Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Углеводородокисляющие микроорганиз мы и их значение в очистке экосистем от нефти и нефтепродуктов (обзор литературы) 11
1.1. Нефтяное загрязнение экосистем и факторы влияющие на углеводородокисляющую активность микроорганизмов 11
1.2. Экология и таксономическая характеристика углево-дородокисляющих бактерий 14
1.3. Физиологические особенности углеводородоксляю щих микроорганизмов 18
1.4. Потребление углеводородов микроорганизмами 21
1.5. Механизмы деградации углеводородов микроорганизмами 23
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Физико-географическая и гидрохимическая характеристики исследуемых водоемов 30
2.2. Методы выделения и оценки биологического разнообразия углеводородокисляющего бактериопланктона ... 34
2.3. Методы культивирования бактерий 37
2.4. Методы определения биологических свойств бактерий 38
2.5. Методы сокультивирования углеводородокисляю щих бактерий 42
2.6 Методы сокультивирования водорослей и бактерий... 43
2.7 Методы статистической обработки полученных ре з
зультатов 44
ГЛАВА 3. Видовая структура и биологические свой ства углеводородокисляющего бактерио планктона природных водоемов 46
3.1. Характеристика углеводородокисляющего бактерио-планктона озера Беленовское 47
3.2. Характеристика углеводородокисляющего бактерио планктона озера Рудничное 53
3.3 Характеристика углеводородокисляющего бактерио планктона реки Илек 58
3.4. Характеристика бактерий-симбионтов зеленой одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang 66
3.5. Значение каталазной активности микроорганизмов в биоценозах 73
ГЛАВА 4. Каталазная активность углеводородо кисляющих бактерий в условиях потребления нефти и нефтепродуктов 79
4.1. Потребление нефтепродукта грампозитивными бактериями Gordona terrae ИКВС № 19, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС № 15, Rhodococcus erythropolis ИКВС №11 80
4.2 Потребление нефтепродукта грамнегативными бактериями Acinetobacter sp.HKBC № 2122, Pseudomonas alcaligenes ИКВС №20121 86
4.3. Потребление нефти Сорочинского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp.HKBC № 2122 89
4.4. Потребление нефти Бугурусланского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter
sp.HKBC№2122 94
ГЛАВА 5 Прикладные аспекты использования угле водородокисляющих бактерий 100
5.1. Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов 100
5.2. Способ выбора штаммов микроорганизмов деструкторов нефти и нефтепродуктов 103
Заключение 113
Выводы 121
Список основной использованной литературы 123
- Экология и таксономическая характеристика углево-дородокисляющих бактерий
- Методы выделения и оценки биологического разнообразия углеводородокисляющего бактериопланктона
- Характеристика углеводородокисляющего бактерио планктона реки Илек
- Потребление нефти Сорочинского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp.HKBC № 2122
Введение к работе
Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения – сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И.Ю., 2005; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. 2006; Buckley et al., 1976).
Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и не загрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань А.В., 1989; Бердичевская М.М., 1991; Коронелли Т.В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В., 1995; Куюкина М.С. и др., 1999; Звягинцева И.С. 2001; Плотникова Е.Г., 2001; Сопрунова О.Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).
В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И.В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксигеназ и оксидаз (Готтшалк Г., 1982). Кроме того, в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые протекают по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров А.А., 1984; Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс, спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что приводит с течением времени к гибели клетки (Современная микробиология ..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструкции.
Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенности почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.
Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.
Цель работы. Определить значение каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.
Основные задачи:
-
Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.
-
Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.
-
В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.
-
Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.
-
Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов – деструкторов.
Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и мезотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных - грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардиоформных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминируют виды Pseudomonas и Alcaligenes.
Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед.). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампозитивных – у Xanthobacter sp.
На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6 до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20 %, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.
На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.
Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2396340 (2010); патент РФ № 2426781 (2011)).
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.
Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляющих бактерий. Штамм Gordona terrae - активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); IX Съезде Гидробиологического Общества при РАН (Тольятти, 2006); 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007); X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009); Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).
Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010); Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010); «Региональном молодежном инновационном конвенте» (г. Оренбург, 2011); золотой медалью Х Московского международного салона инноваций и инвестиций (г. Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы – в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов» (№ 2396340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2426781, 2011).
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель содержит 146 источников литературы, из них 114 отечественных и 32 зарубежных. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 36 рисунками, включая оригинальные микрофотографии.
Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос. регистрации 01.20.02 16537); Ассоциативный симбиоз водных микроорганизмов и его значение в санитарной и экологической практике (№ гос. регистрации 01201067428); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» (проект № БР-9-040); Госконтракта № 9 (276/06-000874.1) с Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области «Экспериментальное изучение и обоснование использования факторов микробной персистенции в экологической практике».
Экология и таксономическая характеристика углево-дородокисляющих бактерий
Большинство микроорганизмов способно в той или иной мере к потреблению углеводородов, это связано с наличием у них ферментов группы оксидаз. Однако основной вклад в процесс микробиологического разрушения углеводородов нефтяного происхождения вносят микроорганизмы, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии. Такие микроорганизмы встречаются, главным образом, среди аэробных форм, они получили название «углеводородокисляю-щие микроорганизмы» (Израэль Ю.А., Цыбань А.В. 1989; Патин С.А. 1997; Современная микробиология ..., 2005; Кураков А.В. и др., 2006). Уг-леводородокисляющие микроорганизмы не являются узкоспециализированной группой, они используют и другие органические вещества, и присутствуют как в загрязненных, так и в незагрязненных водах и почвах. От других членов гетеротрофного сообщества они отличаются наличием комплекса ферментов, окисляющих углеводороды и способностью к поглощению гидрофобного субстрата. К ним относят около 70 родов микроорганизмов, включающих 28 родов бактерий (свыше 100 видов), 30 видов грибов и 12 видов дрожжей, окисляющих один или несколько углеводородов (Нестеренко О. А. и др., 1985; Коронелли Т.В. 1996а; Иванов В.П., Сокольский А.Ф. 2000).
Способность углеводородокисляющих бактерий использовать помимо углеводородов, широкий спектр органических субстратов, обуславливает их широкое распространение в природных микробиоценозах (Милько Е.С., Егоров Н.С., 1991; Барышникова Л.М. и др., 1994; Зайцева Т.А. и др. 2010; Buckley et al., 1976). Загрязнение биоценоза нефтяными углеводородами вносит дополнительный источник углерода в экосистему, что стиму 15 лирует развитие группы углеводородокисляющих бактерий, а именно способствует увеличению их численности, чем и обусловлен эффект очищения биотопа (Рубцова СИ., 2002; Шамраев А.В., Шорина Т.С., 2009). Именно этим объясняется тот факт, что в хронически загрязненных нефтяными углеводородами экосистемах, численность углеводородокисляющих бактерий всегда выше по сравнению с не загрязненными. Соответственно, меняется и доля данной группы от численности гетеротрофных бактерий, варьируя от 0,1 до 100% (Atlas R.M., 1981). Ряд исследователей (Ward D.M. et al., 1980; Brock T.D., 1966) указывает, что при аварийных разливах нефти в акваториях низкая исходная численность углеводородокисляющих бактерий может выступать в качестве фактора, лимитирующего скорость биодеградации. Распространение данной группы бактерий, равно как и других гетеротрофных микроорганизмов, обеспечивается одними теми же факторами, а именно температурой, доступностью источников углерода, биогенных веществ, кислорода, а также кислотностью среды и подвержено широтно-географической и сезонной изменчивости. Для акваторий наиболее значимы первые два фактора, тогда как для почвы значимы все (Кура-ков А.В. и др., 2006; Коронелли Т.В. и др., 1989).
Таксономический состав водных углеводородокисляющих бактерий очень разнообразен, описано 28 родов бактерий и 14 родов грибов (Бутаев A.M., Кабыш Н.Ф., 2002; Bartha R., Atlas R.M., 1977). В составе углеводо-родокисляющей микрофлоры чаще всего встречаются: Rhodococcus, No-cardia, Corynebacterium, Frankia, Nocardiopsis, Brevibacterium, Actino-madura, Mycobacterium, Pseudonocardia, Pseudomonas, Acinetobacter, дрожжи рода Candida, Rhodotorula, Trichosporom, мицелиальные грибы Aspergillus, Penicillum, Gunninghamella, Cladosporum (Миронов О.Г., 1999; Павлова O.H. и др., 2008).
