Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 8
1.1. Роль анаэробных бактерий рода Clostridium в почвенных процессах 8
1.2. География и экология анаэробных Азотфиксаторов рода Clostridium 14
1.3. Морфология, физиология и изменчивость анаэробных бактерий рода Clostridium 3
1.4. Фиксация молекулярного азота атмосферы анаэробными бактериями рода Clostridium 28
1.5. Цитология анаэробных спорообразующих бактерий рода Clostridium 37
ЧАСТЬ 2. Экспериментальная часть 49
2.1. Объекты и методы исследования 49
2.1.1. Микробиологические методы исследования 49
2.1.2. Методы создания анаэробных условий культивирования микроорганизмов 52
2.1.3. Биохимические методы: определение нитрогенезной активности микроорганизмов 58
2.1.4. Цитологические методы исследования 64
2.2. Изучение географического распространения почвенных анаэробных бактерий рода Clostridium 64
2.2.1. Распространение маслянокислих и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон 64
2.2.2. Распространение сахаролитических железовоостанавливающих бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон 75
2.2.3. Влияние почвенно-климатических условий на некоторые морфологические и физиологические особенности анаэробных бактерий рода Clostridium 79
2.3. Изучение азотфиксирующей активности почв разных почвенно-климатических зон 81
2.3.1. Потенциальная азотфиксирущая активность почв 81
2.3.2. Актуальная и потенциальная азотфиксирущая активность почв Бангладеш 83
2.4. Фиксация молекулярного азота атмосферы анаэробными бактериями рода Clostridium
выделенными из почв разных почвенно- климатических зон 87
2.4.1. Изучение эффективности азотфикса-ции у экологических рас Clostridium 87
2.4.2. Изучение влияния условий роста истадий развития культур Clostridium на их азотфиксирующуго активность 99
2.5. Изучение цитологических особенностей клеток и процесса спорообразования азотфиксирующих Clostridium выделенных из тропических почв НО
2.5.1. Цитологические особенности бактериальных клеток C.butyricum C.pasteurianum и Cflavum НО
2.5.2. Цитология спорообразования 131
Выводы 136
Литература 139
- Роль анаэробных бактерий рода Clostridium в почвенных процессах
- Фиксация молекулярного азота атмосферы анаэробными бактериями рода Clostridium
- Объекты и методы исследования
- Распространение маслянокислих и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время биологическая фиксация азота и фотосинтез выделены в число основных физиологических процессов, от которых зависит все производство продуктов в мире. Поэтому интерес к биологическому азоту в сельском хозяйстве, т.е. к азоту, связываемому из воздуха почвенными микроорганизмами-азотфиксаторами, во всех странах бсстро повышается. Основные причины: во-первых, несмотря на быстрый рост производства минеральных азотных удобрений, в сельском хозяйстве все еще наблюдается недостаток азота, особенно для зерновых; во-вторых, биологически связанный азот, в отличие от минерального, не только не требует затрат на его производство, но и дает богатую полноценным белком продукцию и обогащает почву азотом; в-третьих, что особенно важно в интенсивном сельском хозяйстве, биологический азот не загрязняет окружающую среду. Следовательно, биологический азот должен рассматриваться как мощный фактор формирования потенциального плодородия почвы. Он создает благоприятный фон для земледелия и позволяет более экономно расходовать минеральные азотные удобрения.
Роль различных групп микроорганизмов в суммарном процессе азотфиксации в почве изучена неодинаково. Способность клубеньковых бактерий в симбиозе с бобовыми обогащать почву связанным азотом известна хорошо. Однако в масштабе биосферы их роль относительно невелика, поскольку даже в агробиогеоценозах в настоящее время бобовые растения занимают пока скромное место -около 10$ от всей площади посева сельскохозяйственных культур (Петербургский, 1985).
Деятельность свободноживущих (несимбиотических) азотфикси-рующих микроорганизмов в почве оставалась до последнего времени мало изученной, а о масштабах ее имелись крайне разноречивые мнения. Основываясь на результатах лабораторных наблюдений, а также данных, полученных для чистых культур микроорганизмов, полагали, что свободноживущие азотфиксаторы связывают не более 3-5 кг азота на гектар в год в почвах умеренной зоны.
Полученные к настоящему времени (при использовании современных методов исследований) данные показывают, что продуктивность несимбиотической азотфиксации в почве более значительна, чем считалось прежде, и составляет для почв умеренной зоны 25-94 кг/га/ /год (по данным советских исследователей) и 18-110 кг/га/год (по данным зарубежных исследователей), а в тропических районах -90-600 кг/га/год (Дарт, Дей, 1979).
Среди свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, существенное МеСТО ЗаНИМаЮТ анаэробные баКТерИИ рода Clostridium.
