Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Способы и механизмы иммобилизации микробных клеток 12
1.2 Факторы, определяющие адгезию микроорганизмов 18
1.3 Влияние адсорбционной иммобилизации микробных клеток на их 26
физиологию и метаболическую активность 26
1.4 Биоремедиация загрязненных нефтепродуктами объектов с
использованием иммобилизованных и свободных нефтеокисляющих
микроорганизмов 30
1.5 Актинобактерии в биоремедиации нефтезагрязненных объектов 34
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39 .
2.1 Бактериальные штаммы 39
2.2 Носитель для адсорбционной иммобилизации клеток 39
2.3 Питательные среды, субстраты, реактивы 39
2.4 Культивирование микроорганизмов на жидких минеральных средах ..41
2.5 Многофакторные эксперименты 41
2.5.1 Оптимизация состава питательной среды для получения биомассы.... 41
2.5.2 Оптимизация условий адгезии клеток 44
2.6 Определение концентрации биомассы при культивировании на жидкой питательной среде 46
2.7 Определение показателя гидрофобности клеток 47
2.8 Моделирование конвективного переноса микробных клеток 47
2.9 Определение показателя адгезии клеток 48
2.10 Лабораторное моделирование биодеградации нефтяного слика в воде ... 49
2.11 Лабораторное моделирование биодеградации нефтепродуктов в песке и почве 50
2.12 Количественные химические анализы 50
2.12.1 Количественный анализ нефтепродуктов 50
2.12.2 Количественный анализ аммонийного и нитратного азота 52
2.12.3 Количественный анализ фосфора 53
2.13 Микробиологические анализы 53
2.13.1 Определение численности общей гетеротрофной микрофлоры.... 53
2.13.2 Определение численности нефтеокисляющих микроорганизмов. 54
2.13.3 Определение спектра устойчивости к антибиотикам 54
2.14 Испытания углеводородокисляющей культуры на безвредность 55
2.15 Математическая обработка результатов' 55
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56
3.1 Отбор нефтеокисляющих микроорганизмов для внесения в объект биологической очистки в иммобилизованном виде 56
3.1.1 Критерии отбора штаммов 57
3.1.2 Экспресс-отбор микроорганизмов по косвенным критериям 65
3.2 Модельный штамм 72
3.3 Взаимосвязь конвективного переноса углеводородокисляющих микроорганизмов с показателем гидрофобности клеток 75
3.4 Оптимизация составов жидких питательных сред для наработки биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов 81
3.4.1 Оптимизация состава жидкой питательной среды на основе дистиллированной воды '. 81
3.4.2 Оптимизация состава жидкой питательной среды на основе морской воды 85
3.4.3 Продукция биомассы нокардиоморфными актиномицетами при культивировании на средах оптимизированного состава 89
3.5 Оптимизация условий адсорбционной иммобилизации клеток нокардиоморфных актиномицетов на носителе 92
3.5.1 Влияние рН и концентрации катионов алюминия на жизнеспособность и деструкцию нефтепродуктов родококками 95
3.5.2 Полный факторный эксперимент 98
3.5.3 Иммобилизация нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов в оптимизированных условиях 102
3.6 Биодеградация нефти в воде свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis Fl 105
3.7 Деструкция нефтепродуктов свободными и иммобилизованными клетками нефтеокисляющих микроорганизмов в модельных экспериментах по очистке загрязненных песка и почвы 110
3.8 Испытание иммобилизованной системы в условиях полевых экспериментов 115
3.8.1 Биоремедиация луговой глинистой почвы 116
3.8.2 Биологическая очистка нефтесодержащего песчаного грунта 118
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 127
Приложение 1 154
Приложение 2 155
Приложение 3 156
Приложение 4 157
Приложение 5 158
- Способы и механизмы иммобилизации микробных клеток
- Бактериальные штаммы
- Отбор нефтеокисляющих микроорганизмов для внесения в объект биологической очистки в иммобилизованном виде
Введение к работе
Актуальность проблемы
В связи с всё увеличивающимся объемом добычи, транспортировки и переработки нефти и нефтепродуктов, обособленной экологической проблемой становится углеводородное загрязнение окружающей среды. Исследования многих авторов в области научных основ экологической биотехнологии направлены на решение проблем антропогенного загрязнения биосферы. Свойства нефти обуславливают её опасность как поллютанта, что в связи с увеличением плотности населения планеты требует ужесточения ряда соответствующих экологических норм. Известны токсическое, мутагенное, тератогенное, онкогенное, а также иммунодепрессирующее свойства нефти. Вовлечение большинства индивидуальных углеводородов, а также продуктов их термического и фотохимического разложения в биологический круговорот чревато угнетением всей зараженной экосистемы в целом, но, прежде всего, организмов, замыкающих пищевые цепи. В случае агроценозов, таковым организмом является человек.
В настоящее время существует большое количество методов, направленных на ликвидацию заражения среды углеводородами. Широчайшее применение нашли биологические подходы, основанные на метаболическом потенциале нефтеокисляющих микроорганизмов. Данные методики наиболее дешевы и автономны, но весьма чувствительны к условиям среды и, как следствие, наукоемки ввиду необходимости адаптации к объектам и задачам биоремедиации.
Непрерывное развитие биотехнологических методов очистки обусловливается разнообразием откликов организмов на различные воздействия. Инновации касаются основного агента биотехнологического процесса - неф-теокисляющего микроорганизма, его свойств и способа использования. В настоящей работе рассматриваются аспекты применения углеводородокис-
7 ляющих микроорганизмов, адсорбционно иммобилизованных на твердом носителе.
Иммобилизация микроорганизмов является распространенным методом модификации их активности. В частности, адсорбционная иммобилизация обеспечивает протективное действие на микроорганизм. Бактериальная клетка, закрепленная в поверхностной микропоре носителя, менее подвержена неблагоприятным условиям внешней среды. Расположение на границе раздела твердой и жидкой фаз способствует интенсифицированному снабжению микроорганизма дефицитными биогенными элементами за счет адсорбции последних из раствора. Носитель, подобранный адекватно задачам, опосредует взаимодействие биологического агента с субстратом. Также иммобилизация облегчает механические операции с клетками.
Методы биологической очистки, связанные с интродукцией (биоаугментация, а также биостимуляция in vitro) иммобилизованных на~ носителях клеток нефтеокисляющих микроорганизмов в настоящее время являются перспективной альтернативой традиционным методам, основанным на внесении свободных клеток. Важным условием, позволяющим реализовать преимущества иммобилизованной системы, является знание специфических условий её создания и функционирования, определяемых как общими закономерностями, так и особенностями конкретных компонентов биотехнологического производства.
Любой экотоп, в том числе нефтезагрязненная почва, грунт или неф-тешлам, могут рассматриваться как естественная иммобилизованная система, характеризующаяся особым распределением микробиоты по поверхностям минеральных частиц, компонентов органического происхождения, а также по поверхности адсорбированного и эмульгированного в почвенном растворе углеводородного поллютанта. В связи с этим, вопросы адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих микроорганизмов касаются не только подготовки и применения иммобилизованных препаратов, но и использо-
8 вания клеток бактерий - деструкторов, вносимых в объект очистки в виде суспензии.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является увеличение эффективности технологии биоремедиации нефтезагрязненных объектов с применением свободных и ад-сорбционно иммобилизованных нокардиоморфных актиномицетов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Количественно определить показатели адгезии и деструкционной активности штаммов в выборке музейных культур, выбрать критерии экспресс - отбора нефтеокисляющих микроорганизмов из состава профилированных коллекций для применения в биоремедиации в иммобилизованном виде.
Исследовать связь конвективного переноса углеводородокйсляющих актинобактерий с показателем гидрофобности клеток вфазличных условиях для оценки вертикального распределения и результативности интродукции неиммобилизованных культур родококков различной степени гидрофобности.
