Содержание к диссертации
Введение
1. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в окружающей среде: содержание, источники, формы соединений, методы определения, свойства
2. ПАУ в почвах 17
3. Очищение объектов окружающей среды от ПАУ 22
3.1 Очистка почв от ПАУ: способы, подходы, технологии 22
3.1.1 Очистка с помощью микроорганизмов: аборигенная микрофлора, интродуцированные микроорганизмы-деструкторы..30
3.1.2 Очищение растениями 38
3.1.3 Хемотаксически активные микроорганизмы-деструкторы ПАУ 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
1. Микроорганизмы-деструкторы ПАУ 56
1.1 Выделение, идентификация и свойства чистых культур микроорганизмов-деструкторов ПАУ 56
1.2 Деградация ПАУ чистыми культурами в питательной среде 56
1.3 Изучение хемотаксических свойств выделенных микроорганизмов 59
1.3.1 Хемотаксические свойства к отдельным ПАУ 59
1.3.2 Хемотаксические свойства к корневым выделениям растений 61
2. Очистка почвы от ПАУ 63
2.1 Выбор растений, устойчивых к высоким концентрациям ПАУ в почве 63
2.2 Очистка почвы от ПАУ растительно-микробными ассоциациями 70
3. Изменение численности и биомассы интродуцированной и аборигенной микрофлоры 83
3.1 Изменение численности интродуцированных в почву микроорганизмов-деструкторов 83
3.2 Влияние интродуцированных штаммов на аборигенную микробную и грибную биомассу ризосферной почвы 84
3.3 Вертикальная и горизонтальная миграция в почве хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов 85
4. Биоочистка почвы, загрязненной углеводородами нефти 89
4.1 Получение биомассы микроорганизмов-деструкторов для интродукции в почву 89
4.2 Очистка почвы растительно-микробной ассоциацией 90
4.3 Изучение динамики численности интродуцированных штаммов в почве и ризосфере растений 96
5. Безопасность микроорганизмов-интродуцентов и токсичность почвы при загрязнении ПАУ 98
5.1 Изучение токсичности микроорганизмов- деструкторов ПАУ 98
5.2 Токсичность почвы, загрязненной ПАУ 99
6. Коллекция штаммов-деструкторов ПАУ 104
6.1 Влияние условий хранения штаммов-деструкторов на их жизнеспособность 104
6.2 Патентование микроорганизмов-деструкторов 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112
ВЫВОДЫ 113
ЛИТЕРАТУРА 114
ПРИЛОЖЕНИЯ 140
1. Рисунки к тексту 140
2. Копия патента 145
3. Копия акта оценки эффективности ремедиации почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом 151
- Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в окружающей среде: содержание, источники, формы соединений, методы определения, свойства
- ПАУ в почвах
- Очистка почв от ПАУ: способы, подходы, технологии
Введение к работе
Актуальность работы. Загрязнение окружающей среды полициклицескими ароматическими углеводородами (ПАУ) является серьезной угрозой, в том числе и для здоровья человека. ПАУ обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами (International Agency for Research on Cancer, 1983; Phillips, 1983; Cerniglia, Heitkamp, 1989) и относятся к приоритетным загрязнителям (Lu et aL, 1977; Keith, Teelliard, 1979; Пиковский, 1993), которые попадают в окружающую среду, в том числе и почву, в виде промышленных выбросов предприятий химической и нефтехимической промышленности. Загрязнение почв ПАУ приводит к уменьшению их плодородия и, соответственно, качества сельскохозяйственной продукции (Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем, 1988), Одним из перспективных способов решения проблемы загрязнения почв ПАУ — разработка методов и подходов их очистки и детоксикации, и прежде всего, биодетоксикации и биоремедиации.