Однако несмотря на значительное количество исследований, посвященных Clostridium, полученные данные еще далеки от исчерпываю-щего освещения биологии этих весьма интересных, с теоретической точки зрения, и очень важных в практическом отношении, азотфиксирующих бактерий.
В литературе недостаточно освещены вопросы качественного и количественного состава анаэробной флоры в почвах различных поч-венно-климатических зон, морфолого-физиологических особенностей составляющих ее видов и их азотфиксирующей способности, а также условия, в которых осуществляется активное связывание молекулярного азота атмосферы.
В связи с изложенным, в основу нашзй работы было положено изучение географического распространения, морфолого-физиологичес- ких особенностей и азотфиксирующей активности анаэробных бактерий рода Clostridium. При этом, существенное внимание было уделено изучению этих микроорганизмов в тропических почвах Бангладеш, где, как выяснилось в результате проведенных экспериментов, они повсеместно обнаруживаются в значительных количествах, а поэтому могут играть определенную роль в накоплении азота. Цель и задачи исследований. Целью исследований было сравнительное изучение ареалов распространения представителей сахаро-литических азотфиксаторов рода Clostridium в почвах различных почвенно-климатических зон, их морфолого-физиологических особенностей и азотфиксирующей активности. Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучить ареалы распространения сахаролитических азотфик-
СаТОрОВ рода Clostridium В ПОЧВЭХ раЗНЫХ ПОЧВЄННО-КЛИМаТИЧЄСКИХ зон Советского Союза, Бангладеш, а также ряда других стран.
Определить актуальную и потенциальную азотфиксирующую активность почв разных почвенно-климатических зон.
Выделить чистые культуры анаэробных бактерий рода Clostridium из почв разных почвенно-климатических зон и определить их азотфиксирующую активность.
Исследовать цитологические особенности клеток чистых культур анаэробных азотфиксаторов.
Научная новизна. В работе впервые получены количественные данные о численности и азотфиксирующей активности анаэробных бактерий рода Clostridium в ПОЧВЭХ раЗНЫХ ГЄОГрафИЧЄСКИХ ШИрОТ.
Из разнообразных почв выделено 310 штаммов анаэробных бактерий рода Clostridium, у которых выявлены различия в активности фиксации азота атмосферы. Наибольшей активностью обладали штаммы, выделенные из субтропических и тропических почв.
Впервые изучена актуальная азотфиксирующая активность почв Бангладеш. Установлено, что в зависимости от характера возделываемой сельскохозяйственной культуры, фиксация азота может варьировать..: в пределах 25-75 кг на I га за вегетационный период. Потенциальная азотфиксация была в 3-5 раз выше актуальной, в особенности в почве ризосферы риса.
Показано изменение уровня азотфиксирующей активности анаэробных бактерий в течение онтогенетического развития культур Clostridium. В большинстве случаев в начале стадии спорообразования наблюдается самый высокий уровень азотфиксации. Изучена
СубМИКрОСКОПИЧеСКаЯ ОргаНИЗаЦИЯ И СПОрООбраЗОВаНИе у Clostridium на электронно-микроскопическом уровне. Впервые установлены некоторые цитологические отличия (наличие двух спор в одной клетке, содержание большого количества гранулезы в спорах, образование параспоральных телец белковой природы и др.), характерные для аЗОТфИКСИруЮЩИХ Clostridium," ВЫДвЛеННЫХ ИЗ ТрОПИЧвСКИХ ПОЧВ.
Практическая ценность. Результаты исследований могут быть использованы для разработки приемов рационального и экономного использования азотных удобрений с учетом возможности почв накапливать азот микробиологическим путем.
Кроме того, результаты методических разработок, осуществленных при выполнении диссертационной работы, могут быть использованы в лабораториях научно-исследовательских институтов сельского хозяйства и сельскохозяйственных ВУЗов.
Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельско-хозяй-ственной академии им.К.А.Тимирязева и в отделе физиологии споро-образующих бактерий института микробиологии АН СССР.