Оптимизировать составы жидких минеральных питательных сред для увеличения продукции биомассы клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов.
Оптимизировать условия адсорбционной иммобилизации на сорбент нефтепродуктов клеток углеводородокйсляющих нокардиоморфных актиномицетов.
Сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток нефтеокисляющего родококка в ходе моделирования биоремедиации песка, почвы и воды, загрязненных нефтепродуктами.
, 6. Сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток родококка в ходе полевых экспериментов по очистке загрязненного нефтепродуктами песчаного грунта и нефтезагрязненной почвы.
Научная новизна работы
Проведенная комплексная оценка показателей гидрофобности, адгезии к твердому носителю, эффективности деструкции нефтепродуктов в выборке штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов позволила, с учетом морфоти-па колоний, определить критерии экспресс-отбора культур для использования в иммобилизованном виде при биоремедиации. Впервые обнаружена зависимость конвективного переноса бактерий в почве и песке от показателя гидрофобности клеток и присутствия углеводородного поллютанта. Высокая эффективность иммобилизованных клеток относительно свободных обнаружена при биоремедиации нефтезагрязненных песка и песчаного грунта, характеризующихся интенсивным вымыванием внесенных клеток. Оптимизированы составы жидких минеральных питательных сред, а также условия адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов.
Практическая значимость работы
Полученные данные успешно используются в работах по биологической очистке и рекультивации нефтезагрязненных почв, грунтов, а также де-токсикации нефтешламов, проводимых центром «Биотехнология» на территории Краснодарского и Ставропольского краев. Обработки углеводородзаг-рязненных грунтов биомассой нефтеокисляющих микроорганизмов осуществляются с учетом гидрофобности клеток и интенсивности их конвективного переноса. Апробированная в модельных и полевых условиях иммобилизованная система использована в качестве основы для нефтеокисляющего биопрепарата. Проведенные исследования также служат научной основой создания способа очистки нефтяных шламов и загрязненного грунта. По результатам исследований получено 2 патента РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту Показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний на питательном
агаре в совокупности могут быть взяты в качестве критериев экспресс-
10 отбора штаммов из состава коллекций нефтеокисляющих микроорганизмов для интродукции в объект очистки в адсорбционно иммобилизованном на сорбент нефтепродуктов виде.
Интенсивность конвективного переноса микроорганизмов в почве и песке различна и зависит от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия углеводородного поллютанта. Иммобилизация микроорганизмов на носитель исключает их конвективный перенос.
При глубинном культивировании на жидких минеральных средах оптимизированных составов продукции биомассы нефтеокисляющих но-кардиоморфных актиномицетов штаммоспецифично возрастают при использовании в качестве основ сред дистиллированной, а также морской воды.
Условия адсорбционной иммобилизации нокардиоморфных актиномицетов на сорбент нефтепродуктов, включающие пониженное значение рН среды иммобилизации и присутствие катионов алюминия штаммоспецифично обеспечивают увеличение показателя адгезии клеток.
Адсорбционно иммобилизованные клетки родококка эффективнее свободных при биоочистке нефтезагрязненных песка, песчаного грунта и воды. В случае очистки нефтезагрязненных черноземной и луговой глинистой почвы, эффективности применения иммобилизованных и свободных микроорганизмов сходны.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих конференциях, съездах и конгрессах: второй и четвертый съезды общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2004 и 2006 гг.), 2nd FEMS congress of euro-pean microbiologists (Мадрид, 2006), международная конференция "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005 г.), 6-я и 10-я Пущинские школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2002, 2006 гг.), международная шко-
латконференция; посвященная 100-летию- со» дня рождения; С.И.Алиханяна. «Еёнетика;микроорганизмов и биотехнология» (Москва -Иущино,. 2006 г.), третий московский международный, конгресс « Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005),. Всероссийский смотр-конкурс научно-технического творчества? «Эврика;- 2005» (Новочеркасск, 2005); конкурс научных проектовстудентов и аспирантов в области экологии «ЭкоЛогичные технологии» (Москва, 2005), 2-я; Всероссийская;научная конференция? молодых учёных и студентов (Краснодар; 2005), международная? конференция? «Биоресурсы;, биотехнологии;, экологически; безопасное развитие регионов, юга России» (Сочи;;, 2007), краевая, научно-практическая г конференция гран-тодержателеш конкурсам РФФИ (Агой; 2007); Ш международная* конференция* «Микробное;разнообразие: состояние, стратегия;сохранения; биотехнологическиш потенциал; «IC0MID -2008» (Пермь, 2008), конкурс научно,—технического творчества; молодежи :«НГШР- 2008» (Москва; 2008),-. российская! школам— конференция? . «Еенетикамикроорганизмов и биотехнология» (Москва - Иущино, 2008).