Накоплен большой опыт применения микроорганизмов-деструкторов и растений-мелиорантов (Banks et al., 1993; Susarla et al., 2002) для очистки почвы от ПАУ, включая чистые культуры микроорганизмов (Гусев, Суровцева, Коронелли, 1981; Heitkamp, Cerniglia, 1988; Коронелли, 1996), их ассоциации (Барышникова и др., 2001; Кобзев и др., 2001; Белоусова и др., 2002) и бактериальные препараты (Булатов и др., 1997). Однако очистка почв от трудноразлагаемых соединений ПАУ в естественных условиях, в том числе с применением микробных культур и созданных на их основе препаратов, не всегда экологически оправдана и экономически выгодна. Поэтому в настоящее время продолжается поиск активных культур деструкторов ПАУ и биотехнологических подходов для интродукции и создания условий их активной деятельности в деградации поллютайтов.
б Установлено, что биодеградация ПАУ почвенными микроорганизмами наиболее интенсивно происходит в ризосфере корней растений (Schwab, Banks, 1994; Reilley et al., 1996; Siciliano, Germida, 1999; Liste, Alexander, 2000; Siciliano et a]., 2003). Однако поиск микроорганизмов-деструкторов ПАУ в богатой микроорганизмами и корневыми выделениями ризосферной почве территорий, продолжительное время загрязненных ПАУ и обладающих хемотаксическими свойствами по отношению к соединениям ПАУ и корневым выделениям растений, до наших исследований не проводился.
По этому целью данной работы было - изучение ризосферных хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов, как основного компонента активных растительно-микробных ассоциаций для очистки почвы от ПАУ.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
Выделение чистых культур микроорганизмов—деструкторов из ризосферы и почв разных типов, длительно загрязненных ПАУ.
Поиск микроорганизмов-деструкторов, обладающих хемотаксическими свойствами к ПАУ и корневым выделениям опытных растений.
Выявление растений, обладающих устойчивостью к повышенному содержанию ПАУ в почве.
Поиск и применение наиболее активной растительно-микробной ассоциации для очистки почвы, загрязненной ПАУ.
Создание коллекции и изучение условий хранения хемотаксически активных штаммов-деструкторов.
Научная новизна работы. Впервые из ризосферы растений, произрастающих на загрязненных территориях, выделены чистые культуры микроорганизмов, обладающие комбинированной способностью осуществлять деструкцию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и быть хемотаксически активными к ПАУ и корневым выделениям растений. Создана растительно-микробная ассоциация путем бактеризации
семян растений штаммами-деструкторами для посева в загрязненную ПАУ почву с целью фитобиоремедиации. Показана высокая эффективность растительно-микробных ассоциаций для очистки почвы от ПАУ и других углеводородов нефти.
Практическая значимость. Создана коллекция хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ и разработаны условия их хранения.
В условиях вегетационных и полевых экспериментов показана высокая эффективность применения созданной растительно-микробной ассоциации для очистки почвы от ПАУ и разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для фиторемедиации почв.
На один из наиболее активных штаммов-деструкторов P. stutzeri MEV-S1 был получен патент RU № 2228952.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на пяти конференциях: "Биотехнология - народному хозяйству 2000", АООТ "Биохиммаш", г. Москва, "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды", Пушино, 2001 г., "Актуальные проблемы экологии в условиях современного мира", г. Майкоп, 2001 г., II Московский международный Конгресс — Биотехнология: состояние и перспективы развития, г. Москва, 10-14 ноября 2003 г., International Symposium: Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, Saratov, Russia, 28-30 July 2003, опубликованы в Агро XXI, оформлены в виде отчетов по проекту № 1429 МНТЦ.
Публикации. Основные материалы диссертации представлены в семи публикациях: пяти тезисах, одном патенте и одной статье.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 139 страницах машинописного текста, содержат 11 рисунков, 31 таблицу. Список литературы включает 244 наименования.
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в окружающей среде: содержание, источники, формы соединений, методы определения, свойства
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и их гибридные формы входят в состав сложных углеродистых веществ земной коры и ландшафтной оболочки Земли в виде рассеянных битуминозных веществ, нефтей, битумов, компонентов почвенного гумуса, аэрозолей воздуха, липидов растительных и животных тканей (Геннадиев и др., 1997). ПАУ представляют собой высокомолекулярные органические соединения, основным элементом структуры которых является бензольное кольцо (рис. 1). К ПАУ относятся соединения, содержащие в своем составе несколько бензольных колец, соединенных вместе или разделенных парой соседних атомов углерода между примыкающими кольцами (Клар, 1971; Ровинский и др., 1988).