Роль анаэробных бактерий рода Clostridium в почвенных процессах
Прошло более ста лет с того момента, когда Л.Пастер (1861) установил возможность жизни без кислорода и доказал, что на некоторые бактерии кислород оказывает токсичное действие. По его данным такими микроорганизмами были возбудители маслянокислого брОЖеНИЯ, ОТНОСЯЩИеСЯ К РОДУ Clostridium. В результате этого важнейшего открытия все организмы по их отношению к присутствию воздуха, а точнее кислорода, который в нем находится, были разделены на три группы: аэробы, факультативные анаэробы и анаэробы. Последняя группа объединяет организмы двух типову а именно: формы, которые являются строгими или облигатными анаэробами и организмы, которые могут расти в присутствии молекулярного кислорода, но в метаболизме его не используют. Анаэробы, особенно строгие, - это главным образом бактерии, принадлежащие к разным систематическим группам. Согласно имеющимся данным, можно выделить не менее пятидесяти родов бактерий, представленных строгими анаэробами. Среди них есть и сапрофиты, и паразиты. Немало анаэробов являются возбудителями разных заболеваний. Согласно Бьюкенену ( Buchanan, 1949) роль анаэробных микроорганизмов в сельском хозяйстве может быть представлена следующей схемой: І. В почве: а) удобрения и навоз; б) разложение органических веществ: I) разложение целлюлозы, 2) разложение белковых веществ, 3) фиксация молекулярного азота атмосферы, 9. 4) специфическое отношение к нитратам и сульфатам, 5) образование метана и С02. П. В разложении органических остатков (выжив отных гребные ямы и пр.). Ш. В пищеварении домашних и птиц: а) жвачных животных; б) травоядных животных; в) других животных. ІУ. В получении и хранении продуктов сельского хозяйства. Исследование анаэробов имеет важное значение для решения многих практических задач медицины, сельского хозяйства, технической и геологической микробиологии. На основании использования некоторых анаэробов, образующих горючие газы (метан и водород), могут быть пополнены энергетические ресурсы, что является одной из актуальных проблем настоящего времени. Деятельность многих анаэробов весьма важна для очистки окружающей среды от загрязнений.
Интерес к анаэробам, особенно возросший за последние годы, связан с различными проблемами общебиологического характера. Исследование анаэробов дает весьма много для выяснения условий, в которых может проявляться и сохраняться жизнь, что особенно существенно в связи с развитием космических исследований и установлением возможности жизни на других планетах. С другой стороны, изучение анаэробов важно для понимания эволюции жизни на Земле. В этой связи обращает на себя внимание то, что среди строгих анаэробов встречается немало термофилов, тогда как псих-рофилы весьма редки.
Многие проблемы экологии также связаны с исследованием различных анаэробов, часто образующих тесные ассоциации с другими микроорганизмами, которые активно участвуют в круговороте веществ. Весьма показательна и важна, например, деятельность таких анаэробных микробных ассоциаций как бактерии, разлагающие клетчатку, и метанобразующие формы.
За несколько последних десятилетий в области изучения анаэробных бактерий были достигнуты значительные успехи. Сегодня мы уже знаем, что бактерии рода Clostridium - наиболее многочисленная и широко распространенная группа среди анаэробов (Пошон, Де Баржак, I960; Мишустин, Емцев, 1974; Бабайцева, 1978; Скин-нер, 1979). Они обнаружены в различных климатических поясах, в самых разнообразных почвах, воде и грунтах озер, рек, морей и океанов (Емцев, 1971).
Экологические условия оказывают определенное влияние на количество и состав анаэробной микрофлоры. Среди факторов, которые влияют на распространение бактерий рода Clostridium особенно большую роль играет наличие источников энергии и питательных веществ, величина рН, Еь, аэрация, влажность, температура и другие (Мишустин, Емцев, 1974).
Накопление в почве свежих растительных остатков приводит к интенсивному размножению маслянокислих клостридий (Лазарев, 1949; Пошон,:. Де Баржак, I960). Свежие органические вещества являются источником энергии, питательных веществ, витаминов, факторов рОСТа, МИКрОЭЛеМеНТОВ ДЛЯ Clostridium (ЕМЦЄВ, І96І6) . Маслянокислые бактерии рода Clostridium вызывают в почве процессы превращения и распада растительных остатков, прежде всего, их углеродистых составных частей, образуя в результате своей жизнедеятельности гуминовые вещества (Лазарев, 1949). Обнаружение и определение клостридий в почве и ризосфере дает представление об интенсивности данного процесса, имеющего в конечном счете большое значение в образовании сложного природного вещества - гумуса почвы (Скалон, 1965). II. Б.Р.