Публикации* ,
Иоматериалам;исследованийопубликовано;;22 работы, из них Зг; статьи; одна из которых в отечественном. рецензируемом» издании; рекомендованном ВАК РФ; 2 патента РФ; 17 тезисов российских, международных и зарубежных конференций.
Структура и объём работы;
Диссертация состоит из введения; обзора литературы, материалов=и; методов,, описания проведенных исследований, выводов, заключения и приложения; Работа изложена^ на 153- листах машинописного' текста, содержит 26 рисунков; 16 таблиц, 5 приложений. Єписоклитературьг включает 232 наименования; втом числе76зарубежныхисточников;;
Способы и механизмы иммобилизации микробных клеток
Явление иммобилизации микроорганизмов впервые было использовано в связи с необходимостью отделения продукта синтеза от биологического агента при высокой скорости микробной конверсии: клетки ацетобактера, иммобилизованные на дубовых опилках, применялись еще в середине 19 века при получении уксуса. Закрепление микроорганизмов на носителе позволило осуществлять непрерывное культивирование практически без потерь клеток.
Существуют следующие основные приемы иммобилизации клеток, различающиеся строением получаемой иммобилизованной системы: (Сини-цын и др. 1994, Демаков и др., 2008):
адсорбционная иммобилизация (иммобилизация на носителе);
иммобилизация в носителе;
иммобилизация с использованием мембранной технологии;
искусственная агломерация клеток («безносительный» метод). Наиболее простым и широко распространенным способом получения иммо билизованных микробных клеток является адсорбционная иммобилизация, при которой закрепление микроорганизмов происходит на поверхности ма териала носителя. При этом развитая поверхность носителя способствует ад гезии большего числа клеток при условии монослойной адгезии. В случае, если в материале носителя присутствуют открытые поры, и их размер позво ляет колонизацию внутренней поверхности клетками, то это также способст вует прикреплению большего числа клеток. Существует видоспецифичная зависимость количества адгезировавшихся микроорганизмов от размера пор. Принято считать (Звягинцев, 1973; 1987), что оптимальным считается размер пор, в 3-5 раз превышающий размер клетки. В.В. Самонин и Е.Е. Еликова
(2004) на примере Acinetobacter sp. и Bacillus mucilaginosus показали, что сложная форма зависимости адгезии клеток от диаметра пор может быть связана со снижением интенсивности взаимодействий при снижении кривизны поверхности. При невозможности проникновения микроорганизма в пору ввиду её малого размера, прикрепление осуществлялось за счет внедрения в пору жгутиков, о чем свидетельствовал высокий титр на адсорбентах с радиусом пор менее 0,3 мкм. При изучении адгезии сахаромицетов в частицах носителя, полученного из Wollfia arrhiza, была отмечена интенсивная колонизация внутренних поверхностей естественных морфологических структур разрушенных растительных клеток (Баулина и др. 1995), представляющих собой систему пор.
Взаимодействие поверхностей при адсорбционной иммобилизации происходит, на начальных этапах, за счет физических механизмов (первичная, или обратимая адгезия) (Родионова и др. 2003). Далее подключаются химические и биологические процессы.
