Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Рост растений в условиях углеводородного загрязнения почвы и механизмы фиторемедиации
1.1 Общая характеристика углеводородов как загрязнителей окружающей среды 9
1.2 Рост растений в условиях углеводородного загрязнения почвы 14
1.2.1 Фитотоксичность почв, загрязненных углеводородами 20
1.3 Биологическая активность почвы в условиях углеводородного загрязнения
1.4 Фиторемедиация как способ восстановления почв, загрязненных углеводородами
1.5 Методы экстракции и анализа содержания углеводородов в загрязненных почвах
Глава 2. Объекты и методы исследований 42
2.1 Объекты исследований 42
2.1.1 Растения 42
2.1.2 Углеводородные загрязнители 42
2.1.3 Почвы 48
2.2 Методы исследований 48
2.2.1 Проведение анализов 48
2.2.2 Условия проведения экспериментов 51
2.3 Обработка результатов экспериментов 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 58
3.1 Устойчивость культурных и дикорастущих растений к загрязнению почвы углеводородами
3.1.1 Всхожесть семян при загрязнении почвы углеводородами 58
3.1.2 Энергия прорастания семян растений при загрязнении почвы углеводородами
3.1.3 Показатели фитотоксичности загрязненной углеводородами почвы 72
3.1.4 Применение кластерного анализа для классификации растений по степени устойчивости к загрязнению почвы углеводородами
3.1.5 Накопление надземной и корневой биомассы растениями на загрязненной углеводородами почве
3.2 Эффект прямого контакта семян с углеводородами 85
3.3 Оптимизация способа экстракции углеводородов из загрязненного выщелоченного чернозема
3.4. Эффект фиторемедиации на почве, загрязненной углеводородами 98
3.4.1 Влияние вида растения, типа и концентрации углеводородного загрязнителя на степень снижения их содержания в загрязненной почве
3.4.2 Механизмы фиторемедиации 102
3.4.2.1 Поглощение углеводородов корнями растений 102
3.4.2.2 Ризодеградация углеводородов 104
3.4.2.3 Пути трансформации углеводородов почвенными микроорга- НО низмами (на примере 1-метилнафталина)
Выводы 113
Научно-практические рекомендации 115
Список использованной литературы 116
Приложение
- Общая характеристика углеводородов как загрязнителей окружающей среды
- Углеводородные загрязнители
- Всхожесть семян при загрязнении почвы углеводородами
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия на фоне увеличения добычи, транспортировки, переработки и использования нефти и нефтепродуктов существенно возросли уровень и масштабы загрязнения природной среды нефтяными углеводородами (УВ). Наиболее интенсивному химическому загрязнению подвержены почвы. Особенно остро проблема загрязнения земель УВ стоит в Татарстане, где площадь нефтедобывающих территорий составляет 3492,8 тыс. га или 51,5% общей площади республики [122].
Под воздействием аккумулированных в почве УВ происходит трансформация почвенных экосистем [141-145, 189]. Изменения свойств почв и непосредственное воздействие УВ приводят к угнетению или полному инги-бированию роста и развития подавляющего большинства растений; почвы становятся фитотоксичными [163]. Однако исследования устойчивости растений к поллютантам посвящены преимущественно эффекту неорганических (тяжелые металлы, нитраты) и растворимых в воде органических (пестициды) соединений. Имеющиеся данные в отношении действия УВ весьма противоречивы. Недостаточно изучено видовое и сортовое разнообразие растений; работ по загрязнению почвы нефтепродуктами явно недостаточно, из индивидуальных УВ изучают преимущественно полиароматические УВ (ПАУ); наиболее подробно исследована нефть. Знание степени устойчивости растений необходимо, для решения вопросов, с одной стороны, возможности их возделывания на загрязненной почве, а с другой - использования для восстановления нарушенного почвенного плодородия (фиторемедиация).
По сравнению с традиционными способами восстановления загрязненных УВ почв фиторемедиация является экологически более безопасной и экономичной [72, 77]. Между тем эти исследования начаты сравнительно недавно, количество изученных растений и типов углеводородных поллютан-тов ограничено. В литературе приводятся данные о 30-40 видах растений, обладающих установленным эффектом фиторемедиации, из них 75% работ посвящены ПАУ. Это вызвано экспериментальными трудностями изучения
распределения жидких УВ в неоднородной по составу и свойствам почвенной среде, а также сложностей, связанных с их количественным анализом.