В почвах углеводородокисляющие микроорганизмы представлены, в основном, бактериями и грибами. Описано 22 рода бактерий, 19 родов дрожжей и 24 рода микроскопических мицелиальных грибов (Мурзакова Г.Б. и др. 1992; Хомякова Д.В. и др. 2002; Atlas R.M. et al, 1992). Типичными обитателями почв являются виды родов Pseudomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Bacillus, Nocardia, Achromo-bacter, Micrococcus, Klebsiella, Enter obacteriaceae, Mycobacterium, Beier-inckia, Alcaligenes, Corynebacterium, Xanthomonas и др. (Квасников Е.И., Кривицкий И.П. 1968; Сидоров Д.Г. и др., 1997; Киреева Н.А., Ямалетди-нова Г.Ф., 2000; Ткебучаева Л.Ф. и др., 2004; Сопрунова О.Б., 2005). Таксономический состав углеводородокисляющих почвенных бактерий зависит не только от типа почв, но и от характера природной растительности. Например, для северных, высокогорных и примитивных почв характерно преобладание Rhodococcus (Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., 1982; Коро-нелли Т.В. и др., 1997), в тундровых почвах Крайнего Севера доминируют представители родов Cytophaga, Rhodococcus, Arthrobacter (Хомякова Д.В., 2003), в арктических почвах, песках и горных породах доминирует род Arthrobacter (Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., 1986). Из почв, загрязненных нефтяными углеводородами, также выделяются спорообразующие бактерии рода Bacillus, аспорогенные дрожжи родов Rhodotorula и Candida, микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillum, Mucor и другие (Квасников Е.И., Клюшникова Т.М., 1981; Киреева Н.А. и др., 2001; Плотникова Е.Г. и др., 2001; Kaledine L., 1997).
Методы выделения и оценки биологического разнообразия углеводородокисляющего бактериопланктона
Определение каталазной активности бактерий Для определения каталазной активности бактерий - спутников водорослей использовали качественный и количественный методы. Метод качественного определения каталазной активности основан на визуальном выявлении при обработке исследуемых штаммов микроорганизмов раствором перекиси водорода пузырьков кислорода (Вейант Р. и др., 1999). На стерильное предметное стекло наносили суточную агаровую культуру бактерий, далее мазок обрабатывали 3-х процентным раствором перекиси водорода. Если в течение 30-60 секунд на стекле появлялись пузырьки газа, считали результаты реакции положительными.
Количественное определение уровня каталазной активности углево-дородокисляющих бактерий проводили по методу Бухарина О.В., Черкасова СВ., Сгибнева А.В. с соавтр. (2000). К 0,2 мл стандартизированной до ОД = 0,2 усл. ед. (при длине волны = 492 нм) взвеси добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,0125 М раствора перекиси водорода и инкубировали 10 минут при комнатной температуре, реакцию разложения перекиси катала-зой останавливали добавлением 5 капель 2 Н раствора соляной кислоты. Затем добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,025 М раствора йодида калия, тщательно перемешивали и осаждали клетки исследуемых микроорганизмов центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Далее, не позднее, чем через 10 минут после центрифугирования, замеряли свето 39 поглощение образовавшегося в надосадочной жидкости комплекса йод -йодид калия (при длине волны 492 нм в стандартной 96-луночной планшете, объёмом ячейки 250 мкл на полуавтоматическом фотометре «ИФА-ОЭП»).
Пероксид водорода, образующийся в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов, оценивали при помощи хемилюминесцентного анализа по методу ХайруллинаР.М., Ахметовой И.Э. (2001), на кафедре фармацевтической и общей химии Оренбургской государственной медицинской академии (зав. кафедрой д.м.н., профессор Красиков СИ.). Для этого использовали культуральную среду, отобранную из экспериментов по деструкции нефти и нефтепродуктов. Метод основан на регистрации хемилюминес-центной вспышки люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион), окисляющегося в присутствии пероксида водорода и пероксидазы. Хеми-люминесцентное свечение измеряли на хемилюминомере ХЛ-003. В камеру прибора помещали кювету с раствором, содержащим 1Q мл калий-фосфатного буфера (0,01 М КН2Р04/К2НР04, рН 6,5, 1 мМ KCL), 2 мл раствора пероксидазы хрена («Merck», Germany, конечная активность 15 ед./мл), приготовленного на калий-фосфатном буфере, 2 мл люминола («Merck», Germany, 0,05 мг/мл), растворенного в дистиллированной воде, и 0,5 мл культуральнои среды исследуемого штамма водоросли. Камеру закрывали и при непрерывном помешивании с равномерной скоростью, в кювету вносили еще 0,5 мл культуральнои среды. Наличие перексида водорода оценивали по вспышке хемилюминесценции.
