Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Влияние интродукции бактерий p. Azotobacter в прикорневую систему растений на их развитие и продуктивность 10
12. Бактерии рода Azotobacter продуценты биологически активных веществ и антибиотиков 22
1.3. Перспективы создания эффективных биопрепаратов на основе свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов 27
2. Объекты и методы исследований 35
2.1.Скрининг штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов среди бактерий рода Azotobacter 36
2.2. Изучение фенотипических характеристик выделенных штаммов 37
2.3. Генетическая паспортизация штаммов методом концевого мечения рестриктазных фрагментов (КМРФ) 38
2.4. Определение нитрогеназной активности штаммов азотобактера при росте в жидкой культуре 39
2.5. Бактеризация семян КБ изучаемых штаммов 40
2.6. Определение ассоциативной азотфиксации в ризосфере корней инокулированных растений 40
2.7. Определение у штаммов азотобактера способности к синтезу индолил-3-уксусной кислоты и цитокининоподобных веществ и способности к разложению соединений фосфора 42
2.8. Изучение антагонистических свойств выделенных штаммов A. vinelandii 43
2.9. Определение структуры метаболитов штаммов A. vinelandii, обладающих фунгицидной активностью 44
2.10. Изучение влияния бактеризации штаммами Azotobacter vinelandii на прорастание семян сельскохозяйственных культур 46
2.11. Оценка влияния бактеризации семян штаммами Azotobacter vinelandii на развитие овощных культур в модельных экспериментах 47
2.12. Оценка биологической эффективности изучаемых штаммов A. vinelandii против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях лабораторных и полевых экспериментов 49
2.13. Оценка уровня биологической защиты от заболеваний овощных культур в лабораторно-вегетационных опытах при применении штаммов Azotobacter vinelandii 51
2.14. Получение ампициллинрезистентной модификации штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4 53
2.15. Изучение способности к колонизации корней растений у ампициллинрезистентного штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4amp 54
2.16. Изучение способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов рода Azotobacter 55
2.17. Статистическая обработка результатов 56
3. Новые штаммы Azotobacter vinelandii - антагонисты фитопатогенов и их свойства как PGPR-бактерий 57
3.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий p. Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов 57
3.2. Генетическая паспортизация выделенных штаммов 64
3.3. Влияние штаммов A. vinelandii на развитие фитопатогенных грибов 66
3.4. Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение 73
3.4.1. Нитрогеназная активность штаммов азотобактера 73
3.4.2. Ассоциативная азотфиксация в ризосфере растений при интродукции штаммов A. vinelandii 77
3.4.3. Фитогормоны, продуцируемые штаммами A. vinelandii 80
3.4.4. Способность штаммов азотобактера к разложению фосфатов 81
4. Структура антифунгальных метаболитов, продуцируемых штаммами Azotobacter vinelandii 82
5. Приживаемость интродуцентов в ризосфере растений и их влияние на аборигенную микробиоту 86
5.1. Способность штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4amp приживаться в ризосфере растений 86
5.2. Влияние интродукции штаммов-антагонистов рода Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы 90
5.3. Влияния интродукции штаммов-антагонистов A. vinelandii на микробиоту ризосферы огурца 97
6. Влияние новых штаммов A. vinelandii на защиту от болезней и рост сельскохозяйственных культур 102
6.1. Воздействие инокуляции штаммами A. vinelandii на прорастание семян овощных культур 102
6.2. Влияние штаммов A. vinelandii на развитие растений в модельных экспериментах 105
6.3. Защита пшеницы от корневых гнилей штаммами A. vinelandii, в модельных и полевых экспериментах 112
6.4. Эффективность использования штаммов A. vinelandii против заболеваний овощных культур 120
7. Изучение способов хранения штаммов-антагонистов 124
7.1. Способность штаммов Azotobacter vinelandii к синтезу экзополисахаридов 129
8. Производственные испытания биопрепарата «Азолен» 131
Заключение 133
Выводы 135
Список литературы 136
Приложения 197
- Влияние интродукции бактерий p. Azotobacter в прикорневую систему растений на их развитие и продуктивность
- Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий p. Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов
- Влияние интродукции штаммов-антагонистов рода Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы
- Производственные испытания биопрепарата «Азолен»
Введение к работе
Актуальность проблемы. Способностью образовывать токсины обладают многие почвенные микромицеты, в том числе различные виды фузариев. По данным ФАО (Food and Agriculture Organization of the United Nations) 25% урожая зерновых культур загрязнено микотоксинами, которые наносят значительный вред здоровью людей (Ф. Муно и др., 2002). Приемы защиты культурных растений от грибных фитопатогенов основываются на использовании химических протравителей семян, что также приводит к загрязнению производимой продукции и окружающей среды. Создание комплексного микробиологического препарата, сочетающего возможность защиты растений от патогенов, стимуляцию их роста за счет синтеза фитогормонов и обогащения почвы азотом, является альтернативой химическим фунгицидам с точки зрения экологически чистого земледелия.
Бактерии рода Azotobacter являются эффективными стимуляторами разных видов растений (И.А. Дегтярева и др., 2001; S. Sindhu et al., 1994; А.Ф. Антилчук и др., 1985), что объясняется: их способностью фиксировать молекулярный азот; синтезировать витамины и гормоны роста (Л.Н. Олюнина и др., 1999; J. Gonzalez-Lopez et al., 1986; М. Lee et al., 1970); проявлять биоконтролирующую активность фитопатогенов за счет продуцирования антибиотиков (Придачина и др., 1982; Ки-mari Lakshmi et al., 1972), способностью некоторых штаммов азотобактера моби-лизовывать труднорастворимые соединения фосфора, улучшая фосфорное питание растений (V. Kumar et al., 2000; N. Narula et al., 2000; Д.П. Баженов и СП. Чернышев, 1999), а также ослаблять действие на прорастающие семена неблагоприятных факторов (Т.В. Лихолат и Т.К. Шишова, 2000). Использование биоудобрений на основе азотобактера способствует увеличению количества и улучшению качества урожая (J. Wyszkowska, 1999; J. Kucharski et al., 1997). Бактерии p. Azotobacter способны колонизировать ризосферу различных растений (Н.Н. Мальцева и др., 1992), а также стимулировать деятельность аборигенной микрофлоры (Пат. 2177466, РФ). Биологические препараты на основе азотобактера позволяют значительно снизить расход азотных удобрений (М. Govedarica et al., 1997). Поэтому поиск новых штаммов азотфиксирующих бактерий, проявляющих антагонистическую активность по отношению к грибным фитопатогенам, обладающих комплексом свойств благоприятно воздействующих на растения, и перспективных с точки зрения создания биопрепаратов является актуальной задачей прикладной микробиологии.
j их:. НАЦИОНАЛЬНАЯ I
j БИБЛИОТЕКА 1
Цель исследований. Выделение новых штаммов бактерий p. Azotobacter, обладшощих широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микромицетам и перспективных для создания на их основе биопрепарата, для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и увеличения урожайности. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
-
Выделить из почвы новые штаммы бактерий-антагонистов p. Azotobacter и охарактеризовать выделенные штаммы по видовой принадлежности, спектру антагонистической активности, влиянию на фитопатогенные микроминеты, уровню ншрогеназной активности.
-
Изучить природу выделяемых штаммами азотобактера метаболитов, обладающих фунгицид ной активностью.
3. Изучить в лабораторных и полевых условиях приживаемость и динамику
развития популяций штаммов-антагонистов, интродуцированных в ризосферу раз
личных растений.
4. Оценить эффективность применения выделенных штаммов азотобактера для
улучшения развития культурных растений и защиты их от болезней.
Научная новизна. Выделены три новых штамма (Azotobacter vinelandii ИБ 1, Azotobacter vinelandii ИБ 3, Azotobacter vinelandii ИБ 4), обладающие широким спектром антагонистической активности к фитопатогенным микромицетам.
Проведена генетическая паспортизация выделенных штаммов A.vinelandii.
Показано, что выделенные штаммы азотобактера продуцируют фитогормо-ны.
Доказано, что антагонистическое воздействие штаммов A. vinelandii связано с продуцированием веществ антибиотической природы. Определено, что выделенные метаболиты представляют собой политиофосфаты тетрааминосахарозы и относятся к группе ранее неописанных в литературе метаболитов с антибиотической активностью. Штаммовые различия метаболита определяются величиной поли-тиофосфатного остатка.
Установлено, что интродуцированные бактерии-антагонисты способны приживаться в прикорневой зоне обработанных растений, сохраняя на высоком уровне антагонистическую и нитрогеназиую активности, не угнетая аборигенную микробиоту.
Практическая значимость. На основе штамма бактерий A.vinelandii ИБ 4 разработан новый биопрепарат «Азолен». Препарат предназначен для защиты сельскохозяйственных культур от грибных фитопатогенов и стимуляции роста. Проведен комплекс испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, опре-
деливших эффективность нового биопрепарата. В настоящее время биопрепарат «Азолен» находится на стадии регистрации в Госхимкомиссии Российской Федерации.
Апробация работы. Результаты работы доложены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и II Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), II научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, д.с.-х.н., профессора Ю.А.Усманова «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции «Биотехнологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, получено 2 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов, списка используемых источников литературы и приложения. Работа изложена на 156 страницах, содержит 27 таблиц и 11 рисунков. Список использованной литературы представлен 185 наименованиями, из них 64 на иностранных языках.
Влияние интродукции бактерий p. Azotobacter в прикорневую систему растений на их развитие и продуктивность
Один из важнейших законов экологии, сформулированный Коммоне-ром гласит, что «природа знает лучше», поэтому принципиально важно выяснить, как реализуется феномен защиты естественной биоты корневой системы растений от патогенных организмов, угнетающих рост растения-хозяина (Соколов, 1995). Микробиологические сообщества, формирующиеся на поверхности корня и в прикорневой зоне, оказывают значительное влияние на рост и развитие растений. Так, значительная численность фитопато-генных микроорганизмов в прикорневой зоне создает повышенный риск заболевания, а усиленная конкуренция непатогенных популяций, наоборот снижает этот риск (Дьяков, 2002; Звягинцев и др., 1993; Lynch, 1990; Brown, 1974). Особенно благоприятно воздействие ростстимулирующих ризобакте-рий (PGPR) — универсальных симбионтов высших растений, повышающих адаптивный потенциал своих хозяев за счет ряда механизмов - фиксации молекулярного азота, мобилизации труднодоступных питательных веществ почвы, защиты корней от патогенов, синтеза фитогормонов и витаминов. Использование таких микроорганизмов для инокуляции культурных растений является одной из перспективных агротехнологий, которая способна обеспечить эффективный биоконтроль патогенов и тем самым минимизировать использование фунгицидов в сельском хозяйстве (Андреюк и др., 1999; Мухор-тов, 1996; Егоров и др., 1994; Пат. 2177466). Антагонистические функции бактерий, также как и другие полезные признаки, связанные со стимуляцией развития растений, наиболее полно проявляются при наличии у бактерий способности активно колонизировать корни (Кравченко и др., 2002; Васюк, 1995; Bowen et al., 1976). Установлено, что метаболиты, продуцируемые микроорганизмами в прикорневой зоне растений, могут не только улучшать состояние растений и повышать урожайность сельскохозяйственных культур, а также способны влиять на качественные характеристики продукции — увеличивают содержание белков, незаменимых аминокислот и витаминов (Дегтярева и Чернов, 2001; Ожиганова, 1993; Красильников, 1958).
