды увеличивалось от 1,8 до 2,2 (рис. 10).
При выращивании клеток в автотрофных условиях с принудительной аэрацией и при увеличении содержания ССЬ в газовой фазе до 5-10% (7V) (рис. 11), культура не теряла способности к активному росту в течение трех пассажей. По сравнению с культивированием в обычных автотрофных условиях без принудительного обогащения воздуха углекислотой, когда содержание СО соответствовало атмосферному и составляло 0,03% в газовой фазе, лаг-фаза была менее длительной и увеличение количества клеток, а также окисление Fe2+, происходило после 15-18 ч культивирования бактерий. В конце экспоненциальной фазы роста - к 25-30 ч выращивания, клетки S.thermosulfidooxidam 41 достигали концентрации 1,6-1,7 х107 кл/мл, при этом время генерации составляло 8 ч. Значение рН немного повышалось от 1,8 до 2,0, и было окислено 80% от внесенного в среду Рег+(рис. 11).
Активность ферментов, участвующих в метаболизме серы у SLthermosuljidooxidans subsp. asporogenes 41
Клетки S.thermosulfidooxidans subsp. asporogenes штамм 41 содержат ряд ферментов, участвующих в окислении неорганических соединений серы (табл. 18),
Активность серадиоксигеназы была выявлена в клетках штамма 41 при их росте в миксотрофных условиях на среде с дрожжевым экстрактом и элементной серой или закисным железом и тиосульфатом (табл. 18). При измерении активности по образованию сульфита, соответствующая активность была ниже, чем по количеству образованного субстрата. Бесклеточные экстракты данной сульфобациллы содержали сульфитоксидазу, высокая активность которой не зависела от внесения в среду культивирования элементной серы или тиосульфата. Активность АФС-редуктазы также показана в клетках S.tkermosu!fidooxidans subsp. asporogenes штамм 41. У культуры, выросшей в присутствии элементной серы, активность данного фермента увеличивалась в 1,5 раза (табл. 18) по сравнению с активностью в клетках, окисляющих Fe2+. В бесклеточных экстрактах S.thermo.sulfidooxidam штамм 41, не удалось обнаружить сульфит:Ре3+оксидоредуктазу и сера:Ге3+оксидоредуктазу независимо от состава среды и условий аэрации культуры.
У S.thermosulfidooxidans, штамм 41, метаболизм тиосульфата может осуществляться с
помощью тиосульфатокисляющего фермента и роданазы. Наличие тиосульфата в среде
вызывает увеличение активности этих ферментов. У бактерий, окисляющих серу, активность роданазы более чем в 2 раза ниже, чем в клетках, растущих на среде с закисным железом и тиосульфатом. Значение активности тиосульфатокисллющего фермента сохраняется в клетках, окисляющих серу почти на таком же уровне, что и у культуры, растущей на среде с Fe и тиосульфатом, Тиосульфатредуктазу в бесклеточных экстрактах выявить не удалось.
Экстракты клеток штамма 41 разлагали тетратионат с образованием тиосульфата, серы и, возможно, сульфата (рис. 36). Содержание образованного из тетратионата БО -иона невозможно было оценить, так как реакционная смесь содержала большое количество сульфата аммония (2М). Экстрактами клеток, выросших на среде с серой, тетратионат разлагался с образованием большего количества тиосульфата (рис. 36, а), чем в клетках, выросших в присутствии закисного железа (рис. 36, б). В обоих случаях реакция гидролиза тетратионата осуществлялась преимущественно с образованием серы, а тиосульфата обнаруживалось меньше, вероятно вследствие его разложения на S и SOj".
На основании полученных данных можно представить схему серного метаболизма у S.thermosulfidooxidans штамм 41 (рис. 37).
Как следует из проведенных нами исследовании, все три изученных в данной работе штамма, относимые к роду Sulfobacillus, росли неограниченное число пассажей только в миксотрофньтх условиях, когда достигалось минимальное время генерации (табл. 5), максимальные концентрация клеток и скорость окисления неорганического источника энергии (рис. 4, 14, 17). В авто- и гетеротрофных условиях стабильного роста данных бактерий не наблюдалось. Все исследуемые организмы не росли в автотрофных условиях более двух пересевов. В то же время наблюдались различия в способности к использованию органических и неорганических субстратов между штаммами 41 и N1 и термотолерантным штаммом К1. Последний организм характеризуется значительно более слабой способностью к окислению минерального субстрата, но полнее использует органическое вещество (табл. 5). Кроме того, три изученных штамма отличаются по способности к росту в гетеротрофных условиях. Наименее благоприятны гетеротрофные условия для S.thermosulfidooxidam штамм 41. S.sibiricus штамм N1 растет за счет использования органического вещества быстрее и выдерживает большее число пересевов, что делает его сходным с S.acidophilus, который растет в гетротрофных условиях с меньшим временем генерации и образует большую биомассу, чем S,tkermosulfidooxidans (Norris et al., 1996). "S.thermosulfidooxidans subsp. thermotohrans" штамм Kl обладает наиболее гетеротрофным типом питания из изученных бактерий, но все же не способен к стабильному росту в отсутствие неорганического источника энергии. Как уже отмечалось в обзоре литературы, феномен миксотрофии описан для многих микроорганизмов. Наиболее изучены в этом отношении некоторые водородные бактерии (Pare, DeCicco, 1976, Friedrich et al., 1981, Friedrich, 1982), и ряд грамотрицательных организмов, способных к окислению тиосульфата (London, Rittenberg, 1966, Smith et al., 1980, Perez, Matin, 1982, Pronk et al., 1990 b, Padden et al., 1998). Как и у изученных нами штаммов умеренно-термофильных ацидофильных бактерий, у этих организмов обнаружена гибкая регуляция систем, отвечающих за автотрофную ассимиляцию СОї. У этой группы микроорганизмов отмечался довольно высокий уровень активности соответствующих ферментов и при наличии в среде органического углерода, который наряду с СОг также потреблялся клетками. Однако следует отметить, что в большинстве опытов эти данные были получены с использованием проточных культур, тогда как при изучении сульфобацилл наши эксперименты проводились с периодическими культурами. Также необходимо подчеркнуть, что только культуры исследованных нами (табл. 5) и изученных до сих пор сульфобацилл (Wood, Kelly, 1983; Wood, Kelly, 1984; Norris et al„ 1996) невозможно длительно культивировать в авто- и гетеротрофных условиях, тогда как другие описанные организмы, способные к миксотрофии, стабильно росли не только в миксотрофных, но и в авто- и гетеротрофных условиях.
Для объяснения причин отсутствия стабильного роста сульфобацилл в автотрофных условиях были выдвинуты различные предположения. Можно полагать, что изучаемые штаммы сульфобацилл являются ауксотрофами по какому-либо соединению, входящему в состав дрожжевого экстракта. Однако было показано, что добавление в среду культивирования как индивидуальных витаминов (биотина, фолиевой кислоты, рибофлавина, В$, никотиновой кислоты, тиамина, пантотеновой кислоты, Вц), так и их смеси не компенсировало отсутствия дрожжевого экстракта (Цаплина, Богданова, личн, сообщ.).