Для доказательства того, что вещество, вызывающее вспышку хемилюминесценции, действительно является пероксидом водорода, содержащимся в среде, в отдельном эксперименте к аликвоте культуральнои среды добавляли каталазу - фермент, разрушающий Н202. Проведенный анализ выявил, что после внесения каталазы интенсивность хемилюминесценции резко снижалась (рис. 4). авторами (1984). В 1,5% мясо-пептонный агар добавляли лизоцим (ФАО «Ферейн») в концентрации от 1 до 8 мкг/мл и разливали в чашки Петри. На поверхность агаровой пластинки «пятачками» наносили суточные агаровые культуры исследуемых штаммов микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате сутки при температуре +25С. Далее выросшие колонии культур обрабатывали парами хлороформа в течение 30 минут, после чего «пятачки» заливали слоем 0,7% МПА (4 мл), смешанным с 0,2 мл миллиардной взвеси суточной агаровой тест-культуры Micrococcus luteus (штамм № 211001 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). За этим следовала повторная инкубация чашек с посевами в течение суток при температуре +37 С. Учет антилизоцимной активности проводили по наличию зон роста микрококка, вокруг колоний исследуемых микроорганизмов. Величина исследуемого признака выражалась в мкг/мл.
Определение лизоцимной активности бактерий Для выявления лизоцимной активности бактерий использовали чашечный метод (Бухарин О.В. и др., 1985). Концентрированные культуры бактерий в объеме 0,01 мл наносили "пятачками" на поверхность 1,5% питательного агара, смешанного с 0,1 мл миллиардной взвеси суточной культуры Micrococcus luteus (штамм № 211001 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Затем чашки Петри с исследуемыми культурами бактерий инкубировали в течение 24 ч при температуре 37С. Учет опыта проводили по зонам задержки роста тест-культуры, появляющимся вокруг колоний лизоцимак-тивных микроорганизмов. Количественный учет лизоцимной активности исследуемых бактерий проводили по диаметру зон задержки роста тест-культуры, с учетом таблицы, разработанной Б.Я. Усвяцовым и отражающей зависимость величины диаметра зоны задержки роста тест-культуры в зависимости от концентрации лизоцима, продуцируемого макроколонией бактерий (Бухарин О.В. и др., 1985). Лизоцимная активность исследуемых микроорганизмов выражалась в мкг/мл. Определение полноты потребления нефти или нефтепродуктов углеводородокисляющими бактериями
Полноту потребления нефти или нефтепродуктов определяли в аккредитованном испытательном центре ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Для этого 100 см3 культуральнои жидкости переносили в делительную воронку, отбирали 10 см3 гексана и ополаскивали им сосуд, в котором находилась проба, затем гексан помещали в делительную воронку. Смесь перемешивали 30с, отстаивали до появления прозрачного верхнего слоя, который отделяли и помещали в кювету и измеряли концентрацию нефтепродуктов в экстракте. Водную фазу отбирали в цилиндр и точно фиксировали ее объем.
Для сокультивирования использовались углеводородокисляющие штаммы Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 выделенные из природных биотопов. Экспериментальное сокультивирование осуществляли на минеральной среде Раймонда с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии нефти Сорочинского месторождения (Сорочинский район Оренбургской обл.) и Бугурусланского месторождения (Бугурусланский район Оренбургской обл.). Эксперимент проводили при температуре 25С в течение 35 суток. Исходная концентрация бактерий в среде составила 5 10 КОЕ/мл. Численность бактерий определяли путем посева 0,1 мл пробы на 1,5% мясопептонный агар или модифицированный агар Чапека и учетом выросших колоний. Высевы делали в первые сутки на 6, 12, 23, 28 и 35 сутки. В процессе сокультивирования определяли численность бактерий, их каталазную активность и потребление нефтепродукта методами описанными выше.