Основными силами, обеспечивающими физическую адсорбцию, являются (Синицын и др. 1994):
ион-ионные взаимодействия;
электростатические взаимодействия заряженных поверхностей клеток и носителя;
Ван-дер-Ваальсовы силы;
гидрофобные взаимодействия.
Ион-ионные взаимодействия основаны на взаимодействии заряженных группировок (как правило, отрицательно (Ascencio et al., 1995)) на поверхности клетки с адсорбентом. Данные силы определяют зависимость начальных этапов адгезии микроорганизмов от рН среды, влияющей на С, — потенциал клетки (Звягинцев, 1987; Синицын и др. 1994), поливалентных катионов, экранирующих отрицательный заряд взаимодействующих поверхностей либо образующих катионные мостики (Звягинцев, 1973; Родионова и др. 2003). Электростатические и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, суперпозиция которых отражена в уравнении Дерягина — Ландау (Синицын и др. 1994), объясняют многие аспекты бактериальной адгезии. Суммарная кривая зависимости свободной энергии системы (клетка-среда-носитель) от расстояния между взаимодействующими поверхностями имеет две области, соответствующие термодинамически выгодным минимумам. Первая область, расположенная на расстоянии менее 1 нм, обеспечивает необратимое прикрепление. Проблема электростатического отталкивания одноименно заряженных поверхностей, препятствующего такому сближению, решается наличием на поверхности микробной клетки фимбрий, пилей и других образований, обладающих минимальным радиусом кривизны. Это объясняет роль различных выростов клеточной поверхности и капсулы в адгезии (Звягинцев и др., 1969; 1971; Смирнова, 2000). Общеизвестным фактом является прикрепление клеток палочковидной формы полюсом к поверхности адсорбента, а также концами пилей и нерабочих жгутиков (Звягинцев, 1973). Сорбция клеток может определяться искусственной микротекстурой поверхности носителя, в том числе включающей формирование соизмеримых с размером клеток микропор (Коваленко и др., 2006, 2008).
class2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ class2 .
Бактериальные штаммы
В качестве носителя клеток использовали сорбент нефти и нефтепродуктов «Эколан», представляющий собой термически обработанные древесные опилки. Для обеспечения воспроизводимости все эксперименты проводили с сорбентом одной партии, произведенным из одинакового сырья (сосновый опил). Используемый в экспериментах сорбент просеивали через сита для удаления пылевой фракции, затрудняющей измерения и получения фракции частиц сорбента 2-4 мм.
Питательные среды, субстраты, реактивы
Для поддержания культур, визуализации морфотипа колоний на плотной среде и наработки биомассы клеток для определения показателей адгезии и гидрофобности клеток использовали плотную питательную среду - питательный агар следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 24,0; натрий хлористый - 4,0; агар - агар микробиологический -12,0+2,0; рН 7,3+0,2, вода дистиллированная - 1л. Стерилизацию питательного агара осуществляли автоклавированием при 1 атм. в течение 20 мин. Для наращивания биомассы клеток, а также исследования биодеструкции нефтепродуктов в условиях жидких культур применяли жидкую минеральную среду следующего состава (Нетрусов и др., 2005) (г/л): KNO3 - 4; Na2HP04-12H20 - 1,4; КН2Р04 - 0,6;. MgS04-7H20 - 0,8; стандартный раствор микроэлементов (10 элементов) - 1 мл/л среды. При приготовлении сред использовались минеральные соли марок "ЧДА" "ХЧ" и "Ч". В качестве единственного1 источника углерода и энергии брали гексадекан или нефтепродукты из ряда: летнее дизельное топливо (массовая доля серы - не более 0»2%, марка Л-0,2-40), нефть Западно-Сибирская, топочный, мазут марки 40, вносимые в среду в необходимом количестве в зависимости от целей культивированиям Стерилизацию жидкой минеральной среды осуществляли- автоклавированием при 1 атм. При этом» раствор«фосфатов, автоклавировали отдельно от раствора сульфата магния и микроэлементов во избежание образования нерастворимого осадка. После стерилизации растворы стерильно смешивали в необходимой пропорции. Углеводороды стерилизовали отдельно автоклавированием при 0,5 атм. в течение 20 мин.