Исследования широкого круга как культурных, так и дикорастущих растений в лабораторных и вегетационных экспериментах позволят дать важную информацию, касающуюся их устойчивости в отношении углеводородных поллютантов, и выяснить механизмы их влияния на свойства почв, загрязненных УВ.
Целью работы являлась экспериментальная оценка устойчивости культурных и дикорастущих растений к загрязнению почвы жидкими УВ и выявление влияния устойчивых видов на снижение их содержания в почве (фито-ремедиационный эффект).
Для достижения цели решали следующие задачи:
Количественно охарактеризовать всхожесть и энергию прорастания семян культурных и дикорастущих растений, накопление ими надземной и корневой биомассы в зависимости от типа углеводородных поллютантов, их концентрации, длительности загрязнения почвы и систематической принадлежности растений.
Исследовать эффект прямого контакта покоящихся и прорастающих семян с УВ разной химической природы.
Создать автоматизированную базу данных по всхожести семян на загрязненных УВ почвах и провести на ее основе кластерный анализ для классификации растений по степени устойчивости к загрязнению.
4. Установить значения показателей фитотоксичности загрязненной
почвы: концентраций УВ, вызывающих 10%-ное (ЕСю), 25%-ное (EC2s) и
50%-ное (ЕСзо) снижение всхожести семян.
5. Выявить вклад факторов (тип и концентрация углеводородного пол-
лютанта, продолжительность загрязнения, влажность почвы, тип экстрагента,
длительность экстракции и др.), влияющих на полноту извлечения УВ при
анализе загрязненной почвы, и оптимизировать методику экстракции УВ.
6. Оценить степень снижения содержания УВ в загрязненной почве при выращивании растений и выявить пути реализации эффекта фиторемедиа-ции.
Научная новизна и теоретическая значимость.
Впервые дана количественная оценка изменения всхожести и энергии прорастания семян (44 вида культурных и дикорастущих растений) и накопления надземной и корневой биомассы (14 видов) в условиях загрязнения почвы индивидуальными УВ (представителями алифатических и ароматических классов), их смесями и нефтепродуктом (керосином) в диапазоне концентраций 0,5-15 вес.% на выщелоченном черноземе Республики Татарстан (РТ). Впервые применен метод кластерного анализа в качестве основы для классификации растений по степени устойчивости к углеводородному загрязнению почвы. Впервые для исследованных растений установлены значения показателей фитотоксичности почвы, загрязненной УВ. Показано, что проникновение н-тридекана и 1-метилнафталина в семена является одним из факторов, вызывающих депрессию их всхожести и энергии прорастания.
Количественно охарактеризован фиторемедиационный эффект для растений кукурузы и эспарцета в выщелоченном черноземе. Показано, что в его основе лежит стимуляция микробиологической активности почвы. Идентифицированы промежуточные и конечные продукты трансформации 1-МН микробиоценозом выщелоченного чернозема.
Практическая значимость и реализация результатов исследований.
Классификация растений по степени устойчивости к углеводородному загрязнению почв позволяет рекомендовать использование устойчивых культурных и дикорастущих растений для выращивания в качестве зеленых насаждений.
Выявлены растения, сохраняющие способность к росту в условиях загрязнения и обладающие эффектом фиторемедиации.
Создана автоматизированная база данных по всхожести семян растений в условиях углеводородного загрязнения почвы, которую в дальнейшем
можно расширять и использовать в качестве основы для изучения физиологических, биохимических и экологических факторов устойчивости растений.
Оптимизирована методика извлечения УВ разной химической природы, позволяющая проводить экстракцию с полнотой извлечения более 75% без предварительной подготовки образцов почвы в широком диапазоне концентраций УВ.
Модифицирован метод учета численности углеводородокисляющих микроорганизмов в загрязненном УВ выщелоченном черноземе. Модификация заключалась в подборе оптимальных для данной почвы концентраций индивидуальных УВ в питательной среде.
Апробация. Результаты исследований, изложенные в диссертации, были представлены и докладывались: на международной конференции "Современные проблемы загрязнения почв" (г. Москва, 2004), 6-й международной конференции "Internal Symp.& Exhibition on environmental contamination in Central & Eastern Europe and Commonwealth of Independent States" (г. Прага, 2003), международной конференции "Современные методы эколого-геохимической оценки состояния и изменений окружающей среды" (г. Новороссийск, 2003), 7-й и 8-й Пущинской школах-конференциях "Биология -наука 21-го века" (г. Пущино, 2003, 2004), V и VI Республиканских научных конференциях «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан (г. Казань, 2003, 2004), V и VI международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (г. Пущино, 2003, 2005), международном конгрессе «Биотехнология: состояния и перспективы» (г. Москва, 2005), международной научно-практической конференции «Экология: фундаментальная и прикладная» (г. Екатеринбург, 2005), а также ежегодно - на итоговых научных конференциях КГУ.
Работа Н.Л. Ларионовой «Восстановление городских почв и атмосферы, загрязненных углеводородами, с помощью новых и нетрадиционных растений» удостоена именной стипендии Главы администрации г. Казани (2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 2 статьи в центральных журналах, 13 в сборниках материалов и тезисов докладов международных, всероссийских и республиканских конференций, симпозиумов, конгрессов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, научно-практических рекомендаций, списка литературы (203 источника, из них 104 иностранных) и приложения. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает 1 фотографию, 22 рисунка и 20 таблиц, а также 9 фотографий, 15 рисунков и 7 таблиц в приложении.
Список сокращений, используемых в работе. УВ - углеводороды; ТД - н-тридекан; ТтД - н-тетрадекан; 1-МН - 1-метилнафталин; ДТ - дизельное топливо; АУ - ароматические углеводороды; ПАУ - полиароматические углеводороды; УОМ - углеводородокисляющие микроорганизмы.
Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории почвенно-растительных систем и атмосферы в соответствии с планом госбюджетной темы НИР КГУ № 01200215629 "Развитие теории и прикладных аспектов взаимодействия экзогенных веществ с компонентами природной среды" и в рамках международного гранта МНТЦ #2419, Конкурсного центра по фундаментальным исследованиям в области естественных наук Е02-12.4-274 и ведомственной научной программы Федерального Агентства образования России «Развитие системы научно-исследовательской работы молодых преподавателей и научных сотрудников, аспирантов и студентов» № 34046.
Общая характеристика углеводородов как загрязнителей окружающей среды
Углеводороды (УВ)- класс органических соединений, в состав которых входят углерод и водород. В зависимости от строения углеродной цепи различают ациклические и циклические УВ. В свою очередь по степени насыщенности выделяют насыщенные, ненасыщенные и ароматические УВ (АУ) [71, 176, 179]. Растворимость в воде алканов, циклоалканов и полиароматических соединений низкая и составляет максимально 150 мг/л, моноарамати-ческие УВ имеют более высокую растворимость - до 67000 мг/л. Низкомолекулярные УВ обладают высокими значениями давления ненасыщенного пара ( 0,1 атм.) и легко испаряются при комнатной температуре, УВ с более низкими значениями ненасыщенного пара ( 10"4 атм.) намного менее летучи [83, 186]
Основными природными источниками УВ являются нефть, каменный и бурый уголь, природный и попутный газ, сланцы и торф; антропогенными -предприятия нефтехимической промышленности, тепловые электростанции, автомобильный транспорт и др. [174].
УВ признаны приоритетными загрязнителями биосферы [145, 189]. Отдельные территории, где осуществляется нефтедобыча, транспортировка и переработка нефти по состоянию окружающей среды приближаются к районам экологического бедствия [201]. Под воздействием УВ происходят глубокие изменения всех компонентов окружающей среды. Ежегодно 50-90 млн. тонн УВ поступают в атмосферу в результате, как естественных процессов, так и производственно-бытовой деятельности человека [176, 190]. УВ, находящиеся в атмосфере, способны связываться с другими атмосферными загрязнителями, что приводит к образованию фотохимического смога. По своему физиологическому действию он крайне опасен для дыхательной и кровеносной системы организмов человека и животных. Загрязнение Мирового океана нефтью и нефтепродуктами носит катастрофический характер: количество поступающей нефти оценивается в 5-10 млн. т/год [51, 148, 174, 190]. В настоящее время загрязнено более 1/5 поверхности Мирового океана, что вызывает существенные нарушения газо- и водообмена между гидросферой и атмосферой, заметно угнетается жизнеспособность водных организмов, изменяется температурный и световой режим поверхностных вод океана. Не менее серьезную опасность для человека представляет загрязнение жидкими УВ грунтовых вод. Так, например, 1 л бензина при полном растворении способен загрязнить до недопустимых концентраций 2 млн. л подземных вод. Реальны ситуации, когда УВ обнаруживаются в водозаборных скважинах через многие годы после устранения поверхностных источников загрязнения [162]. До последнего времени усилия большинства исследователей были направлены именно на решение проблем углеводородного загрязнения гидросферы [17, 19, 74]. В значительно меньшей степени изучены проблемы загрязнения почвы, в то время как масштабы поступления УВ в почвенные экосистемы достигают 20-30 млн. т/год при добыче, переработке, транспортировке нефти, авариях и утечках на трубопроводах и предприятиях [148, 176]. Почва накапливает УВ и их метаболиты в большей степени, чем все остальные природные среды и, в свою очередь, является потенциальным источником их вторичного загрязнения [111].
В настоящее время в России около 800000 га нефтезагрязненных почв нуждаются в мероприятиях по восстановлению их физико-химических и биологических свойств [191]. На территории Среднего Поволжья, в частности республики Татарстан, сложилась сложная экологическая ситуация, связанная с низким технологическим уровнем нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности и высокой степенью аварийности оборудования [201]. В период с 1982 по 1995 гг. в Татарстане было нарушено около 54380 га земель [122]. При углеводородном загрязнении почв взаимодействуют следующие группы факторов: 1) сложность, поликомпонентность состава углеводородных поллютантов; 2) сложность, гетерогенность состава и структуры почвенной экосистемы; 3) многообразие и изменчивость внешних факторов [180].
При попадании на поверхность почвы низкомолекулярные летучие УВ интенсивно испаряются до 20-40% [66], некоторая часть (до 5%) сорбируется на минеральных и органических почвенных компонентах [164], УВ мигрируют по почвенному профилю к водоносным горизонтам, существенно расширяя ареал первоначального загрязнения [162, 168]. Средне- и высокомолекулярные УВ находятся в почве в виде свободной несмешивающейся с водой фазы, что приводит к существенному изменению ее агрохимических и агрофизических свойств [71, 123, 129].
Токсичность УВ разной химической природы в отношении организмов человека, животных и растений существенно варьирует. Алканы, алкены, ал-кадиены, циклоалканы обладают сильным наркозным действием. Высшие члены ряда алканов опасны при воздействии на кожные покровы, в случае алкенов наблюдается судорожное действие и раздражение слизистых дыхательных путей. Алкадиены обладают мутагенной активностью, увеличивают частоту образования злокачественных опухолей. АУ ряда бензола в условиях острого воздействия поражают, главным образом, центральную нервную систему, вызывая наркотический эффект; в условиях хронической интоксикации оказывают политропное действие, поражая ряд органов и систем. АУ поражают внутренние органы, вызывают анемию, лейкоцитоз, нарушают энергетический обмен клеток. Полиароматические УВ (ПАУ) также обладают высокой химической активностью, некоторые представители канцерогенны [113, 118, 166,179].
Углеводородные загрязнители
Агрохимические характеристики почв определяли в соответствии со стандартными методическими указаниями: содержание гумуса - по Тюрину, рНксі -потенциометрически; содержание подвижного фосфора и обменного калия - по Чирикову, щелочногидролизуемого азота - по Корнфилду [107]. Влажность почвы определяли как потерю веса после высушивания образца при 105С до достижения постоянного веса [161]. Отбор почвенных проб на анализ содержания УВ в почве производили методом конверта по окончания опыта. При проведении экстракции УВ к исследуемым образцам почвы, корней или семян растений добавляли четыреххлористый углерод в соотношении: на 1 г образца - 1 мл четыреххлористого углерода и экстрагировали при механическом перемешивании на встряхивателе (1-2 цикла/с) при комнатной температуре. Продолжительность экстракции составляла 6 часов. После завершения процедуры экстракт количественно переносили в герметичную стеклянную емкость; при необходимости проводили центрифугирование экстракта (10 мин при 4000 g).
В случае экспериментов по определению оптимального способа экстракции аналогичные процедуры проводили в контрольных экспериментах (варианты без почвы). Продолжительность экстракции в данной серии экспериментов в большинстве случаев составляла 6 часов. Кроме того, дополнительно для оценки эффекта продолжительности экстракции исследовали варианты с 1, 3, 12 и 24-х часовой длительностью экстракции воздушно-сухой почвы, загрязненной п-ксилолом (4,5 вес.%). Сравнение эффективности экстракции УВ различными растворителями проводили в вариантах с загрязненной воздушно-сухой почвой при продолжительности экстракции 6 часов. В качестве экстрагентов помимо четыреххлористого углерода исследовали бензол и хлороформ, а также систему «четыреххлористый углерод - дистиллированная вода». В вариантах с исследованием эффекта добавления воды для повышения эффективности экстракции после 6 часов встряхивания экстрагируемого образца почвы с четыреххлористым углеродом добавляли дистиллированную воду в соотношении: на 1 г почвы, 1 мл органического растворителя и 1,5 мл воды - и продолжали экстракцию еще в течение 4-х часов.
Качественное и количественное определение содержания УВ в экстрактах проводили методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Кристаллюкс-4000, оснащенном капиллярной колонкой Zebron ZB-1 (длина -30 м, внутренний диаметр - 0,25 мм); с нанесенной фазой типа SE-30; тип детектора - пламенно-ионизационный; газ-носитель - Не2 (давление на входе в колонку - 109 кПа, расход через колонку - 0,91 мл/мин, деление потока -1:44), t колонки - 150С, t испарителя - 200С, t детектора -220С. Предел детектирования - 5 10" вес.%. Точность определения метода 2%.
Качественный анализ экстрактов культуры почвенных УОМ проводили методом хромато-масс-спектрометрии на масс-спектрометре «Perkin Elmer Turbo Mass Gold», оснащенным кварцевой капиллярной колонкой (длина - 50 м); с нанесенной фазой типа SE-30; тип детектора - квадрупольный; газ-носитель - Не2, расход через колонку - 1,2 мл/мин, диапазон сканирования 30 - 500 а.е.м., t колонки - 180-230С. Предел детектирования - 10"12 г. Точность определения метода 2%.
Всхожесть семян определяли как число проросших семян (на 7-й и 14-й день от посева), в % от общего количества семян, взятых для проращивания. Энергия прорастания - число семян, проросших за первые 3-е суток, в % от общего количества семян, взятых для проращивания [1-3, 145, 169].
Биомассу надземной и корневой части растений определяли методом взвешивания на технических или аналитических весах сразу после снятия урожая (сырая, г/сосуд), а также после высушивания при комнатной температуре (воздушно-сухая, г/сосуд) [182].
Показатели фитотоксичности - эффективные концентрации керосина и ТД, вызывающие 10-ти, 25-ти и 50-ти % снижение всхожести (ЕСю, ЕС25, ЕС5о соответственно) - рассчитывали при решении обратной задачи уравнения аппроксимации в среде Delphi.
Численность аэробных углеводородокисляющих почвенных микроорганизмов (КОЕ/ 1 г абс. сухой почвы) определяли методом посева на агаризо-ванные питательные среды следующего состава, г/л: (NH SC - 1,0; MgSC 4 -0,25; К2НРО4 - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,15; вода водопроводная [149, 161]. В качестве единственного или дополнительного источника углерода использовали стерильные ТтД (в концентрациях - 0,4; 0,53; 1,06; 2,7; 5,3 вес.%), 1-МН (в концентрациях - 0,2; 0,27; 0,53; 1,35; 2,7 вес.%) или керосин (в концентрациях - 1, 2, 5, 10 вес.%).
Всхожесть семян при загрязнении почвы углеводородами
Исходя из градации нефтяного загрязнения почв, предложенной Гилязо-вым М.Ю. [122], рассмотрим исследуемые концентрации керосина в почве как низкие (1 и 2%), средние (3 и 5%), высокие (10%) и очень высокие (15%).
Всхожесть семян большинства представителей семейства мятликовых (кукурузы «Катерина» и «Росс 151MB», овса «Лос 3», ржи «Радонь», проса «Лучистое» и «Казанское кормовое») при низких концентрациях керосина составляла 90-100% к контролю, рисунок 2. На фото 1 (в Приложении) показан внешний вид проростков кукурузы «Катерина» в чашках Петри. Всхожесть семян тимофеевки «Казанская», костреца «Казанский», овсяницы «Казанская» и сорго «Геркулес» снижалась более существенно: при 1 вес.% керосина в почве - на 10-20%; при 2% - на 15-35%) к контролю. При средних концентрациях керосина в почве всхожесть семян большинства растений существенно снижалась: при 3 вес.% керосина - на 20-54%) (за исключением кукурузы «Катерина» и проса «Казанское кормовое» - снижение на 2,5%); при 5 вес.%) - снижение составило 64-100% (за исключением кукурузы обоих сортов - снижение 30-50%). При высоких и очень высоких концентрациях керосина семена растений семейства мятликовых не прорастали.
Всхожесть семян большинства растений семейства бобовых, также как и мятликовых, при низких концентрациях керосина в почве снижалась не более чем на 9% относительно контроля. Всхожесть семян гороха «Венец», люцерны изменчивой обоих сортов и козлятника снижалась на 8-23%, рисунок 3. Однако при средних концентрациях керосина снижение всхожести в случае большинства видов было существенно меньше, чем у растений семейства мятликовых: при 3% - снижение в среднем составило 15%; при 5 вес.% керосина - всхожесть бобовых была не менее 70% относительно контроля, за исключением гороха «Венец» - 17%) и козлятника «Гале» - 66%. Большинство видов бобовых растений, исключая горох обоих сортов, прорастали в условиях высокого и очень высокого уровня загрязнения почвы керосином -всхожесть семян составляла от 8 до 90% к контролю.
Среди различных видов астровых наблюдалось сильное варьирование всхожести в условиях загрязнения почвы керосином, рисунок 4. При низких концентрациях керосина в почве всхожесть подсолнечника однолетнего, кореопсиса красильного, бархатцев отклоненных, георгины культурной, расто-ропши пятнистой и ноготков лекарственных составляла 76-97% к контролю. Однако всхожесть семян мать-и-мачехи обыкновенной снижалась более чем на 55%, одуванчика лекарственного - на 69%, цикория - на 94%; семена лопуха не прорастали.
При средних концентрациях керосина устойчивыми являлись подсолнечник однолетний и бархатцы отклоненные - всхожесть относительно контроля составила более 70%). Всхожесть семян кореопсиса красильного, георгины снижалась более чем на 30% (при 5 вес.% керосина). Депрессия всхожести семян мать-и-мачехи обыкновенной, одуванчика лекарственного, рас-торопши пятнистой, ноготков лекарственных и цикория обыкновенного относительно контроля при средних уровнях загрязнения почвы керосином достигала 35-98%). При высоких и очень высоких уровнях загрязнения керо сином прорастали только семена подсолнечника, кореопсиса красильного и бархатцев отклоненных.
Среди растений семейства капустных наименее устойчивым к загрязнению почвы керосином являлся сумочник пастуший: его семена хорошо всходили только при 1 вес.% керосина в почве (всхожесть относительно контроля более 90%), однако уже при 5 вес.% керосина всхожесть составляла не более 10%, рисунок 5. Семена горчицы белой и рапса успешно прорастали при низких уровнях загрязнения почвы (всхожесть семян относительно контроля 80-100%), с увеличением уровня загрязнения (вплоть до 15 вес.% керосина), всхожесть их семян сохранялась в пределах 40-55%) к контролю.