В зависимости от относительного расположения бензольных колец ПАУ можно разделить на две группы: ката- и пери-конденсированные углеводороды (Клар, 1971; Ровинский и др., 1988). Ката-конденсированные углеводороды бывают с линейным расположением бензольных колец -«ацены» (нафталин, антрацен, тетрацен); и угловым (ангулярным) - «фены» (фенантрен, тетрафен, пентафен, хризен, пирен, трифенилен). Пери-конденсированные ПАУ состоят из 5-ти и 6-ти членных колец (дифенил, перилен, 1,12-бензпирен, коронен, пирен, бенз- и дибензпирены, антантрен; флуорантен, его бензологи, 2,3-ортофениленпирен).
ПАУ - молекулярные соединения, представляющие собой при комнатной температуре кристаллы (за исключением ряда производных нафталина). Температура их плавления и кипения растет с увеличением числа бензольных колец, достигая соответственно у нафталина 80 и 218С, у 3,4-бензпирена 177 и 456С, у 1,12-бензперилена 273 и 511С, у коронена -438 и 525С, при которой они сублимируются (Клар, 1971).
Растворимость ПАУ в чистой воде невелика и значительно варьирует для разных углеводородов (0,1—1,0х104 мкг/л); растворимость в органических растворителях уменьшается с увеличением молекулярного веса соединения в зависимости от взаимного расположения конденсированных бензольных колец в молекуле. Растворимость пирена в воде составляет ОД 1 мкг/л, что примерно в тысячу раз выше, чем растворимость 3,4-бензпирена.
Важнейшим химическим свойством ПАУ является их готовность к реакциям замещения. Они сравнительно легко замещают атомы водорода, соединенные с ароматическими кольцами, на другие атомы или группы. В результате таких реакций образуются алкилзамещенные ПАУ, а также галоген-, нитро-, амино-, сульфопроизводные, фенолы и ароматические спирты, хиноны, ароматические альдегиды и ароматические кислоты.
В достаточно «жестких» условиях ПАУ могут вступать в реакции присоединения. Например, присоединение к ароматическому кольцу галогена может происходить под действием ультрафиолетового облучения, а гидрирование возможно при высоких температурах в присутствии катализаторов.
ПАУ могут окисляться с образованием хинонов и карбоновых кислот. «Аценовые» структуры или их содержащие углеводороды более реакционноспособны, чем «фены» с тем же количеством колец или их содержащие углеводороды (Геннадиев и др., 1996).
В таблице 1 приведены примеры наименований соединений ПАУ в цифровой и ИЮПАК классификациях. Цифровая система обозначений положений заместителей и взаимного расположения бензольных колец в классификации ИЮПАК заменена на буквенную.
Выделяют четыре группы факторов, способствующих образованию углеводородов: космические, эндогенные геологические, биогеохимические и техногенные. В земной коре происходят геохимические процессы, приводящие к образованию ПАУ в виде смоло-, битумообразных и углистых веществ (Blumer, 1976; Кулакова и др., 1982). Один из механизмов образования природных ПАУ в современных и древних осадках, а также в почвах - это воздействие глубинного тепла Земли на захороненное в ней органическое вещество (Геннадиев и др., 1997). К природным факторам образования ПАУ в осадочных наносах и почвах можно отнести и лесные пожары как современные, так и в прошлые геологические эпохи (Ramdahl et al., 1982). Кроме того, образование ПАУ возможно в результате биогеохимической трансформации замещенных и незамещенных углеводородов, пептидов, липидов, углеводов,
ПАУ в почвах
В литературе накоплен определенный материал об источниках поступления ПАУ в почвы (Edwards, 1983; Ровинский и др., 1988; Геннадиев и др., 1996). Рассматривают их техногенное происхождение в почвенных горизонтах в результате сжигания угля, нефти, древесины, производства кокса и работы двигателей внутреннего сгорания. Признаются также космические, эндогенные геологические, естественные пирогенные (например, лесные пожары) факторы загрязнения почв ПАУ (Чернянский и др., 2001). Источниками ПАУ для осадочных пород и почв могут служить ароматические системы лигнина, детрита, биогенные пигменты и другие органические остатки, а также гумусовые вещества (Blumer, 1976; Ровинский и др., 1988; Геннадиев и др., 1996; Pothuluri, Cerniglia, 1998). Поэтому, в почве могут присутствовать ПАУ, имеющие природное и техногенное происхождение.