Бактерии рода Azotobacter относятся к семейству Azotobacteriaceae, которое объединяет рода склонные к изменению морфологии в зависимости от возраста культуры и условий культивирования. Бактерии данного рода обитают в почве, воде, на поверхности растений и являяются хеморганотрофа-ми, также они способны образовывать цисты. Азотобактер, является первым аэробным микроорганизмом, у которого была обнаружена способность к фиксации молекулярного азота, а также первым родом бактерий, у которых обнаружена способность к синтезу фитогормонов (Мишустин, 1956).
Прежде всего, благоприятное воздействие бактерий p. Azotobacter на высшие растения связывают с их способностью улучшать азотное питание растений и продуцировать биологически активные вещества подавляющие патогены и стимулирующие рост растений (Yates et al., 1997; Click, 1996; Gu-ruraj et al., 1994). Стимулирующее влияние азотобактера на рост растений, также может быть связано с возможностью некоторых штаммов мобилизо-вывать труднорастворимые соединения фосфора. Тем самым, обеспечивая растениям дополнительное фосфорное питание, о чем свидетельствуют работы ряда авторов (Рой и др., 2000; Narala et al., 2000; Kumar & Narula, 2000; Kumar et al., 1999; Бажанов и Чернышев, 1999).
Степень положительного влияния интродуцированных штаммов азот-фиксирующих бактерий на сельскохозяйственные растения часто тесно зависит от вида, и даже сорта растения, а также способности штамма колонизировать корни в течение вегетационного периода (Мухортов и Рябчикова, 1996; Мальцева и др., 1992; Квасников др., 1959). Поскольку заселение корней интродуцированными штаммами определяется не только пассивной колонизацией, связанной с ростом корня, но и наличием активной колонизации бактериями-интродуцентами корневой поверхности, поэтому для успешного заселения надо не только оптимально подбирать бактериальный штамм, способный преодолеть конкурентные взаимоотношения на корневой поверхности, но также вид и сорт растения- хозяина (Кравченко и др., 1993; Rovira, 1985).
Большинство штаммов бактерий p. Azotobacter являются свободножи-вущими микроорганизмами, т. е. они не способны проникать в ткани растений, поскольку живут в ризосфере и вплотную зависят от вида и величины корневого опада, конкурируя с остальными обитателями ризосферы. В то же время, индийскими учеными, изучающими влияние азотобактера на растения сообщается, что был обнаружен штамм A. chroococcum, способный проникать в зону гистосферы (эндоризосферы) и размножаться в ней. Данное свойство, предположительно было связано с воздействием на клеточную стенку растений пектинолитических ферментов, продуцируемых выделенным штаммом (Sharma et al., 1985). О способности азотобактера продуцировать разнообразные гидролитические ферменты сообщается в работе (Ко-лешко, 1973), в которой авторами было определено, что наиболее выраженная ферментативная активность характерна для свежевыделенных штаммов азотобактера. Для большинства изученных штаммов была характерна амилолитическая активность, реже встречается протеолитическая и фосфолипазная активности. Причем был отмечен интересный факт, что наиболее активно фиксировали азот и синтезировали витамины, штаммы выделенные из ризосферы картофеля и бобов, что, возможно, связано с их высокой амилолитической активностью, что способствует развитию азотобактера в естественной среде, где простые углеводы встречаются гораздо реже, чем крахмал. Поэтому, неслучайно, для выделения активных штаммов с высокой степенью колонизирующей способности часто используется метод активной селекции с корней определенных растений (Кравченко и др., 2002; Кузнецова и др., 1998; Берестецкий и др., 1994). Так, 1998; Берестецкий и др., 1994). Так, авторами был выделен ряд диазотрофов pp. Azotobacter и Azospirillum из ризосферы амаранта, томатов и зеленных культур и в дальнейшем установлено, что химический состав листьев при инокуляции выделенными диазотрофами отличался повышенным содержанием основных компонентов протеина и белкового азота, что говорит об эффективности азотфиксации в ризосфере корней (Дегтярева и Врачев, 2001).
Эффективность колонизации корневой системы азотобактером определяется видом растения хозяина, сообщается, что экссудаты некоторых растений угнетают жизнедеятельность азотобактера, в частности, экссудаты томатов и некоторых сортов пшеницы (Рубенчик, 1960). Показано, что колонизация зависит и от типа почвы, чем беднее почва, тем активнее колонизирующая способность почвенных микроорганизмов, поскольку бедные почвы хуже обеспечены органическим веществом и микроорганизмы вынуждены теснее ассоциировать с растениями (Квасников, 1959). Так, сообщается, что в дерново-подзолистой почве колонизация корней ржи и ячменя азотобактером, была выше, чем в черноземе (Мальцева и др., 1992). Также установлен факт, что чем более развитым фотосинтетическим аппаратом обладает растение, и чем больше органического вещества оно транспортирует в прикорневую зону, тем интенсивнее происходит процесс несимбиотической азотфиксации. Таким способом, растение обеспечивает себе усиление притока доступных форм азота в клетки корня растений (Звягинцев и др., 1993, Умаров, 1986).
Большое количество работ посвящено положительному влиянию инокуляции посадочного материала сельскохозяйственных культур штаммами азотфиксирующих бактерий, в том числе бактерий p. Azotobacter (Sudhakar et al., 2000; Shanshoury, 1995; Shanky, 1990; Zaki et al., 1992). Так, положительное влияние на прорастание и устойчивость к заболеваниям семян огурца было отмечено на уровне высокого инфекционного фона в условиях закрытого грунта (Антипчук и др., 1985). Инокуляция смешанной культурой состоящей из штаммов псевдомонад и азотобактера повысила урожай огурца на 44% (Егоров др., 1994). Обработка семян огурца азотфиксирующей бактерией Clostridium sp. стимулировала их развитие, причем при двухкратной обработке стимуляция была более очевидной, обработанные растения зацвели на 10 дней раньше контрольных растений (Полянская и др.., 2002). На основе штамма Azotobacter chroococcum было разработано удобрение под огурцы, которое не только стимулировало рост растений, но и снижало содержание нитратов в плодах (Пат. 2074157)
Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий p. Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов
В результате обширного скрининга из различных источников было изолировано около 700 штаммов микроорганизмов p. Azotobacter, антагонистическую активность по отношению к Bipolaris sorokiniana проявили 8 изо-лятов, только 3 штамма проявили антагонизм по отношению к патогенам принадлежащим к p. Fusarium. Источниками выделения служили преимущественно почвенные образцы, отобранные в весенний и осенний периоды, поскольку влажность почвы в это время оптимальна для активного роста азотобактера (Мишустин, 1968; Рубенчик, 1960). Всего было исследовано 118 образцов: 65 образцов пахотных земель из различных районов Башкортостана, в том числе Салаватского, Мелеузовского, Уфимского, Мечетлинского, Туймазинского районов; 5 образцов из Краснодарского края (г.Адлер, г.Анапа); 5 образцов из Московской области; 21 образец из ризосферы культурных растений (картофель, свекла, морковь, пшеница, огурцы, томаты, лук, люцерна); 12 образцов с опытно-заливных станций, с разной степенью увлажнения, 10 образцов почв с добавлением органических удобрений (навоз, куриный помет).
Новые штаммы, исследуемые в работе были выделены из почв, находящихся в сельскохозяйственном использовании. Характеристика источников выделения штаммов антагонистов представлена в табл.3.1.
Микроорганизмы p. Azotobacter характеризуются многообразием физиологических функций, проявление которых зависит от экологических условий. Изучение морфологических особенностей культур азотобактера, представленное в табл. 3.3, показало, что выделенные штаммы активно растут на средах, не содержащих азот, обладают подвижностью и способностью к цистообразованию.
Важнейшие диагностические характеристики, обнаруженные в процессе идентификации данных изолятов, представлены в табл. 3.4. Изучаемые штаммы азотобактера представляют собой аэробные, грамотрицательные палочки.
На твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, штаммы 1, 3, 4 образуют крупные слизистые, иногда морщинистые колонии; отличаются крайне широким спектром потребления источников углерода -сахара, спирты, органические кислоты, растут на среде с 0,15 % бензойно-кислого натрия (табл. 3.5). Не растут (№1,3) или проявляют слабый рост (№4) на белковых средах, спор не образуют, но имеет место цистообразова-ние, фиксируют молекулярный азот, каталазоположительные, в молодой культуре все штаммы подвижны. В соответствии с культуральными свойст 61
вами штаммы 1, 3, 4 были отнесены к роду Azotobacter (Bergy, 1997; Мишу-стин, 1968; Рубенчик, 1960).
Согласно определителю бактерий Bergy из всех видов азотобактера только бактерии, относящиеся к Azotobacter vinelandii, используют рамнозу в качестве источника углерода (табл. 3.5); кроме того, представители этого вида на среде дефицитной по железу образуют флуоресцирующий пигмент. Оба эти свойства были отмечены у всех трех выделенных изолятов.
Еще одной из отличительных черт, характерных для бактерий вида А. vinelandii, является выделение экзополисахаридов на богатых питательных средах (Vargas-Garcia, 2002; Parente at al., 1998; Beale & Foster, 1996; Гринберг и др., 1991; Brivonese at al., 1989; Anderson at al., 1987; Краснопевцева и др., 1987; Horan at al.,1981). Штаммы 1 и 3 проявили эту способность при росте в жидкой культуре на картофельно-глюкозной среде и на среде Федорова с мелассой в качестве источника углерода, штамм 4 на этих средах также продуцировал экзополисахарид, но в меньшей степени.
По совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков новые штаммы 1, 3, 4 были идентифицированы как Azotobacter vinelandii и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под № ИБ 1, № ИБ 3, № ИБ 4.
Таким образом, были выделены и идентифицированы три новых штамма p.Azotobacter: A. vinelandii ИБ 1, A. vinelandii ИБ 3, A. vinelandii ИБ 4, проявляющих антагонистическую активность к широкому спектру фитопато-генных грибов.
Влияние интродукции штаммов-антагонистов рода Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы
Ризосфера растений представляет собой специфическую эконишу, характерной особенностью которой является поступление питательных веществ за счет экзоосмоса корней. Корневые выделения содержат небольшие количества разнообразных соединений, включая сахара, аминокислоты, пептиды, ферменты, витамины, органические кислоты и др. Постоянное поступление питательных веществ стимулирует развитие микроорганизмов в зоне ризосферы (Звягинцев, 1987).
Известно, что PGPR-бактерии влияют не только на рост и развитие растений, но и могут принимать участие в формировании микробных ассоциаций ризосферы (Калько и Воробьева, 2001). Для успешной борьбы бактерий-антагонистов с возбудителями грибных болезней растений необходимо, чтобы интродуцируемые в ризосферу полезные микроорганизмы обладали способностью к формированию стабильных популяций.
В 2002 г в полевом эксперименте мы определяли влияние интродуци-рованных штаммов-антагонистов p. Azotobacter на численность аборигенной микробиоты ризосферы пшеницы сорта Жница. В эксперименте изучалось также воздействие на микробиоценоз со стороны известных биопрепаратов: Агат-25К и Фитоспорин, а также химического фунгицида широкого спектра действия Феразим.
Изучение динамики численности микроорганизмов ризосферной зоны пшеницы показало, что предпосевная обработка семян пшеницы всеми видами препаратов, за исключением Фитоспорина, привела к снижению численности грибов в ризосфере в начальной фазе развития растений (табл. 4.1.). Причем, показано, что препараты на основе изучаемых штаммов азотобактера сопоставимы по эффективности подавления развития микромицетов с известным биопрепаратом Агат-25 К и химическим фунгицидом Феразим. Отмечено влияние азотобактера на увеличение численности в ризосфере микроорганизмов p. Bacillus (табл. 5.5). Для штамма A. vinelandii ИБ 4 в фазе третьего листа и в фазе восковой спелости выявлено увеличение количества спорообразующих микроорганизмов в ризосфере пшеницы в 5 раз по сравнению с контрольным вариантом. Стимуляцию популяции бацилл можно объяснить наличием механизма положительного взаимодействия по типу комменсализма, т.е. взаимно благоприятного влияния сопутствующих бактерий. В частности, для бактерий Azotobacter vinelandii был отмечен такой специфический механизм отношений с Bacillus circulans, при котором наблюдалось увеличение численности бацилл и увеличение азотфиксации в 2-3 раза (Белимов и Кожемяков, 1992). Биопрепараты Фитоспорин и Агат-25К также способствовали увеличению численности бацилл в ризосфере пшеницы в середине вегетации.
Анализ динамики общей численности микроорганизмов выявил достоверную стимуляцию в ризосфере растений обработанных штаммами ИБ 1 и ИБ 4 на ранней стадии роста пшеницы (табл. 5.5). Достоверное увеличение популяции олигонитрофильных микроорганизмов в фазе третьего листа было отмечено во всех вариантах обработки штаммами азотобактера.
Таким образом, интродукция штаммов-антагонистов p. Azotobacter в прикорневую зону пшеницы сорта Жница не угнетала жизнедеятельность аборигенной бактериальной микрофлоры, негативное влияние было отмечено только для микромицетов, что, по видимому, объясняется спецификой действия метаболитов, вырабатываемых штаммами-антагонистами.
В полевом сезоне 2003 г. было изучено влияние интродукции штамма A. vinelandii ИБ 4 на аборигенную микрофлору ризосферы пшеницы сорта Жница, в качестве эталона был выбран препарат Фитоспорин, как наиболее распространенный биопрепарат в нашем регионе. Поскольку полевой сезон 2003 г был очень засушливым, численность всех групп микроорганизмов, кроме почвенных грибов, была на порядок ниже по сравнению с 2002 г. Как и в 2002 г было отмечено увеличение численности спорОобразующих бактерий в фазе полной спелости для вариантов с обработкой штаммом A. vinelandii ИБ 4, и во всех фазах роста при инокуляции Фитоспорином. Стимуляция при обработке Фитоспорином объясняется тем, что основой данного препарата служат бациллы, которые очевидно стали преобладающей группой в ризосфере развивающихся растений. Общая численность микроорганизмов в фазе третьего листа была достоверно выше в контрольном варианте по сравнению с вариантами обработки Фитоспорином и штаммом азотобактера, но уже в фазе кущения и восковой спелости общая численность микроорганиз-мов достоверно превысила контрольное значение в варианте с обработкой А. vinelandii ИБ 4.
Численность этой группы микроорганизмов при обработке Фитоспорином несколько превысила контрольное значение только в фазу восковой спелости. Замеченная стимуляция штаммом азотобактера общей численности в ризосфере пшеницы, возможно, объясняется способностью штамма продуцировать некоторые факторы роста и обеспечивать прикорневую зону растения конечными продуктами фиксации молекулярного азота.
Численность олигонитрофильных микроорганизмов оставалась невысокой на протяжении всего вегетационного периода, что возможно связано с чувствительностью данной группы к недостатку почвенной влаги, наблюдаемому в данном сезоне. В варианте с штаммом азотобактера ИБ 4 было отмечено существенное увеличение числа олигонитрофилов в фазе кущения в 10 раз по сравнению с контрольным значением (табл 5.6), очевидно, за счет успешного развития интродуцента.
Также как в 2002 г, были получены достоверные результаты по влиянию интродукции штамма ИБ 4 на численность почвенных микромицетов. В отличие от сезона 2002 г, было отмечено снижение численности данной группы в фазах третьего листа и кущения для данного варианта. Полученные результаты позволяют сделать вывод о способности данного штамма препятствовать распространению патогенов в период активного роста растения, когда корневая система наиболее уязвима для грибных инфекций. Как и в 2002 г. не было получено достоверных отличий с контролем по влиянию обработки биопрепаратами на численность почвенных актиномицетов.
Таким образом, изучение на протяжении двух вегетационных сезонов влияния интродукции штаммов-антагонистов на аборигенную микробиоту ризосферы пшеницы не выявило негативного воздействия на основные группы данной экологической ниши. Отмечено стимулирующее воздействие штамма A. vinelandii ИБ 4 на спорообразующие микоорганизмы, и подавление на ранних этапах развития растения группы почвенных микромицетов.
Производственные испытания биопрепарата «Азолен»
Поскольку штамм A. vinelandii ИБ 4 в различных испытаниях на сельскохозяйственных культурах показал более высокие результаты по сравнению с другими штаммами-антагонистами, он был выбран в качестве основы для микробиологического препарата «Азолен».
Для предприятия-производителя на были подготовлены лабораторный регламент и техническое задание микробиологический препарат Азолен. На основе этих документов ГУП «Опытный завод АН РБ» разработал, согласовал с контролирующими организациями и утвердил Технические условия на микробиологическое удобрение «Азолен» (ТУ № 9291-018-22657427-2003 ).
В соответствии с ТУ на ГУП «Опытный завод АН РБ» были наработаны опытно-промышленные товарные партии биопрепарата Азолен, использованные при проведении производственных испытаний.
На посевных площадях производственных объединений Мелеузовского района Республики Башкортостан в 2002-2003 гг. были проведены производственные испытания биопрепарата «Азолен», акты испытаний приведены в Приложении.
В 2003 г. в СПК-колхоз им. Салавата прошли испытания биопрепарата Азолен на посевах озимой пшеницы Безенчукская 380. Эффективность применения препарата «Азолен» выразилась в снижении развития корневых гнилей в фазу цветения на 5,3%, а урожайность повысилась на 5,2% по сравнению с урожаем, полученным с контрольных участков.
По результатам вегетационных опытов был сделан вывод о необходимости изучения эффективности использования биопрепарата «Азолен» на овощных культурах в условиях производственных испытаний.
В 2003 г. в тепличном хозяйстве ГУ СП «Рощинский» Республики Башкортостан были обработаны по вегетации растения томата сорта Гамаюн. Обработка заключалась в опрыскивании вегетирующих растений 3 % водным раствором биопрепарата «Азолен». Всего за период вегетации было проведено 3 обработки. В результате проведенных обработок растений томатов на опытных участках отмечена стимуляция роста растений, более раннее созревание плодов. В Приложении приведены данные по текущему урожаю томатов за двое суток в период завершения вегетации. Отмечено, что в результате обработок биопрепаратом «Азолен» урожайность томатов возросла на 16% по сравнению с контролем.
Также в 2003 г. биопрепарат «Азолен» прошел производственные испытания на томатах закрытого грунта в тепличном хозяйстве ГУСП СВХ «Алексеевский». Технология применения биопрепарата заключалась как в предпосадочной обработке семян и рассады растений, так и обработке веге-тирующих растений (полив под корень и опрыскивание). Опытные и контрольные растения томатов сорта Энерго выращивались в условиях одной теплицы, посадочная площадь под опытные образцы растений, обрабатывав-мая биопрепаратом, составляла 920 м , посадочная площадь под контрольными растениями, выращиваемыми по обычной технологии, принятой в ГУП СВХ «Алексеевский», составляла 3680 м2. Анализ результатов по сбору урожая томатов с опытных и контрольных секций теплицы показал, что прибавка урожая в количестве 322,5кг (5,4%) получен на участке, где осуществлен комплекс обработок биопрепаратом «Азолен».
Таким образом, производственные испытания биопрепарата «Азолен» в условиях защищенного грунта на томатах сортов Гамаюн и Энерго показали эффективность его использования, выразившуюся в повышении урожайности этой сельскохозяйственной культуры.
