Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микробные сообщества биоценозов, подверженных углеводородному загрязнению 10
1.1. Воздействие нефтяного загрязнения на живые организмы 10
1.2. Воздействие нефти и нефтепродуктов на почвенные микробоценозы 12
1.3. Углеводородокисляющие микробоценозы водных экосистем 20
1.4. Пути метаболизма углеводородов 23
1.4.1. Аэробное окисление 23
1.4.2. Неполное окисление 28
1.4.3. Деградация углеводородов смешанными культурами микроорганизмов 33
1.4.4. Анаэробное окисление 34
Глава 2. Биология пурпурных бактерий 36
2.1. Систематика 36
2.2. Аноксигенный фотосинтез 38
2.3. Метаболизм на свету 40
2.4. Метаболизм в темноте 45
2.5. Использование соединений азота и серы 47
2.6. Экология пурпурных несерных бактерий 48
Экспериментальная часть
Глава 3. Объекты и методы исследования 52
3.1. Отбор почвенных образцов 52
3.2. Определение содержания нефтепродуктов в почвенных образцах 53
3.3. Определение численности почвенных микроорганизмов 53
3.3.1. Определение количества фотогетеротрофных бактерий 53
3.3.2. Определение численности аэробных хемотрофных нефтеокисляющих микроорганизмов 55
3.4. Выделение чистых культур пурпурных бактерий 56
3.5. Исследование морфологии клеток пурпурных бактерий методом электронной микроскопии 58
3.6. Изучение физиологических признаков выделенных штаммов 58
3.7. Определение сульфида в культуральной жидкости 60
3.8. Постановка опытов по интродукции пурпурных бактерий в почву 61
3.9. Вьыснение влияния нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий 62
3.10. Исследование анаэробной и аэробной ассимиляции углеводородов 63
3.11. Исследование роста пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов и совместного роста с грибами 64
3.12. Определение количества органических кислот в культуральной жидкости нефтеокисляющих грибов 65
3.13. Постановка опытов для выяснения влияния лизата клеток пурпурных бактерий на рост аэробной нефтеокисляющей актинобактерии 67
3.14. Постановка опыта по определению возможности совместной ассимиляции дизельного топлива актинобактерией Dietzia maris и пурпурными бактериями штамма S1 67
3.15. Статистическая обработка результатов 69
Глава 4. Результаты и обсуждение 70
4.1. Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в почвах 70
4.2. Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в грунте 78
4.3. Характеристика штаммов пурпурных бактерий, вьщеленных из загрязнённых почвенных проб 80
4.3.1. Морфология клеток 80
4.3.2. Физиологические свойства выделенных штаммов 90
4.3.3. Дополнительные акцепторы электронов 98
4.4. Интродукция пурпурных бактерий в почву 103
4.5. Влияние нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий. Возможность ассимиляции пурпурными бактериями углеводородов 106
4.6. Рост пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов. Совместный рост с грибами 112
4.7. Создание искусственных ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов и пурпурных несерных бактерий 117
Заключение 122
Выводы 128
Список литературы 130
- Воздействие нефти и нефтепродуктов на почвенные микробоценозы
- Экология пурпурных несерных бактерий
- Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в почвах
- Влияние нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий. Возможность ассимиляции пурпурными бактериями углеводородов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкое применение в хозяйственной деятельности человека нефти и нефтепродуктов приводит к загрязнению окружающей среды различными углеводородами. Поданным А.М. Рябчикова (1974), при добыче и переработке нефти, а также при использовании нефтепродуктов во всем мире ежегодно теряется 45 х 106 тонн углеводородов. Возрастающие масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды приводят к необходимости поиска методов борьбы с этими поллютантами. Главными природными деструкторами нефти и нефтепродуктов являются углеводородокисляющие микроорганизмы. Поиск непосредственных деструкторов нефти или микроорганизмов, ускоряющих в смешанных культурах процессы потребления углеводородов, например, благодаря способности к фиксации молекулярного азота - важная задача экологической биотехнологии.
Помимо методов рекультивации, предусматривающих интродукцию углеводородокисляющих микроорганизмов в экосистему, большое значение приобретают методы, основанные на стимуляции естественной нефтеокисляющей микрофлоры (Коронелли, 1996). Поэтому необходимо изучать все группы микроорганизмов, способные участвовать в деструкции нефти и нефтепродуктов.