Техногенные ПАУ поступают в почву, в основном, поверхностно: с частицами пыли, с опадом или непосредственно из атмосферы, а также в результате аврийных выбросов. Из-за низкой растворимости (например, растворимость 3,4-бензпирена в воде составляет 95,8 мкг/л) техногенные ПАУ практически не способны мигрировать в почвенном растворе и по профилю (Чернянский и др., 2001), поэтому в условиях стабильной поверхности ПАУ накапливаются в нескольких сантиметрах верхнего слоя почвы. Однако, имеются данные о нахождении ПАУ в лесных почвах на глубине до 1 м, что связывается в частности с вертикальной миграцией ПАУ в почве в процессе роста корневой системы растений ( Никифорова и др., 1989 ). Установлено, что молекулы ПАУ находятся в основном в состоянии поглощения поверхностями минеральных и органо-минеральных коллоидов (Ильницкий, 1985; Ровинский и др., 1988; Геннадиев и др., 1996). Природное и техногенное происхождение ПАУ в различных почвах является предметом научных дискуссий и методологическим инструментом для изучения их эволюции и генезиса (Никифорова, Теплицкая, 1979; Никифорова и др., 1989; Геннадиев и др., 1990; 1991; 1996; 1997; Теплицкая и др., 1990).
При изучении горно-луговых почв разной степени развитости и возраста профиля установлено, что в почве с низким содержанием органического вещества (1,6%) суммарное содержание ПАУ составило 11 мкг/кг, а в почве с высоким содержанием органического вещества (5,8-11,1 и 9,3-11,5%) концентрация ПАУ была выше (45-104 и 69-218 мкг/кг соответственно). С увеличением возраста почв повышается и содержание в них ПАУ (Геннадиев и др., 1996). При этом изменяется и качественный состав ПАУ в почвах. В молодой горно-луговой почве (возраст около 100 лет) обнаружены только относительно простые трехядерные молекулы флуорена, а ПАУ сложного состава - отсутствовали.
В среднеразвитой почве (возраст около 300 лет) обнаружено большое количество индивидуальных соединений ПАУ (флуорен, фенантрен, аценафтен, тетрафен, хризен, антрацен, нафталин, пирен и 3,4-бензпирен). Молекулы ПАУ в этой почве прочно связаны с тонкодисперсной органно-минеральной фракцией. В развитой почве (возраст около 1000 лет) отмечено высокое суммарное содержание ПАУ, но менее разнообразный индивидуальный состав по сравнению со среднеразвитой почвой. В составе ПАУ присутствовали 5-ти и 6-ти кольчатые соединения и 1,12-бензперилен.
Содержание ПАУ изменяется и по профилю почвы. Так, в черноземе содержание ПАУ в верхнем слое гумусо-аккумулятивного горизонта составляло 713, а в иллювиальном горизонте (глубина 80 см) - 201 мкг/кг (Геннадиев и др., 1996). Причем, 4-7-ми ядерные полиарены аккумулированы в основном в верхнем слое (0-9 см), а на глубине 9-13 см их содержание уменьшилось в 10 раз. На этом основании авторы сделали вывод о преимущественно техногенном происхождении тяжелых многоядерных молекул ПАУ в исследуемом черноземе.
Очистка почв от ПАУ: способы, подходы, технологии
Деградация ПАУ в природе, включая почву, может происходить за счет абиотических и биологических процессов. Показано, что за первые сутки (летом) из нефтяного пятна на поверхности почвы испаряется до 80% технического бензина, 22% - керосина, 2-15% - сырой нефти и около 0,3% -летучих компонентов мазута (Изъгорова, 1950). В воздухе ПАУ могут подвергаться абиотической деградации за счет взаимодействия со свободными радикалами (Sutherland et al., 1995). В результате процессов окисления и фотолиза исходные ПАУ способны образовывать и более токсические соединения (Barbas et al., 1996).