Волобуев (1963) указывает на тесную зависимость разложения органических остатков от гидротермических условий. Возможно, что увеличение влажности почвы способствует растворению и доступности органических веществ для анаэробных бактерий. АнаэрОбНЫе баКТерИИ рОДа Clostridium Cpasteurianum, С. butyiicum) в первую очередь расщепляют простые сахара и растворимые в воде соединения (Бмцев, 1971). Клостридии, способные разлагать целлюлозу в анаэробных условиях, широко распространены в почве, но они редко изобилуют, исключая случаи со строгим и длительным анаэробиозом ( skinner, 1965). Клостридии, разлагающие пектин, известны с давних времен по процессу мочки льна. По данным В.Т. Емцева с соавторами (1969), пектинолитические формы Clostridium широко распространены в различных почвенных типах СССР. В последние годы внимание исследователей привлекли протео-литические анаэробы (Емцев, 1974; skinner, 1968, 1979). А.К. Горовой (1979) изучено распространение протеолитических анаэробных баКТерИЙ рОДа Clostridium В ОСНОВНЫХ ТИПЭХ ПОЧВ СССР. ВЫЯВ лена способность протеолитических клостридии трансформировать белковые вещества в почве (Емцев, 1982). Обнаружено, что Clostridium из дерново-подзолистой почвы и чернозема осуществляли неглубокий протеолйз и образовывали много пептидов и других белковых фрагментов. В то же время у культур анаэробов из светло-каштановой почвы и серозема гидролиз указанных соединений характеризовался глубиной, дающей мало пептидов и много низкомолекулярных продуктов. Многочисленными исследованиями установлено, что анаэробные азотфиксаторы хорошо развиваются в ризосфере различных растений (Виноградова, 1955; Емцев, 1958, 1961; Львов, 1964; Ска 12. лон, 1965; Исакова, Бойцева, 1969; Редькина, Калининская, 1981; Калининская, Редькина, 1981; Hauke—Pacewiczowa, Balandreau, Dommer ques, 1970). Модельные опыты (Емцев, 1981) показали, что сахаролитичес КИЄ анаэробы ( С. pasteurianum, С. butyricum) ЭНврГИЧНО раЗВИВаЮТ ся в первый период распада растительных остатков, а протеолити ЧеСКИв ( С. acetobutylicum, С. sporogenes) — на Завершающем. ОчЄ— видно последние, предпочитающие белковую среду, могут успешно размножаться лишь на массе органических остатков, обогащенных микробным протеином и биологически активными соединениями. При изучении динамики количества анаэробных бактерий в ризосфере риса (Дебривная, 1970) выявлено их постепенное нарастание в течение вегетации с максимумом к моменту созревания риса (14,5 млн). Автор объясняет такую закономерность тем, что рис во время цветения аэрирует почву и тем самым способствует росту аэробов и задержке роста анаэробов. В период же его полной зрелости с началом отмирания корневой системы количество анаэробов реЗКО увеличивается. На КОРНЯХ риса количество КЛетОК Clostridium достигало 21,8 млн/г корней.
Фиксация молекулярного азота атмосферы анаэробными бактериями рода Clostridium
Изучение свободноживущих почвенных анаэробных азотфикса-торов представляет большой интерес в связи с их существенной ролью в обогащении почвы азотом, а, следовательно, в плодородии почв. Способность фиксировать азот атмосферы присуща большинству НепаТОГеННЫХ аНаэрОбНЫХ баКТерИЙ рОДа Clostridium (С. pasteurianum, С. butyricum, С. butyricum var. Saccharobutyricum, С. bej-erirr skii и другие (Емцев, 1959). Несмотря на повсеместное распространение в почве азотфиксаторов Clostridium в больших количествах (миллионы на I г почвы), роли этих бактерий в ассимиляции атмосферного азота.в почве долгое время не придавалось большого ЗНачеНИЯ, ХОТЯ ЄЩЄ В Начале 50-Х ГОДОВ ( Rosenblum, Wilson, 1950; Parker, 1954) было выявлено, что величина анаэробной азотфиксапии при определенных методах культивирования может достичь величины аэробной азотфиксапии. Литературные данные 29. о размерах азотфиксации в почве анаэробными клостридиями весьма разноречивы. В.Т.Емцевым и С.Н.Захаровой (1973) показано, что анаэробная азотфиксация в дерново-подзолистой почве составила 3,5 мг, а в черноземе и каштановой почве - соответственно 3,08 и 0,69 мг азота на I г использованного источника углерода (в пересчете На ГЛГОКОЗу) . АКТИВНОСТЬ аНаэробНЫХ аЗОТфИКСаТОрОВ ( Clostridium) в дерново-подзолистой почве (Зубко, 1975) составляла 0,03-0,05 мг азота за сутки на I кг почвы, в черноземах - 0,02-0,03 мг азота за сутки на I кг почвы. Особое значение в анаэробной фиксации азота имеют корневые выделения (мооге, 1966; steward, 1969), неразложивпшеся растительные остатки и повышенное увлажнение (Rice et al., 1967). Так, рядом исследователей (Дебривная, 1970; Калининская и др., 1972; Hauke-Pacewiczowa, Balandreau, Dommerques, 1970) ПОКаЗаНО, что более активная фиксация азота отмечается вблизи корней и на корнях риса и кукурузы в условиях затопления. Следовательно, активность несимбиотической азотфиксации обусловливается уровнем анаэробиоза, определяемым влажностью, с увеличением которой возрастает скорость азотфиксации. Однако ассимиляция атмосферного азота не становится значительной даже во влажных почвах, если нет какого-либо источника энергии (Емцев, 1974). Что касается