Исследованию микроорганизмов, ассимилирующихуглеводороды, посвящено огромное количество научных публикаций. Большинство авторов сосредоточили все внимание на аэробных хемогетеротроф-ных бактериях и грибах. Сведения о возможном участии в биодеградации нефти фотогетеротрофных микроорганизмов очень ограничены. В тоже время в литературе можно найти сообщения о распространении бактерий, способных к фотогетеротрофному росту в пластовых водах нефтяных месторождений, хотя причины этого явления окончательно не установлены (Розанова, Худякова, 1970; Розанова, 1971а). В обзоре, посвященном использованию аноксигенныхфототрофных бактерий в биотехнологии (Sasikala, Ramana, 1995), приводятся данные о возможности роста пурпурных бактерий на средах с нефтепродуктами и об использовании этих микроорганизмов для очистки вод, загрязненных углеводородами.
Фотогетеротрофные пурпурные бактерии ранее объединяли в группу пурпурных несерных бактерий (сем. Rhodospirillaceae). Данные геносистематики позволили отнести большую часть этих микроорганизмов к а-подклассу к Prntenhnctprin <$.\ягк?Ь,тят\А\ pin!.. )
Пурпурные несерные бактерии обладают большим разнообразием метаболических путей и таким свойством, как способность к азотфик-сации. Большой интерес может представлять их участие в биодеградации нефти в составе смешанных микробных культур или как самостоятельных деструкторов углеводородов. Совершенно неизученным остается вопрос о распространении этих микроорганизмов в почвах и грунтах, подверженных нефтяному загрязнению.
Цель настоящего исследования- изучение закономерностей распространения фотогетеротрофных пурпурных бактерий в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и оценка роли этих микроорганизмов в биодеградации углеводородов.
Основные задачи исследования:
Выявить наличие фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Определить их численность в этих природных субстратах в зависимости от величины углеводородного загрязнения, сравнить численность пурпурных бактерий с количеством аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов.
Выделить из загрязненных биоценозов чистые культуры фотогетеротрофных пурпурных бактерий и описать их физиологические и морфологические свойства с целью установления систематической принадлежности.
Установить способность этих бактерий использовать нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии.
Выяснить способность пурпурных бактерий к совместному росту с аэробными нефтеокисляющими микроорганизмами на средах с нефтепродуктами. Установить влияние пурпурных бактерий нарост нефтеокисляющих микроорганизмов и деструкцию ими углеводородов.
Научная новизна. На основании изучения нефтезагрязненных по -чвенных проб, отобранных в разных районах Среднего Урала и Западной Сибири, впервые показано, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии являются частью почвенного микробоценоза в условиях загрязнения нефтью. В результате лабораторных опытов по интродукции штаммов пурпурных бактерий в почву выявлено влияние некоторых факторов на развитие этих микроорганизмов (концентрация дизельного топлива, влажность почвы, освещенность). Впервые выделены чистые культуры пурпурных бактерий из загрязненной почвы, дана их физиологическая характеристика. Установлена возможность метаболического взаимодействия пурпурных бактерий и гетеротрофных нефтеокисляющих грибов и бактерий. Обнаружены штаммы фотоге-
теротрофных бактерий, способных расти в аэробных уеловиях на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об экологии пурпурных бактерий, дают представление об участии этих микроорганизмов в биодеградации углеводородов нефти. Результаты работы показывают, что нефте-загрязненная почва является экологической нишей фотогетеротрофных пурпурных бактерий. Выделенные штаммы этих прокариот могут быть использованы для создания биопрепаратов для борьбы с нефтяным загрязнением на основе ассоциаций с аэробными нефтеокис-ляющими микроорганизмами. Данные о преимущественном развитии этих микроорганизмов в загрязненной почве могут использоваться для разработки методов биоиндикации таких загрязнений.
Основные положения, выносимые на защиту:
В почвах и грунтах при загрязнении сырой нефтью или нефтепродуктами обнаружены фотогетеротрофные пурпурные бактерии, на основании морфологических и физиологических признаков отнесенные кроду Rhodopseudomonas, квидамі^к. acidophila, Rps.palustris.
Причиной развития пурпурных бактерий служит избыток доступных органических веществ (органических кислот), которые образуются при окислении углеводородов нефтеокисляющей микрофлорой, главным образом, мицелиальными грибами.
Живые клетки и лизированная биомасса пурпурных бактерий (штамм Rps. acidophila SI) оказывают стимулирующее воздействие на рост аэробной нефтеокисляющей бактерии Dietzia maris в условиях лимитирования по азоту.