Существуют механические, термические и физико-химические методы очистки почв от нефтяных загрязнений, которые применяют, прежде всего, при высоких уровнях загрязнения ( 1% нефти в почве). В некоторых случаях загрязненный грунт может изыматься (выемка и транспортировка) для термической обработки, биокомпостирования или последующего захоронения. Транспортируют почвы или грунты с высоким уровнем нефтезагрязнения (50-200 г/кг) в специальный ангар (биомодуль), в котором создаются физические (температура, аэрация), химические (рН, питательные вещества) и биологические (биопрепараты) условия для быстрого разложения загрязнителя. Такая технология очистки почвы или грунта довольно дорогостоящая и для широкого применения экономически невыгодна. Поэтому многие подходы направлены на очищение почвы на месте. Ремедиация почвы на месте предполагает активизацию аборигенной углеводородокислягощей микрофлоры и интродукцию культуры микроорганизмов-деструкторов, адаптированной к загрязнителю и условиям среды. Технология очистки зависит от типа и содержания загрязняющих углеводородов, типа почвы, а также активности аборигенных и интродуцированных микроорганизмов. Важны и такие факторы
как уровень очистки и время, за которое необходимо провести очистку (Bossert, Compeau, 1996). В настоящее время накоплен огромный экспериментальный материал о влиянии различных факторов на биоремедиацию почв (Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем, 1988; Гузев и др., 1989; Atlas, Bartha, 1992). К этим факторам можно отнести физико-химические свойства ПАУ: молекулярный вес, водная растворимость, липофильность, способность к испарению, концентрация в природном объекте, наличие функциональных групп и другое. Микробиологические факторы - тип и размер популяции микроорганизмов-деструкторов, биодоступность ПАУ. Наиболее постоянными факторами, оказывающими значительное влияние на биодеградацию являются: рН, температура, концентрация кислорода, солевой состав воды или почвы, наличие питательных веществ и косубстратов, интенсивность света (Leahy, Colwell, 1990).
Колебания температуры влияют на метаболизм микроорганизмов и состав микробного сообщества (Atlas, 1981). Низкая температура снижает испарение токсичных веществ (например, нафталина), уменьшает растворимость ПАУ в воде (Atlas, Bartha, 1972). Низкие температуры являются лимитирующим фактором для деградации ПАУ в морских осадках (Shiaris, 1989) и пресной воде озер (Cooney et al., 1985). Высокие температуры также могут оказывать неблагоприятное действие на биодеструкцию. Так, при температурах выше 40С проявляется токсическое влияние ПАУ на мембраны клеток (Bossert, Bartha, 1984).
В деградации ПАУ важную роль играет наличие и соотношение питательных веществ в водоеме и почве. Несбалансированное соотношение углерода, азота и фосфора в осадках и грунтовых водах (Jamison et al, 1975), морской воде (Atlas, Bartha, 1972) ограничивает биодеградацию ПАУ (Walker, Colwell, 1974). Внесение азотных и фосфорных удобрений ускоряет биодеградацию нефтепродуктов (Atlas, Bartha, 1972; Atlas, Busdosh, 1976; Dibble, Bartha, 1976; Olivieri et al., 1976; Horowitz, Atlas, 1977; Bergstein, Vestal, 1978).
Концентрация солей также влияет на микробную деградацию ПАУ (Kerr, Саропе, 1988). Отмечена связь между скоростью минерализации нафталина и содержанием NaCl в осадках реки Гудзон, имеющей непостоянный солевой режим. Скорость деградации ПАУ в воде этой реки снижается с увеличением концентрации хлористого натрия в воде ( 3%) и почти полностью прекращается при 28%. Скорость деградации ПАУ в почве может уменьшаться также из-за недостатка воды, необходимой для микробного роста и метаболизма микроорганизмов (Bossert, Bartha, 1984). Показано, что оптимальная влажность почвы для биодеградации ПАУ должна быть не менее 30% от предельной полевой влагоемкости - ППВ. (Dibble, Bartha, 1979).