Характеристика углеводородокисляющего бактерио планктона реки Илек
Таким образом, в процессе проведенных исследований отмечено, что у штамма, не использующего нефтепродукт в качестве единственного источника углерода и энергии, численность и каталазная активность практически не меняются в процессе эксперимента, оставаясь на уровне близком к исходному. В то же время, для бактерий активных деструкторов характерно увеличение численности и снижение каталазной активности при контакте с нефтепродуктами. Изучение корреляционной зависимости между снижением каталазной активности штаммов (в процентах от исходного уровня) и снижением концентрации нефтепродукта в среде культивирования (в процентах от исходного уровня) показало сильную положительную связь между этими показателями для штаммов G. terrae (г=0,98 при р=0,01) и R. rubropertinctus (г=0,93 при р=0,05). У штамма R. Erythropolis, не способного к потреблению нефтепродуктов, связь между этими показателями отсутствовала (г=0,02). 4.2. Потребление нефтепродукта грамнегативными бактериями Acinetobacter sp. ИКВС № 2122, Pseudoraonas alcaligenes ИКВС № 20121
В практике нефтедеструкции зачастую, кроме грампозитивных, используют и грамнегативные культуры. Поэтому в своих исследованиях мы обратили внимание на биологические эффекты некоторых представителей грам-негативных бактерий в условиях их культивирования на средах, содержащих нефтепродукты. В экспериментальных условиях на жидкой минеральной среде Раймонда при потреблении нефтепродукта (дизельное топливо) в качестве единственного источника углерода и энергии учитывали следующие показатели: а) рост численности бактерий; б) изменение содержания нефтепродуктов; в) изменения каталазной активности бактерий; В эксперименте со штаммом Acinetobacter sp. к шестым суткам культивирования численность увеличилась на два порядка, а затем постепенно снижалась (рис. 28). Численность штамма P. alcaligenes увеличивалась к шестым суткам на один порядок, максимальные значения сохранялись вплоть до 12 суток, после чего численность снижалась (рис. 26). Различная динамика численности исследуемых штаммов связана, по-видимому, с разной способностью к потреблению дизельного топлива.
Параллельно определяли интенсивность потребления исследуемыми штаммами нефтепродуктов. Максимальное потребление нефтепродукта было отмечено в эксперименте с Acinetobacter sp., где к шестым суткам содержание нефтепродукта в среде снизилось и составило 64,1 ±1,3 % от первоначального уровня. Минимальное содержание дизельного топлива было зафиксировано на 28 сутки и составило 29,5±1,9 % от первоначального. В эксперименте со штаммом P. alcaligenes динамика потребления нефтепродукта была несколько иной (рис. 27). Потребление нефтепродукта слабо нарастало к 6 суткам и по окончании эксперимента (на 35 сутки), содержание, дизельного топлива было достаточно высоким - 81,9± 0,5 % от исходного уровня. Таким образом, из двух исследованных грамнегативных штаммов к потреблению дизельного топлива способен штамм Acinetobacter sp.
Таким образом, в эксперименте с грамнегативными бактериями, были получены результаты аналогичные данным с грампозитивными микроорганизмами: а именно, у штамма потребляющего нефтепродукт в качестве единственного источника углерода и энергии в ходе эксперимента наблюдается увеличение численности и снижение каталазнои активности, тогда как у штамма, не использующего дизельное топливо, подобной динамики не наблюдается. Изучение корреляционной зависимости между снижением каталазной активности штаммов (в процентах от исходного уровня) и снижением концентрации нефтепродукта в среде культивирования (в процентах ,от исходного уровня), показало сильную положительную связь между этими показателями для штамма Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 (г=0,96 при р=0,05). У штамма P. alcaligenes ИКВС № 20121 связь между показателями отсутствовала (г=0,02).
От экспериментов, в которых в качестве единственного источника углерода и энергии в питательную среду добавляли легкий для утилизации нефтепродукт - дизельное топливо, перешли к изучению способности исследуемых изолятов к деструкции природных нефтей. Полученные результаты представлены ниже.
Как и в предыдущих экспериментах, способность к потреблению нефти определяли как у отдельных штаммов, так и при их совместном культивировании. При этом учитывали изменение содержания нефтепродуктов, а также изменение численности и каталазной активности бактерий.
В эксперименте с нефтью Сорочинского месторождения численность монокультуры штамма G. terrae (контроль 1) достигала максимальных значений к 12 суткам, увеличиваясь на один порядок, и незначительно снижалась к концу эксперимента (рис. 29).
В эксперименте с монокультурой штамма Acinetobacter sp. (контроль 2) численность бактерий увеличивалась более чем на два порядка, достигая максимальных значений к 12 суткам, после чего резко падала, достигая к 35 суткам исходных значений.
При совместном культивировании штаммов Acinetobacter sp. и G. terrae на нефти Сорочинского месторождения численность штамма G. terrae, также как и в контроле 1, максимальных значений достигла к 12 суткам, увеличившись на один порядок, затем постепенно снижалась. Численность Acinetobacter sp. в условиях сокультивирования с G. terrae, достигла максимальных значений быстрее, чем в монокультуре (контроль 2), и уже к 6 суткам увеличилась более чем на два порядка. После 6 суток эксперимента численность Acinetobacter sp. снижалась вплоть до 35 суток.
Полученные результаты свидетельствуют о способности Acinetobacter sp. и G. terrae расти в присутствии нефти с различной скоростью. Отмечено ускорение роста Acinetobacter sp. в условиях совместного культивирования с G. terrae на среде с нефтью. Выявленные различия в скорости роста исследуемых культур в условиях их сокультивирования позволяют предположить, что штаммы потребляют разные фракции нефти.
Далее было проведено определение интенсивности потребления нефти исследуемыми штаммами. Первоначальная концентрация нефти в среде составляла 750±0,5 мг/дм3, что соответствовало 100 % содержанию нефти в исходной среде. Для учета испаряемости нефти был поставлен контроль 3 -минеральная среда Раймонда с добавлением нефти Сорочинского месторождения без культур микроорганизмов. Потребление нефти в первые 12 суток происходило интенсивнее у штамма Acinetobacter sp. (контроль 2), чем у штамма G. terrae (контроль 1). К шестым суткам содержание нефти в опыте с Acinetobacter sp. (контроль 2) составило 66,8±2,3 % от первоначального уровня, затем интенсивность потребления нефти снизилась и, на 35 сутки содержание нефти составило 56±2,6 % от первоначального уровня (рис. 30). В контроле 1 (штамм G. terrae) динамика потребления нефтепродукта была иной. К шестым суткам штамм потребил углеводородов меньше, чем Acinetobacter sp., но после 12 суток интенсивность потребления нефти не снизилась, а продолжала нарастать, и к концу эксперимента содержание нефти в среде составило 29,9±2,6% от первоначального уровня
Потребление нефти Сорочинского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp.HKBC № 2122
Таким образом, в процессе проведенных исследований отмечено, что у штамма, не использующего нефтепродукт в качестве единственного источника углерода и энергии, численность и каталазная активность практически не меняются в процессе эксперимента, оставаясь на уровне близком к исходному. В то же время, для бактерий активных деструкторов характерно увеличение численности и снижение каталазной активности при контакте с нефтепродуктами. Изучение корреляционной зависимости между снижением каталазной активности штаммов (в процентах от исходного уровня) и снижением концентрации нефтепродукта в среде культивирования (в процентах от исходного уровня) показало сильную положительную связь между этими показателями для штаммов G. terrae (г=0,98 при р=0,01) и R. rubropertinctus (г=0,93 при р=0,05). У штамма R. Erythropolis, не способного к потреблению нефтепродуктов, связь между этими показателями отсутствовала (г=0,02). 4.2. Потребление нефтепродукта грамнегативными бактериями Acinetobacter sp. ИКВС № 2122, Pseudoraonas alcaligenes ИКВС № 20121
В практике нефтедеструкции зачастую, кроме грампозитивных, используют и грамнегативные культуры. Поэтому в своих исследованиях мы обратили внимание на биологические эффекты некоторых представителей грам-негативных бактерий в условиях их культивирования на средах, содержащих нефтепродукты. В экспериментальных условиях на жидкой минеральной среде Раймонда при потреблении нефтепродукта (дизельное топливо) в качестве единственного источника углерода и энергии учитывали следующие показатели: а) рост численности бактерий; б) изменение содержания нефтепродуктов; в) изменения каталазной активности бактерий; В эксперименте со штаммом Acinetobacter sp. к шестым суткам культивирования численность увеличилась на два порядка, а затем постепенно снижалась (рис. 28). Численность штамма P. alcaligenes увеличивалась к шестым суткам на один порядок, максимальные значения сохранялись вплоть до 12 суток, после чего численность снижалась (рис. 26). Различная динамика численности исследуемых штаммов связана, по-видимому, с разной способностью к потреблению дизельного топлива.
Параллельно определяли интенсивность потребления исследуемыми штаммами нефтепродуктов. Максимальное потребление нефтепродукта было отмечено в эксперименте с Acinetobacter sp., где к шестым суткам содержание нефтепродукта в среде снизилось и составило 64,1 ±1,3 % от первоначального уровня. Минимальное содержание дизельного топлива было зафиксировано на 28 сутки и составило 29,5±1,9 % от первоначального. В эксперименте со штаммом P. alcaligenes динамика потребления нефтепродукта была несколько иной (рис. 27). Потребление нефтепродукта слабо нарастало к 6 суткам и по окончании эксперимента (на 35 сутки), содержание, дизельного топлива было достаточно высоким - 81,9± 0,5 % от исходного уровня. Таким образом, из двух исследованных грамнегативных штаммов к потреблению дизельного топлива способен штамм Acinetobacter sp.
Таким образом, в эксперименте с грамнегативными бактериями, были получены результаты аналогичные данным с грампозитивными микроорганизмами: а именно, у штамма потребляющего нефтепродукт в качестве единственного источника углерода и энергии в ходе эксперимента наблюдается увеличение численности и снижение каталазнои активности, тогда как у штамма, не использующего дизельное топливо, подобной динамики не наблюдается. Изучение корреляционной зависимости между снижением каталазной активности штаммов (в процентах от исходного уровня) и снижением концентрации нефтепродукта в среде культивирования (в процентах ,от исходного уровня), показало сильную положительную связь между этими показателями для штамма Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 (г=0,96 при р=0,05). У штамма P. alcaligenes ИКВС № 20121 связь между показателями отсутствовала (г=0,02).
От экспериментов, в которых в качестве единственного источника углерода и энергии в питательную среду добавляли легкий для утилизации нефтепродукт - дизельное топливо, перешли к изучению способности исследуемых изолятов к деструкции природных нефтей. Полученные результаты представлены ниже.
Как и в предыдущих экспериментах, способность к потреблению нефти определяли как у отдельных штаммов, так и при их совместном культивировании. При этом учитывали изменение содержания нефтепродуктов, а также изменение численности и каталазной активности бактерий.
В эксперименте с нефтью Сорочинского месторождения численность монокультуры штамма G. terrae (контроль 1) достигала максимальных значений к 12 суткам, увеличиваясь на один порядок, и незначительно снижалась к концу эксперимента (рис. 29).
В эксперименте с монокультурой штамма Acinetobacter sp. (контроль 2) численность бактерий увеличивалась более чем на два порядка, достигая максимальных значений к 12 суткам, после чего резко падала, достигая к 35 суткам исходных значений.
При совместном культивировании штаммов Acinetobacter sp. и G. terrae на нефти Сорочинского месторождения численность штамма G. terrae, также как и в контроле 1, максимальных значений достигла к 12 суткам, увеличившись на один порядок, затем постепенно снижалась. Численность Acinetobacter sp. в условиях сокультивирования с G. terrae, достигла максимальных значений быстрее, чем в монокультуре (контроль 2), и уже к 6 суткам увеличилась более чем на два порядка. После 6 суток эксперимента численность Acinetobacter sp. снижалась вплоть до 35 суток.
Полученные результаты свидетельствуют о способности Acinetobacter sp. и G. terrae расти в присутствии нефти с различной скоростью. Отмечено ускорение роста Acinetobacter sp. в условиях совместного культивирования с G. terrae на среде с нефтью. Выявленные различия в скорости роста исследуемых культур в условиях их сокультивирования позволяют предположить, что штаммы потребляют разные фракции нефти.
Далее было проведено определение интенсивности потребления нефти исследуемыми штаммами. Первоначальная концентрация нефти в среде составляла 750±0,5 мг/дм3, что соответствовало 100 % содержанию нефти в исходной среде. Для учета испаряемости нефти был поставлен контроль 3 -минеральная среда Раймонда с добавлением нефти Сорочинского месторождения без культур микроорганизмов. Потребление нефти в первые 12 суток происходило интенсивнее у штамма Acinetobacter sp. (контроль 2), чем у штамма G. terrae (контроль 1). К шестым суткам содержание нефти в опыте с Acinetobacter sp. (контроль 2) составило 66,8±2,3 % от первоначального уровня, затем интенсивность потребления нефти снизилась и, на 35 сутки содержание нефти составило 56±2,6 % от первоначального уровня (рис. 30). В контроле 1 (штамм G. terrae) динамика потребления нефтепродукта была иной. К шестым суткам штамм потребил углеводородов меньше, чем Acinetobacter sp., но после 12 суток интенсивность потребления нефти не снизилась, а продолжала нарастать, и к концу эксперимента содержание нефти в среде составило 29,9±2,6% от первоначального уровня