влияния кислотности почвы на деятельность анаэробов, то следует отметить, что рН почвы не оказывает существенного влияния на фиксацию азота (Пономарева, 1959; Рыыс, 1966; Мооге, 1963). По имеющимся данным температурный режим также влияет на ЖИЗНедеЯТеЛЬНОСТЬ КЛОСТрИДИЙ. ПО МНеНИЮ НеКОТОрЫХ аВТОрОВ (Jensen, 1951; stewart, 1969; Jurgensen, Davey, 1970) низкая температура ЛИМИТИруеТ аЗОТфИКСаЦИЮ Clostridium В ПОЧВЄ. зо. Из приведенных выше данных видно, что условия ризосферы -наличие органических веществ, повышенная влажность, низкое парциальное давление кислорода (Браун, 1979), - как нельзя лучше подходят для деятельности в корневой зоне растении анаэробных баКТерИЙ рОДа Clostridium. Эффективность фиксации азота атмосферы бактериями рода Clostridium и факторы, ее определяющие. Количество азота, фиксированного различными видами Clostridium на безазотистой среде Виноградского, обычно составляло величину фиксации порядка 1-4 мг азота на I г сброженного сахара. Последующими исследователями, применившими оптимальные питательные среды, отмечена фиксация большего количества азота - от 4 до 12,5-16 и даже 27 мг ( sjo lander, McCoy, 1937; Jensen, Spenser, 1947; Parker, 1954; Rosen bium, Wilson, 1949; Емцев, Захарова, 1971; Емцев, Дзадзамия, 1970; Емцев, Развожевская, 1971 и другие). На фИКСаЦИЮ аЗОТа аТМОСферЫ баКТерИЯМИ РОДа Clostridium оказывают влияние многие факторы внешней среды, поэтому интенсивность связывания молекулярного азота этими микроорганизмами непостоянна. Одним из таких факторов служит вид внесенного в среду источника углерода (С.Н.Захарова, 1971). Больше всего фиксируется азота при использовании для этой цели мальтозы, глюкозы и декстрина. УрОВеНЬ фИКСаЦИИ аЗОТа Clostridium ОПрЄДЄЛЯЄТСЯ ТІКЖЄ НЭЛИ чием в среде связанного азота. Так, согласно В.Т.Емцеву и С.Н.Захаровой (1970), дозы связанного азота 10 и 20 мг на I л среды ХОТЯ И НеСКОЛЬКО ТОРМОЗЯТ ПрОЦеСС фИКСаЦИИ аЗОТа С. pasteurianum и с- acetobutyiicum, но его уровень все же остается достаточно высоким. При изучении влияния больших доз связанного азота на ЗІ. фИКСаЦИЮ аЗОТа аТМОСферЫ С. pasteurianum И С. acetobutylicum Б.Т.Ещевым и Т.Д.Дзадзамией (1971) было выявлено, что дозы азота 712 и 1082 мг/л сильно депрессируют азотфиксапию, но не прекрадают ее полностью.
В настоящее время все больше исследователей сходятся на том, что для начального развития азотфиксаторов некоторое количество связанного азота все же необходимо для того, чтобы вызвать выработку организмами азотфиксирующих ферментов ( Proctor, Wilson, 1958, 1959; Федоров, Калининская, 1959 и другие). В опытах В.Т.Емцева и С.Н.Захаровой (1970) наивысший уровень азотфиксации с. pasteurianum наблюдался при внесении в среду ВИНОГраДСКОГО КарТОфеЛЬНО-МОрКОВНОГО ОТВара, а С. acetobutylicum - пептона (количество азота в этих субстратах не должно превышать 4 мг на I л среды). Дрожжевой автолизат стимулировал анаэробную азотфиксапию в меньшей степени. Имеются данные о положительном влиянии микроэлементов (молибдена и ванадия) на фиксацию атмосферного азота бактериями рОДа Clostridium ( Jensen, Spenser, 1947; ФвДОрОВ, 1952; РабОТ нова и др., 1952 и другие). Показана также потребность Clostridium в солях железа при развитии этих организмов на средах, НЄ СОДержаЩИХ СВЯЗаННЫХ форм аЗОТа (Carnahan, Castle, 1958; Puiay et ai., 1959). В литературе также имеются указания на зависимость азотфиксации от температуры как климатического фактора. Так, С.Н.Захарова (1971) показала, что минимальная, оптимальная и максимальная температуры азотфиксации у штаммов с. pasteurianum, выделенных из черноземной и каштановой почв, несколько выше, чем штаммов, выделенных из дерново-подзолистой и горнолуговой почв. Весьма важно отметить, что на величину фиксации азота атмосферы Clostridium оказывает влияние тип почвы, из которых выде 32. лена культура анаэроба. Так, например, согласно исследованиям Омелянского (1953), ШТаММЫ С. pasteurianum, ВЩ6ЛЄШШЄ ИЗ О ПОД— золенного суглинка, фиксировали 2,38 мг азота на I г сброженного сахара, выделенные из черноземной почвы - 1,85 мг, а из краснозема - 1,53 мг. На различие в азотфиксирующеи активности Clostridium, изолированных из различных почвенных типов, указывают также А.В. Рыбалкина (1957). В.Т.Емцев и Т.Д.Дзадзамия (1970, 1971), В.Т.Емцев и З.С. Развожевская (1971), изучив интенсивность фиксации молекулярного азота Clostridium, выделенных из различных типов почв СССР, выявили, что под влиянием географических условий их активность меняется, ПрИЧеМ В бОЛЬШеЙ СТеПеНИ У С. pasteurianum И С. butyricum, И В МеНЬШеЙ у С. acetobutylicum И С. butylicum. Штаммы Clostridium, ВЫДелеННЫе ИЗ ДврНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ И ГОрНОЛуГОВОЙ почв, как правило, обладают большей ( в 2-2,5 раза в случае с С. pasteurianum И С. butyricum ) азотфиксирующеи активностью, чем штаммы, выделенные из каштановых почв и серозема.
Объекты и методы исследования
Микробиологические методы исследования. Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium и их азотфиксирующую активность изучали в почвах, взятых из разных эколого-географи-ческих зон СССР и других стран: подзолистой (Архангельская область), арктической (о.Шпицберген), аллювиально-болотной (Египет, дельта реки Нила), красной ферралитной (Куба), аллювиально-карбонатной (Бангладеш). Образцы почв отбирали по методике Звягинцева и др. (1980) из горизонтов AQ и Aj целинных и пахотного слоя окультуренных почв. Анализу подвергали образцы почв, предварительно высушенных при температуре 30С. Численность клеток Clostridium в почвенных образцах определяли путем посева вод т тп ной суспензии почвы (10 -І0хи) в различные питательные среды. Для количественного учета анаэробов испытывали следующие среды. Среда Н ПеПТОННО-ДрОЖЖеваЯ (ДЛЯ учета CI. pasteriunum Минеральная основа - I HPO - 0,5 г; КЕ РО - 0,5 г; Mgso4 0,5 г; HaCI - 0,5 г; Feso4- 0,01 г; Mnso4 - 0,01 г; смесь микроэлементов по Федорову - I мл (Федоров, 1956), а также глюкоза - 20 г; пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - I г; СаСОд - 10 г; дистиллированная вода - 1000 мл; рН 7,0 (Емцев, 1965). Среда Ш (для железовоостанавливающих анаэробов), в состав которой входят: %НР04 - 0,25 г; КН2Р04 - 0,25 г; Mgso4- 50 мг; ЫаС1 - 50 мг; КазМоО - 5 мг; СНдСООНа - 5 г; глюкоза - 20 г; дрожжевой экстракт - I г; смесь микроэлементов по Федорову -I мг; СаС03 - 5 г; дистиллированная вода - 1000 мл; а также раствор витаминов (мг/100 мл HgO): биотин - 0,1; пантотенат кальция - 0,1; тиамин хлорид - 2,0; пара-аминобензойная кислота - 1,0; рН 7,0 ( Hammann, Ottow, 1976). Среда №3 - RCM (Reinforced Clostridial Medium) ДЛЯ СуММар ного общего учета сахаролитических и протеолитических клостри-дни: пептон - 10 г; глюкоза - 5 г; ClL COOHa - 3 г; крахмал - I г; ІаСІ - 5 г; дрожжевой экстракт - I г; МПБ - 200 мл; дистиллированная вода - 800 мл; рН 7,1-7,2 ( sebaid et ai., 1966). Режим стерилизации: при 2 атм, I час (Омелянский, 1940). Во все три среды вносили по I мл/л 4$-ного водного раствора нейтральрота, являющегося специфическим индикатором на развитие анаэробов рода Clostridium, и 0,05$ цистеина, необходимого для понижения окислительно-восстановительного потенциала среды. Среды разливались в обычные пробирки по 10 мл и стерилизовались при 0,5 атм 30 минут. Выделение чистых культур проводили из накопительных после количественного учета. Использовали следующие среды: Для сахаролитических анаэробов среда М - картофельно-мор-ковная среда (Емцев, 1965) следующего состава: картофельный отвар - 500 мл; морковный отвар - 500 мл; глюкоза - 20 г; іуїРО - I г; M3SO4 - 0,5 г; Naci, Mnso4, Peso4 - следы; пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - I г; пистеин - 0,5 г; СаС03 -40 г; агар - 20 г; отвары готовили следующим образом: I кг тщательно очищенных и промытых в нескольких водах картофеля и моркови (0,5 кг картофеля и 0,5 кг моркови) заливали двойным количеством дистиллированной воды и кипятили 10 мин. Затем жидкость декантировали и фильтровали, к фильтрату добавляли дистиллированную воду до первоначального объема. 51. Среда $5 - среда пептонно-дрожжевая с глюкозой для с. pasT teurianum. Минеральная основа: Ш РО - 0,5 г; У ЯРО - 0,5 г; Mgso4- 0,5 г; ыась - 0,5 г (эти соли стерилизуются отдельно); Peso4- 0,01 г; Mnso4- 0,01 г (эти соли стерилизуются отдельно); I мл микроэлементы по Федорову: Ш3В03 - 5 г; HagMoO - 5 г; KI - 0,5 г; NaBr - 0,2 г; znso4, - 0,3 г; Mnso4 - 3 г; вода дистиллированная - 1000 мл). Глюкоза - 20 г; пептон - 5 г; дрожжевой автолизат - 0,2 г; СаС03 - 10 г, тиогликолевая кислота - 0,5 г/л, нейтральрот - 40 мг/л, вода дистиллированная -1000 мл, рН 7,0. Режим стерилизации: 0,5 атм. Среда J6 - среда пептонно-дрожжевая с крахмалом для с. buty-ricum. Минеральная основа (см. среду $5); картофельный крахмал - 20 г; пептон - 5 г; СаС03 - 10 г; тиогликолевая кислота -0,5 г/л; нейтральрот - 40 мг/л, дистиллированная вода 1000 мл. Стерилизация при 0,5 атм. Среда №7 — Среда ДЛЯ С. acetobutylicum. Ъ% кукурузный затор: 50 г кукурузной муки віл холодной воды быстро нагреть до 90С и выдержать 10 мин. Затем кипятить 30 мин., добавить нейтральрот - 40 мг/л, рН 5,6-5,7, тиогликолевая кислота - 0,5 г/л. Стерилизация I атм. Перед употреблением среды кипятили 20 мин. для удаления растворенного кислорода. Посевы ишфбировали в термостате при температуре 28-30 и 37-38С. Для проведения анализа разведения почвы вносили по I мл в пробирку с 10 мл соответствующей среды. КоЛИЧеСТВО СахарОЛИТИЧеСКИХ Clostridium ПОДСЧИТЫВаЛИ МЄ-ТОДОМ ПредеЛЬНЫХ раЗВедеНИЙ, а ЧИСЛО КЛеТОК Clostridium В I МЛ культуры и в I г почвы - по таблицам Мак-Креди в 3-кратной по-вторности. Наблюдения за ростом проводили в течение 5-7 дней, 52. ежедневно определяя снижение rHg среды (восстановление нейт раЛЬрОТа Clostridium ВЫЗЫВавТ фЛуорЄСЦЄНЦИЮ СрвДЫ, КОТОрЭЯ приобретает золотисто-желтую окраску), наличие газообразования и клостридиальных клеток.
Сахаролитические Clostridium выделяли в чистую культуру двумя способами: I) с помощью накопительных культур, полученных на жидких средах, с пастеризацией при 85 в течение 10 мин и без нее; 2) путем прямого посева разведения (пастеризованного и непастеризованного) на чашки Петри с твердой средой.
Выделение чистых культур анаэробов из накопительных культур (одноразовый посев) проводили в чашках Петри в анаэроста-тах, в которых создавали вакуум с остаточным давлением 13,33 Па. Для обогащения внутреннего пространства анаэростата С02 помещали смесь соды и лимонной кислоты. Поглотителем влажности служила прокаленная окись алюминия.
Чистоту культур Clostridium проверяли на следующих средах: мясо-пептонном бульоне с 2%-тт агаром (МПА) косячком и в чашках Петри в аэробных и анаэробных условиях. Для идентификации выделенных чистых культур использовали определитель Берге (1978). Методы создания анаэробных условий культивирования микроорганизмов. Данный вопрос подробно изучали многие исследователи: Омелянский (1953), Работнова (1957), Емцев (1974), Дуда (1982), Mcciung (1056), wiiiis (1969), shinner (1971). С момента открытия анаэробов и до наших дней не прекращаются поиски надежных и простых методов создания анаэробиоза с помощью химических реагентов, либо путем физического удаления воздуха из емкостей, в которых проводится выращивание микроорганизмов.
Следует отметить, что в настоящее время успешно используются такие давно разработанные приемы, как: (I) культивирование анаэробов в жидких средах, налитых высоким слоем в пробирки и колбы; (П) культивирование анаэробов в герметизированных трубках и пипетках; (Ш) культивирование анаэробов в эксикаторах, вакуумных шкафах и других закупоривающихся емкостях, в которых кислород поглощается пирогаллолом, солями хрома, железными стружками и так далее.
Не отрицая необходимости применения в ряде случаев упомянутых методов, следует подчеркнуть значение новой, более совершенной анаэробной техники и приемов культивирования, позволяющих с большей надежностью, чем прежде, выращивать и количественно учитывать как факультативные, так и наиболее строгие анаэробные бактерии. К этим методам относится культивирование а анаэробных камерах типа анаэростатов, специальных крупногабаритных "перчаточных камерах" и в пробирках по Хангейту.
Распространение маслянокислих и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон
Распространение маслянокислых и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон Открытие Пастером (1861 г.) облигатно анаэробных спорооб разуЮЩИХ баКТерИЙ (Clostridium)СОЗДаЛО ОСНОВУ ДЛЯ ПОСЛвДуЮЩИХ исследований, в результате которых была выявлена огромная роль и масштабность процессов, осуществляемых микроорганизмами в 65. анаэробной зоне биосферы (Виноградский, 1952; Омелянский, 1953; ЗаВарЗИН, 1972; Weinberg et al., 1937; McClung, 1956; P vot et ai., 1957; Емцев, 1974; skinner, 1975 и другие). Несмотря на длительную историю изучения Clostridium многие вопросы их географии и экологии разработаны недостаточно. До сих пор очень мало сведений о количественном и качественном составах почвенных облигатных анаэробов, доминирующих группах и видах, о их распространении. Состав анаэробной микрофлоры и характер процессов, вызываемых ею в почве, тесно связан с экологической обстановкой окружающей среды, физическими и химическими особенностями и со всем комплексом биотопа. Микробиологический анализ большого набора почв разных почвенно-климатических зон показал, что маслянокис-лые и ацетонобутиловые анаэробы распространены во всех изучаемых почвах. Их количество исчисляется от сотен до тысяч и миллионов клеток на I г почвы. На эколого-географическое распространение анаэробов в почве, кроме отсутствия кислорода (анаэробиоз), существенное влияние оказывают и другие факторы, такие как: восстановительная способность окружающей среды, доступность питательных веществ, температура, влажность почвы и другие. Величина или интенсивность этих факторов характерны для ряда различных почвенно-климатических ЗОН, ЧТО В КОНеЧНОМ Счете ВЛИЯеТ На раЗВИТИе Clostridium. В табл. 1-5 и на рисунках 1-4 приводятся средние данные о численном составе анаэробов в ряде почв различных почвенно-климатических зон. Они получены на основании многочисленных анализов. Результаты исследований показывают, что тропические аллювиальные карбонатные почвы (рис.1), тропические красно-ферралитные почвы (рис.2) и дерново-глеевая почвы (рис.3) характеризуются высоким содержанием маслянокислих и ацетонобутиловых бактерий рода Clostridium. Их численность снижается в почвах северных зон (рис.2). Наименьшее количество выявлено в арктических гидроморф-ных глеевых почвах острова Шпицберген. Несколько повышенная численность микроорганизмов в арктических почвах (орнитогенной и моховом пятне) объясняется скоплением на поверхности этих почв слаборазложившихся растительных остатков (табл.1), которые служат хорошим энергетическим и питательным субстратом. Таблица I БаКТерИИ рОДа Clostridium в арКТИЧвСКИХ ПОЧВЭХ о .Шпицберген (в I г абс.сухой почвы) Тип почвы cl- pasteu : rianum І Cl. aceto— ! butylicum ; сі. buty-! ricum оГидроморфные глеевые почвы 1,4.10 Орнитогенная почва 8,7.1(г Моховое пятно 8,6.10 1,6.102 5,1.102 6,6.103 2,ІДО2 6,5.102 7,0.103 Приведенные в табл.I данные показывают, что под влиянием моха энергично развиваются анаэробные бактерии. При этом приток органики в почве обусловливает энерг ичное развитие психрофиль-ных анаэробов в почве северных широт. Пространственное изменение соотношений маслянокислих и ацетонобутиловых бактерий в почве не стирает специфических признаков, характеризующих состав анаэробов в отдельных типах почв. С очевидностью вырисовывается, что по мере движения с севера на юг общая численность анаэробов в почве возрастает. Характеризуя микробные ассоциации различных типов почв, Е.Н.Мишустин (1976) пишет, что "южная почва богаче микроорганизмами, увеличивается 71. ее "биогенность", то есть насыщенность жизнью". В пространственном развитии анаэробов существенное значение имеет географический фактор, который резко изменяет энергию почвенных процессов (Мишустин, 1964). К географическим факторам в каждой зоне накладываются экологические моменты, которые влияют на развитие анаэробов. Следует вспомнить слова Клюйвера ( кіиу-ver, van Niei, 1956), который писал, что космополизм микробов не означает, что они повсюду встречаются в значительных количествах. Лишь определенные условия вызывают их массовое размножение. Развитие анаэробов в почве зависит как от климатических условий, так и от ряда процессов, происходящих в почве. В тропических зонах в аллювиально-карбонатных почвах Бангладеш наблюдается значительное различие в численном составе анаэробов, в зависимости от состояния почвы (табл.2)» В неокультуренной почве, в зависимости от топографического расположения и флористического покрова, в развитии анаэробов наблюдаются существенные различия.