Отдельные представители пурпурных бактерий способны к аэробному росту в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 1999); «Биосфера и человечество» (Екатеринбург, 2000); «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии» (Екатеринбург, 2001); «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001); «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2002); на I Международной межвузовской школе-семинаре «Экология 2000: эс-
тафета поколений» (Москва, 2000); на научных конференциях «Б.П. Колесников - выдающийся отечественный лесовед и эколог» (Екатеринбург, 1999); «Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); на международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 40 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 150 литературных источников, из них 97 отечественных и 53 зарубежных авторов.
Воздействие нефти и нефтепродуктов на почвенные микробоценозы
Хорошо известно, что в низких концентрациях нефть оказывает стимулирующее действие на почвенную биоту, так как она является энергетическим субстратом для большой группы микроорганизмов и содержит вещества, стимулирующие рост и развитие растений. С другой стороны, массированное нефтяное загрязнение почвы, возникающее при аварийных работах, сопровождается острым токсическим действием нефти на живые организмы. Как уже указывалось выше, токсичность нефти определяется главным образом наличием в ней летучих ароматических углеводородов (толуола, ксилола, бензола), нафталинов и некоторых других растворимых в воде фракций нефти. Эти соединения сравнительно легко и быстро улетучиваются из почвы или разрушаются. Поэтому период острого токсического действия нефти на почвенную биоту является относительно коротким. Если в начале второго вегетационного периода после внесения загрязнителя всхожесть семян составляла около 50 %, то в конце этого периода в почвах, загрязненных даже очень высокими дозами нефти (24 л/м ), всхожесть семян практически не отличалась от контроля. С другой стороны, на биологическую продуктивность почв нефть действует в течение более длительного периода времени, о чем свидетельствует, например, снижение урожайности трав на опытных участках (Гузев и др., 1989).
Изменение состава и организации амилолитического микробного сообщества дерново-подзолистой почвы позволило выделить четыре качественно отличных интервала концентраций внесенной в почву нефти, которые соответствуют зонам реакции микробной системы почвы на загрязнение, установленным ранее для различных токсикантов.
Зона гомеостаза микробной системы почвы охватывает диапазон концентраций нефти (0 - 0.7 мл/кг почвы), в котором все показатели стабильны и практически неотличимы от контроля. Общая биомасса микроорганизмов сообщества может несколько возрастать, что свидетельствует о стимулирующем действии низких концентраций нефти на микробиологические процессы в почве.
В зоне стресса (0.7 - 50 мл/кг почвы) значительно меняется организация амилолитического сообщества, так как происходит перераспределение популяций микроорганизмов по степени доминирования. В зоне стресса степень загрязнения почвы нефтью такова, что возникают первые нарушения в микробном сообществе, характерном для данной почвы.
Зона резистенстности определяется диапазоном концентраций нефти (50-300 мл/кг почвы), в котором происходят резкое снижение видового разнообразия и смена состава сообщества. Активно развиваются устойчивые (резистентные) к высоким концентрациям нефти популяции микроорганизмов. В этой зоне негативный эффект от загрязнения почвы приводит к полному изменению доминирующих форм в микробном сообществе, характерном для данной почвы. При дозах выше 50 мл нефти на 1 кг почвы состав сообщества заметно обедняется, в нем, по существу, остаются всего два вида организмов - микромицетов: часто встречающимся является вид Aspergillus ustus, а доминирующее положение занимает вид Penicillium tardum. Об этом почвенном микромицете известно, что он совершенно не характерен для северных дерново-подзолистых почв, а приурочен к более южным почвам, обогащенным органическим веществом. Наконец, зона репрессии микробной системы почв - диапазон концентраций нефти (выше 300 мл/кг почвы), в котором наблюдается полное подавление роста и развития микроорганизмов в загрязненной почве (Гузев и др., 1989).
Углеводородное загрязнение неодинаково влияет на различные группы почвенных микроорганизмов. Прежде всего, необходимо отметить увеличение численности углеводородокисляюших микроорганизмов (УОМ). В условиях практически почти полной репрессии функциональной активности почвенной флоры и фауны определяющая роль в деградации нефтепродуктов в почве принадлежит именно им (Исмаилов, 1988).
При нефтяном загрязнении обнаружено увеличение количества узкоспециализированных форм микроорганизмов, окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические углеводороды. Среди них выявлены представители родов бактерий Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus и аспорогенных дрожжей родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon. Помимо бактерий и дрожжей, в нефтезагрязненных почвах развиваются углеводородокисляющие мицелиальные грибы родов Cunninghamella, Penicillium, Aspergillus, Cladosporium (Гузев и др., 1989; Киреева, 1995).
Численность углеводородокисляющих микроорганизмов возрастает, до определенных пределов, пропорционально концентрации загрязнителя и остается на высоком уровне многие годы после загрязнения почвы. По данным Кузяхметова и Киреевой (1991) в незагрязненном микробоценозе доля У ОМ составляла всего 0.01-0.05 %. Через 10 лет после нефтяного загрязнения в серой лесной почве их численность достигала 38 %. По данным Оборина и соавторов (1986) через 15 лет после загрязнения доля углеводородокисляющих бактерий достигала 45 %, а спустя 25 лет их доля снизилась до 28.5 %, при фоновых значениях 0.1 %.
Менее изучены изменения, происходящие с сапротрофной почвенной микробиотой в результате нефтяного загрязнения почвы. Относительно этой группы микроорганизмов существуют только отрывочные сведения. В одних работах показано, что при загрязнении возрастает доля бактерий, а актиномицетов и грибов - снижается. По другим данным, нефтяное загрязнение почвы вызывает снижение численности актиномицетов, а количество бактерий и грибов возрастает, причем наименее чувствительными являются виды грибов Rhizopus nigricans, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus и Aspergillus ustus (Гузев и др., 1989). Как в почвах, так и в лабораторных опытах, даже низкие концентрации нефтяного загрязнителя достоверно снижали численность актиномицетов. Оказалось, что чем выше доза ксенобиотика, тем большей депрессии подвергается эта группа споровых организмов (Киреева, 1995).
Нефтяное загрязнение приводит к снижению численности в почвах аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Слабая их активность связана с неблагоприятным водно-воздушным режимом, с низким содержанием свежих растительных остатков, с недостатком подвижных соединений азота в загрязненной почве (Киреева, 1995; Исмаилов, 1988).
Влияние нефтяного загрязнения на микроорганизмы, участвующие в круговороте азота в почве, описано в работах Исмаилова (Исмаилов, 1983; Исмаилов, 1988). Резко увеличивается при углеводородном загрязнении численность азотфиксирующих и аммонифицирующих микроорганизмов. Интенсификацию азотфиксации в нефтезагрязненной почве можно объяснить низким парциальным давлением кислорода, так как кислородом ингибируется фермент нитрогеназа. Кроме того, этому процессу способствует увеличение содержания в почве легкодоступного органического вещества - спиртов, органических кислот, аминокислот и др.
При нефтяном загрязнении почв возрастает численность микроорганизмов-денитрификаторов. Интенсификации процессов денитрификации способствует избыток органики и низкий окислительно-восстановительный потенциал. С точки зрения общего направления самоочистки усиление процесса денитрификации - нежелательное явление в нефтезагрязненной почве, так как происходит обеднение почвы азотом, что в условиях резкого увеличения биомассы микроорганизмов и иммобилизации азота служит фактором, определяющим скорость самоочистки. С другой стороны, окисляя продукты частичного разложения углеводородов при сопряженном восстановлении нитратов, денитрификаторы тем самым принимают участие в процессах биодеградации.
Наиболее чувствительны к нефтяному загрязнению нитрифицирующие бактерии. Нитрификаторы - хемолитотрофы очень чувствительны к наличию в среде органических соединений; большое количество легкоусвояемых органических веществ, содержащихся в среде, задерживает их развитие. В незагрязненных почвах не наблюдается больших количеств легкоусвояемого органического вещества. Ситуация меняется при нефтяном загрязнении. Разложение нефти и нефтепродуктов сопровождается увеличением содержания водорастворимых продуктов метаболизма (Исмаилов, 1988).
Нефть, пропитывая почвенные частицы, ухудшает доступ кислорода, в почвенных агрегатах создается значительное количество микрозон с ограниченным доступом кислорода. Понижение концентрации кислорода благоприятствует развитию анаэробных микроорганизмов, например, сульфатредуцентов, вызывающих образование такого токсичного вещества как сероводород (Ямалетдинова, 2002). Одной из причин анаэробиоза в нефтезагрязненной почве является интенсивное потребление кислорода возросшим числом аэробных УОМ (Исмаилов, 1988; Bartha, 1986).
Экология пурпурных несерных бактерий
Экологическими нишами аноксигенных фототрофных бактерий служат бескислородные зоны воды и донных осадков, которые получают свет в достаточном количестве и соответствующего спектрального состава, чтобы обеспечить фототрофный рост. Представители пурпурных несерных бактерий широко распространены в природе и обнаруживаются во всех типов стоячих водоемов, в озерах, в сточных водах, в прибрежных лагунах и в других водных местообитаниях, а также в осадках, влажных почвах и на рисовых полях. Они предпочитают водные экотопы (пресноводные, морские и гиперсоленые) со значительными количествами растворенного органического вещества и низким содержанием кислорода, но. они редко образуют окрашенное цветение, характерное для представителей пупурных серных бактерий. Однако они часто сопутствуют пурпурным серным бактериям, образующим слои в стратитифицированных водоемах. Наибольшее разнообразие видов и наибольшее количество клеток было обнаружено в иле и в воде эвтрофных прудов, канав и озер. В эвтрофных озерах распространение несерных бактерий более или менее ограничено прибрежной зоной, где в пробах ила и воды было обнаружено от 1(Г до 10 клеток на 1 мл. В пелагических водах обычно обнаруживается не более 1 - 10 клеток на 1 мл (Imhoff, Тгіірег, 1991).
Пурпурные несерные бактерии входят в состав аноксигенного фототрофного сообщества в водоемах и участвуют в окислении продуктов первичных анаэробов (Заварзин, Колотилова, 2001).
Некоторые пурпурные несерные встречаются в кислых болотных водах и в почвах. Наиболее часто в таких условиях обнаруживаются Rhodopseudomonas acidophils оптимум роста при рН 5.5, а также Rps. palustris. Этот микроорганизм обычно обнаруживается во влажных гниющих листьях. Эти два вида наиболее часто встречаются в почвах, хотя попытки выделить их из почвы редко приводит к удовлетворительным результатам (Imhoff, Тгіірег, 1991).
Пурпурные несерные бактерии могут быть легко выделены из сточных вод. Их число может возрастать более чем в 50 раз на стадии активного ила по сравнению с необработанными сточными водами (100 х 103 клеток/мл и 2 х 103 клеток/мл соответственно).
Когда анаэробные сточные воды инкубируются на свету, они часто самопроизвольно приобретают красно-коричневую окраску благодаря присутствию фототрофных бактерий (Imhoff, Тгіірег, 1991).
Достаточное число пурпурных несерных бактерий найдено в морских и гиперсоленых экотопах. Они обычно обнаруживаются в воде и осадках приливной зоны, соляных маршей и загрязненных бухт, но не в открытом море. Большинство морских изолятов могут использовать сульфид и тиосульфат гораздо лучше, чем пресноводные изоляты и их устойчивость к сульфиду обычно выше. Большинство пурпурных бактерий, выделенных из морских экосистем являются типичными морскими бактериями и не обнаруживаются в пресных водоемах. Морскими формами являются: Rhodobacter adriaticus, Rhodobacter euryhalinus, Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas marina. К гиперсоленым экотопам адаптированы Rh odospirillum salexigens и Rhodospirillum salinarum (Triiper, Galinski,1986; Jmhoff, Triiper, 1991).
Пурпурные несерные бактерии служат объектами для изучения таких фундаментальных проблем биологии как бактериальный фотосинтез и азотфиксация. В последнее время разрабатываются методы генной инженерии пурпурных бактерий для более эффективного их использования в биотехнологии (Каменева, 1988).
Эти микроорганизмы могут быть использованы для получения белка, а также целого ряда биологически активных веществ (витаминов, фитогормонов, убихинонов) (Serdyuk et ah, 1993; Sasikala, Ramana, 1995). При помощи фотогетеротрофных бактерий можно получать такое экологически чистое топливо как фотоводород (Самуилов, Олескин, 1994; Фёдоров, 2002).
Пурпурные несерные бактерии применяются при очистке сточных вод различного происхождения (Xu et al., 1996; Nagadomi et al., 2000). Rb. sphaeroides и Rh. palustris способны освобождать сточные воды от фосфатов, нитратов, сероводорода и целого ряда токсичных веществ (Sasikala, Ramana, 1995). Эти микроорганизмы способны окислять нафтеновые кислоты (циклогексановую кислоту), ароматические соединения (фенолы, гидроксибензоаты, хлорбензоаты, гиппурат), гетероциклические соединения (Kuver et al., 1995; Michael, Madigan, 2001; Noh et al., 2002). При росте на ароматических кислотах бактерии Rh. palustris могут выделять фотоводород (FiBler et al, 1994; FiiMer et al., 1995).
Сведения об использовании пурпурными углеводородов содержится в патентах. Hitzman (1970) указывает на анаэробное использование пурпурными бактериями углеводородов с числом атомов от 1 до 30. В качестве видов, способных к такой деструкции, называются Rh. palustris, Rb. sphaeroides, Rb. gelatinosa, Rb. capsulatus. Однако более поздних данных об анаэробном метаболизме углеводородов пурпурными бактериями обнаружить не удалось.
В акцептованной заявке Мотида с соавторами (1973) предлагается метод получения коэнзима Qi0 из биомассы пурпурных бактерий Rb. capsulatus, выращенных на углеводородах (смесь гексана, додекана, тетрадекана, октадекана и парафина) или на нефтепродуктах (керосин). Бактерии культивировались в аэробных условиях. В качестве дополнительного источника углерода в среду вносили ацетат.
Кроме того, есть указания на патентованные способы получения витамина Вп при выращивании пурпурных бактерий (Rb. sphaeroides и R. fulvum) на н-тридекане и н-тетрадекане. Витамин В накапливался также при росте смешанной культуры Rhodopseudomonas sp. и Corynebacterium sp. на углеводородах с числом атомов углерода от 15 до 23 (Sasikala, Ramana, 1995).
Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в почвах
В табл. 1-3 представлены результаты определения количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий, аэробных нефтеокисляющих бактерий и нефтеокисляющих грибов в почвах с различной степенью загрязнения углеводородами. В табл. 1 показаны результаты изучения микрофлоры антропогенно изменённых почв г. Екатеринбурга возле эстакад для ремонта автомобилей. В загрязнённых пробах количество углеводородов колебалось в пределах от 0.5 до 16.5 %. Гашев с соавторами (1997) предлагает следующую градацию почв по степени нефтяного загрязнения: менее 10 мае. % нефти — слабозагрязнённые почвы, 10 — 40 мае. % нефти -среднезагрязнённые, более 40 мае. % - сильнозагрязнённые. На этом основании, исследованные пробы могут быть отнесены к слабо- и среднезагрязнённым.
Фотогетеротрофные пурпурные бактерии методом посева на агаризованные питательные среды обнаружены только в загрязнённых пробах. Их количество варьировало от 0.7 до 570 х 10 клеток на 1 г почвы, если определение проводилось на среде с манатом и от 0.3 до 51 х 103 клеток - на среде с бутиратом. В контрольных пробах без нефтяного загрязнения эти микроорганизмы, за одним исключением, обнаружены не были. Эта закономерность была подтверждена в результате постановки накопительных культур. В накопительных культурах с контрольными почвенными пробами рост пурпурных бактерий не наблюдался, при постановке накопительных культур с загрязнёнными пробами на среде ПНБ на свету в анаэробных условиях рост пурпурных бактерий был отчётливо виден.
В отличие от фотогетеротрофных пурпурных бактерий, хемогетеротрофные аэробные нефтеокисляющие бактерии и мицелиальные грибы обнаружены как в пробах с нефтяным загрязнением, так и в контрольных пробах. Количество нефтеокисляющих бактерий на 1 г сухой почвы колебалось от 2 до 65 х 106 клеток в незагрязнённых пробах и от 0.12 до 150x10б клеток в загрязнённых пробах. В пробе с концентрацией углеводородов 11.7 % количество нефтеокисляющих бактерий достигало 990 х 106 клеток/г. Несмотря на то, что в отдельных пробах количество этих микроорганизмов было очень высоким, между чистыми и загрязнёнными пробами не обнаружено статистически достоверных различий (согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни).
Количество колониеобразующих единиц грибов (КОЕ) в контрольных пробах изменялось от 3.4 до 43.5 х 10 КОЕ на 1 г сухой почвы, в пробах с загрязнением - от 2.5 до 159.6 х 10 КОЕ/г. Достоверных различий согласно критерию Манна — Уитни также не обнаружено. Наличие значительного количества нефтеокисляющих микроорганизмов в незагрязнённых пробах связано с тем, что в почвах промышленных городов углеводороды хотя бы в следовых количествах распространяются повсеместно с талыми или дождевыми водами (Кичигин, Быкова, 2002).
Сравнивая результаты определения количества трёх групп микроорганизмов, можно придти к заключению, что количество аэробных нефтеокисляющих бактерий в исследованных пробах было значительно больше, чем количество нефтеокисляющих мицелиальных грибов и фотогетеротрофных бактерий. Именно аэробные нефтеокисляющие бактерии являются главными деструкторами углеводородов в почве. Однако обнаружение пурпурных бактерий в почве уже само по себе может чётко указать на нефтяное загрязнение. На этом основании можно сделать вывод, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии могут служить индикаторной группой на наличие углеводородного загрязнения почвы.
В табл. 2 представлены результаты изучения почвенных проб, отобранных на территории одного из предприятий г. Екатеринбурга в сентябре 2000 года. Полученные данные сопоставимы с результатами табл. 1, при увеличении степени загрязнения почвы наблюдается увеличение количества аэробных нефтеокисляюших бактерий. Пурпурные несерные бактерии обнаружены только в загрязнённых пробах.
На рис. 2 представлены результаты изучения распределения пурпурных бактерий в почвенных горизонтах при углеводородном загрязнении суглинистой почвы (территория предприятия, г. Екатеринбург). В почвенном разрезе №1 содержание углеводородов уменьшалось с 6.1 % в верхнем горизонте (глубина до 2 см), до 0.7 - 1.2 % на глубине 4 - 6 см и 0.1% - на глубине 8-10 см. Количество пурпурных бактерий также уменьшилось с 4.5 х 10б клеток/г почвы до 300 клеток/г почвы. В почвенном разрезе №2 содержание углеводородов уменьшалось от 2.7 % (глубина до 2 см) до 1.0 % (глубина 9—10 см). В этом разрезе углеводороды распределились по глубине более равномерно, чем в слоях разреза №1. Количество пурпурных бактерий во втором разрезе было больше, чем в первом разрезе. В верхнем горизонте - 7.8 х 106 клеток/г почвы, в более глубоком слое (3-4 см) - 0.5 х 10б клеток/г почвы. Максимум численности пришёлся на слой глубиной 5-6 см — 12.6 х 10 клеток/г почвы. В контрольном разрезе (без углеводородного загрязнения) пурпурные бактерии обнаружены не были. Таким образом, фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почве, загрязнённой углеводородами, способны проникать на глубину до 10 см. Их развитие не зависит от света. Распределение этих микроорганизмов в почвенных горизонтах сходно с характером распределения углеводородных поллютантов.
Результаты исследования микрофлоры почв, загрязнённых нефтепродуктами, позволяют высказать предположение, что почвы, которые подвергаются действию углеводородных поллютантов, становятся своеобразной экологической нишей для пурпурных бактерий. Пурпурные бактерии являются частью микробоценоза почв с углеводородным загрязнением.
Фотогетеротрофные пурпурные бактерии обнаружены не только в почвах, загрязнённых нефтепродуктами, но и в почвах, загрязнённых сырой нефтью. В табл. 3 показаны результаты определения количества пурпурных бактерий в загрязнённых пробах из различных регионов (Предуралье, Западная Сибирь). На рис. 3 представлены данные по микрофлоре проб, отобранных в августе 2001 года в районе Тепловского и Мамонтовского месторождений нефти. В контрольных пробах почвы пурпурные бактерии обнаружены не были. В пробах со слабым нефтяным загрязнением (0.3 -6.7%) эти микроорганизмы обнаружены в 80 % проб, при среднем уровне загрязнения - во всех пробах, при сильном загрязнении (выше 40 %) фотогетеротрофные прокариоты не выявлены. Количество аэробных нефтеокисляющих бактерий превосходило количество пурпурных бактерий и мицелиальных грибов. В контроле их численность достигала 0.01 — 38.3 х 10б клеток/г почвы, при слабом загрязнении - 0.6 - 727.3 х 10бклеток/г почвы, при среднем и сильном уровнях загрязнения — 0.57 - 491.8 х 10б клеток/г почвы. Количество грибов при тех же уровнях загрязнения изменялось, соответственно, от 0.4 до 7.7 х 103 КОЕ/г почвы, 3.03 - 517.6 х 103 КОЕ/г почвы, 0.4 - 6039 х 103 КОЕ/г почвы. Результаты изучения проб, загрязнённых сырой нефтью, подтверждают высказанное предположение о том, что пурпурные бактерии становятся частью почвенной микрофлоры при углеводородном загрязнении.
Исследование верхового пушицево-сфагнового торфа, отобранного в районе Саматлорского нефтяного месторождения, показало, что пурпурные бактерии встречаются в этом природном субстрате независимо от наличия нефтяного загрязнения. В контрольных пробах торфа пурпурные бактерии были обнаружены в количестве 2.3 х 10 клеток/г сухого торфа, при загрязнении торфа нефтью в количестве 1 л/м - число пурпурных бактерий достигло 0.4 х 103 клеток/г сухого торфа, при уровне загрязнения 10 л/м2 -51.2 х 103 клеток/г. Пурпурные бактерии являются обычными обитателями торфа, что связано с высокой влажностью на болотах и большим количеством органического вещества в этом субстрате. Благодаря способности к азотфиксации эти прокариоты могут успешно конкурировать с другими гетеротрофными бактериями в условиях верховых болот, отличающихся недостатком азота. Для торфа пурпурные бактерии не могут выступать в качестве индикаторов нефтяного загрязнения. Полученные данные о распространении пурпурных бактерий в торфе согласуются с данными литературы (Imhoff, Triiper, 1991).
Влияние нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий. Возможность ассимиляции пурпурными бактериями углеводородов
Исследовали влияние нефтепродуктов на рост бактерий Rps. acidophila SI, Rps. acidophila S5, Rps. palitstris X. На рис. 28 показано влияние дизельного топлива на рост Rps. acidophila SI на среде ІШБ с малатом и дрожжевым экстрактом на свету в анаэробных условиях. На протяжении пяти пассажей бактерии росли как в отсутствие дизельного топлива, так и с добавлением его в количестве одного объёмного процента. На среде с дизельным топливом наблюдалось некоторое замедление роста (табл. 8). В третьем пассаже константа скорости деления уменьшилась на 30% по сравнению с контролем. Это уменьшение было статистически достоверным согласно t - критерию Стьюдента. В четвёртом и пятом пассажах статистически достоверного уменьшения скорости деления под влиянием дизельного топлива обнаружено не было, следовательно, эти микроорганизмы способны к адаптации к токсическому воздействию нефтепродуктов. При наличии субстрата исследуемые бактерии могут длительное время расти в присутствии такого нефтепродукта, как дизельное топливо. Бактерии Rps. acidophila SI, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X росли на полной среде ПНБ в присутствии дизельного топлива, смазочного и вазелинового масел, хотя на Rps. palustris X угнетающее действие оказали дизельное топливо и вазелиновое масло, на Rps. acidophila S5 - смазочное масло (рис. 29).
При исключении маната и дрожжевого экстракта Rps. acidophila SI не росли на свету в анаэробных условиях на дизельном топливе, керосине, бензине. Если из среды исключался малат, но не дрожжевой экстракт, то рост бактерий S1 при добавлении нефтепродуктов не превышал роста в контроле, т. е. на среде только с дрожжевым экстрактом (рис. 30). Бензин оказал токсическое действие. Количество клеток на среде с бензином в конце опыта было минимальным. Таким образом, бактерии Rps. acidophila SI не способны расти в анаэробных условиях на свету с использованием нефтепродуктов в качестве источника углерода и донора электронов на среде ПНБ.
При изучении использования в анаэробных условиях таких восстановленных соединений как углеводороды, необходимо учитывать роль потенциальных акцепторов электронов. Для сульфатредуцирующих бактерий, способных к анаэробной ассимиляции углеводородов, таким акцептором служит сульфат. Судя по результатам опытов с органическими кислотами (раздел 4.3.3.), для выделенных пурпурных бактерий акцепторами электронов могут служить нитраты, бикарбонат, молекулярный азот. Однако для бактерий Rps. acidophila SI, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X не удавалось наблюдать рост с использованием нефтепродуктов в анаэробных условиях на свету даже на среде с бикарбонатом, нитратом и на среде без азота. Полученные данные показывают, что выделенные пурпурные бактерии не способны к анаэробной ассимиляции нефтепродуктов (дизельного топлива, вазелинового и смазочного масел).
В анаэробных накопительных культурах (с нитратом и бикарбонатом) также не наблюдалось развития пурпурных бактерий на свету. В качестве инокулята для этих культур использовалась почва, загрязненная углеводородами и заселенная пурпурными бактериями (место отбора - в районе г. Сургута и г. Кунгура).Аэробного роста в темноте у бактерий Rps. acidophila SI, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X на углеводородах также не обнаружено. Однако проверка 20 штаммов пурпурных бактерий, выделенных из почв с углеводородным загрязнением, показала, что у бактерий Rps. acidophila М2, Rps. palustris Е8 и у бактерий коллекционной культуры Rps. palustris наблюдается медленный рост в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях. На поверхности агаризованной среды (минеральный фон ПНБ с 1 об.% дизельного топлива) эти бактерии образовывали бесцветные точечные колонии. В табл. 9 представлены результаты изучения роста пурпурных бактерий на жидкой среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях. Через 14 суток прирост белка у бактерий Rps. acidophila М2 превысил контроль на 45%, у Rps. palustris Е8 - на 31 %, у коллекционной культуры Rps. palustris -на 15 %. У трёх других штаммов (Rps. acidophila SI, Rps. acidophila МЗ и Rps. rutila МЮЗ) увеличение количества белка было статистически недостоверным (согласно t — критерию Стьюдента). Приведённые данные свидетельствуют, что у трёх штаммов пурпурных бактерий есть способность к аэробной ассимиляции дизельного топлива в темноте, однако рост на дизельном топливе является гораздо более медленным по сравнению с ростом родококков и псевдомонад.