Для отмывки биомассы-использовали либо вышеуказанную стерильную питательную среду, не содержащую углеводороды, либо фосфатный буфер (рН 6,7) следующего состава:
Na2HPO4B2H20 - 5,94 г; КН2Р04 - 4,54 г, вода дистиллированная - 1 л.
В работе также были использованы буферные растворы следующего состава (Краткий химический справочник, Рабинович В.А.) :
рН 5,4: Na2HP04-2H20 - 5,94 г; КН2Р04 - 4,54 г, вода -1 л. рН 8,0: Na2HP04-2H20 - 11,22 г; КН2Р04 - 0,50 г, вода -1 л.
Отбор нефтеокисляющих микроорганизмов для внесения в объект биологической очистки в иммобилизованном виде
Микробиологические методы очистки и детоксикации объектов окружающей среды основаны на внесении биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов, в том числе предварительно иммобилизованной на носитель. Одним из первичных этапов биостимуляции in vitro, подразумевающей получение чистых культур аборигенных нефтедеструкторов, является отбор ограниченного числа изолятов. Аналогичная проблема имеет место в случае биоаугментации (Бельков, 1995), когда при наличии в рабочем музее большого числа альтернативных штаммов также возникает проблема выбора. Многие технологически важные признаки, в частности деструкционная активность по отношению к углеводородам (Грищенков и др., 1997), способность к адгезии (Звягинцев, 1987; Могилевич, 1995) и другие являются штаммоспецифичными, в связи с чем, идентификация культуры до вида недостаточна для принятия решения о её использовании в работе. В результате, возникает необходимость отбора изолятов по ряду ключевых для предстоящей работы признаков.
Важной особенностью отбора штаммов, использование которых предполагается в адсорбционно иммобилизованном виде, является учет способности микроорганизмов к адгезии на выбранный для работы носитель. Соотношение гидрофобностей клетки и сорбента, в данном случае, выступает как показатель устойчивости иммобилизованной системы (Bos et al., 2000).. Эксплуатация иммобилизованной системы в условиях интенсивного вымывания биомассы требует эффективного закрепления клеток на поверхности и в открытых порах носителя. Такие условия имеют место при очистке от нефтепродуктов поверхности водных объектов, а также обильно увлажняемых нефтезагрязненных грунтов легкого сложения. Собственная адгезивная активность ксерочувствительных штаммов особенно важна при невозможности высушивания иммобилизованной системы до воздушно-сухого веса. Высушивание в данном случае применяется для удаления нанослоя воды, препятствующего прочной необратимой адгезии клеток на поверхности носителя (Звягинцев, 1973; Синицын и др., 1994).
Для отработки отбора по комплексу технологически важных признаков была взята выборка из 49 штаммов микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности утилизировать в качестве единственного источника углерода и энергии нефтепродукты и многие индивидуальные углеводороды. Таксономический состав выборки был сходен со среднестатистическим составом, рабочих коллекций», нефтеокисляющих микроорганизмов, выделяемых сотрудниками центра «Биотехнология» из нефтезагрязненных объектов. Со став охватывал основные группы бактерий, используемые в биоремедиации нефтезагрязненных почв, грунтов, нефтешламов (Коронелли, Нестерова, 1990). Использованные в работе штаммы имели следующую- таксономическую принадлежность: Rhodococcus sp. (18 штаммов), Rhodococcus erythro-polis (2 штамма), Rhodococcus rhodochrous (1 штамм), Dietzia maris (3 штамма), Gordonia amicalis (2 штамма), Gordonia sp. (3 штамма), Nocardia sp. (1 штамм), Micrococcus sp. (2 штамма), Pseudomonas sp. (2 штамма), