Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в биосфере циркулирует огромное число токсичных соединений природного и техногенного происхождения. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются приоритетными загрязнителями вследствие своего повсеместного распространения и отрицательного влияния на живые организмы. Серьезную проблему представляют комплексно загрязненные почвы, когда наряду с органическими поллютантами в почвах присутствуют тяжелые металлы и/или металлоиды. Скорость деградации органических соединений на таких территориях существенно замедляется (Springael et al, 1993; Sokhin et al, 2001).
Одним из современных и многообещающих подходов для очистки загрязненных почв является фиторемедиация - совместное применение растений и ассоциированных с ними микроорганизмов (Lucy et al., 2004). Получение экспериментальных данных, касающихся взаимодействия растений и ризосферных бактерий на загрязненных почвах, является основой для повышения эффективности фиторемедиационных технологий. Поскольку при загрязнении ухудшаются физико-химические свойства почвы, и как следствие, снижается накопление растительной биомассы, представляется актуальным применение штаммов, способных не только утилизировать токсичные соединения, но и стимулировать рост растений.
Было показано, что гибель и угнетение роста растений на загрязненной почве может происходить не только из-за токсического действия на них вещества-загрязнителя, но и вследствие сильного повреждения растений фитопатогенными грибами и накоплением в почве грибных метаболитов (Киреева с соавт., 2006). Таким образом, для очистки загрязненных почв необходимо использование штаммов, способных деградировать органические загрязнители и подавлять рост фитопатогенных грибов.
Известно, что некоторые представители ризосферных бактерий рода Pseudomonas способны улучшать рост растений за счет различных механизмов (Haas and Defago, 2005). Наиболее ярким примером положительного влияния псевдомонад является синтез фитогормонов и защита растений от фитопатогенов. Такие полезные для растений бактерии в настоящее время объединяют в специфическую группу, которую принято обозначать как PGPR Pseudomonas (PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, стимулирующие рост растений). В природных условиях численность PGPR Pseudomonas не велика и составляет менее 1% от общего числа культивируемых штаммов, изолированных из ризосферы (Raaijmakers et al., 1999). Использование таких бактерий представляется весьма перспективным подходом для оптимизации процессов очистки загрязненных почв.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы - получение плазмидосодержащих вариантов PGPR Pseudomonas, совмещающих фитостимулирующие и защитные свойства со способностью к биодеградации ПАУ.
В соответствии с целью работы были определены следующие задачи:
Выделить и охарактеризовать новые ризосферные штаммы бактерий, совмещающие способность утилизировать ПАУ, подавлять фитопатогенные грибы и бактерии и стимулировать рост растений. Провести в выделенных штаммах поиск плазмид биодеградации.
Выявить в ризосферных штаммах-антагонистах фитопатогенов наличие генетических систем, вовлеченных в биосинтез антибиотически активных соединений.
Сконструировать штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas, содержащие плазмиды биодеградации нафталина и устойчивости к тяжелым металлам.
Изучить ростовые характеристики плазмидосодержащих штаммов при культивировании на ПАУ, удельную активность ключевых ферментов деградации нафталина и стабильность поддержания плазмид биодеградации и резистентности к тяжелым металлам.
5. Оценить деградацию нафталина и фенантрена ризосферными штаммами в
модельных растительно-микробных ассоциациях.
Научная новизна работы
Выделены и сконструированы новые плазмидосодержащие штаммы PGPR Pseudomonas, совмещающие способность деградировать ПАУ, подавлять рост фитопатогенов и продуцировать индолил-3-уксусную кислоту. Впервые выделен штамм P. aureofaciens OV17(pOV17), содержащий плазмиду биодеградации нафталина.
Показано, что наиболее активные ризосферные штаммы-антагонисты фитопатогенов содержат несколько генетических систем, необходимых для биосинтеза антибиотиков. У четырех штаммов P. fluorescens обнаружены гены, необходимые для биосинеза пиолютеорина, пирролнитрина и 2,4-диацетилфлороглюцина. Шесть штаммов P. aureofaciens и один штамм Р. chlororaphis содержат гены, участвующие в биосинтезе пирролнитрина и феназин-1-карбоновой кислоты.
Плазмиды био деградации нафталина pOV17 и pBS216 могут поддерживаться в различных видах PGPR Pseudomonas, включая P. fluorescens, P. aureofaciens, P. chlororaphis и P. putida. Стабильность поддержания плазмид биодеградации зависит от видовой принадлежности штамма. Наиболее стабильно плазмиды поддерживаются в штаммах P. chlororaphis PCL1391 и Р. putida 53а.
Плазмидосодержацие штаммы PGPR Pseudomonas защищают растения от токсичного действия ПАУ (нафталин или фенантрен), осуществляя деградацию этих соединений в ризосфере растений. Эффективность деградации нафталина (200 мкг/мг песка) полученными плазмидосодержащими штаммами в стерильных условиях в ризосфере рапса составляет около 100%. В модельных экспериментах с торфо-смесью, загрязненной фенантреном (5 мг/г) максимальная (выше 50%) био деградация осуществляется при инокуляции семян ячменя штаммами P. fluorescens 38a(pBS216) и P. aureofaciens OV17(pOV17). Однако, в результате рекомбинационных событий могут быть
получены плазмидосодержащие варианты, не способные к полной деградации ПАУ, продуцирующие токсичные интермедиаты, приводящие к гибели растений (штамм P. putida 53a(pBS216*)).
Получены новые штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas, способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов. Показано, что устойчивый двуплазмидный штамм P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.
Научно-практическая значимость работы
Создана коллекция плазмидосодержащих штаммов PGPR Pseudomonas, эффективно деградирующих ПАУ. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтверждены патентами РФ на изобретение № 2352629, № 2396339, № 2396338.
Показано, что подбор штаммов-деструкторов ПАУ для фиторемедиационных технологий должен основываться как на изучении степени колонизации ризосферы того или иного растения, так и на тщательном выяснении взаимодействий плазмида-бактериальный хозяин и оценке конкурентоспособности данной комбинации в определенных природных условиях.
Полученные в работе плазмидосодержащие штаммы PGPR Pseudomonas могут использоваться для разработки на их основе нового поколения биопрепаратов для защиты и стимуляции роста растений, а также очистки почв с комплексным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и тяжелыми металлами.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на 13 конференциях: «Биология -
наука XXI века», 5-я, 8-я Пущинская школа-конференция молодых ученых,
2001, 2004, Пущино; «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением
окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в
XIX-XXI веках», Всероссийская конференция, 14-19 июня 2001, Санкт-
Петербург; «Биотехнология-2003», научно-практическая конференция, 24-25
ноября 2003, Пущино; «Экология 2004: Эстафета поколений», 3-я Пущинская
международная школа-семинар по экологии, 27-29 апреля 2004, Пущино;
«Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация
инновационных научно-технических проектов, 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино; «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 3-я межрегиональная конференция молодых ученых, 10-12 октября 2006, Саратов; «Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants», International symposium, 28-30 July 2003, Saratov; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 25-31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on
Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007, Colchester, England.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 5 статей, 15 тезисов и 3 патента РФ.
Структура и объем диссертации
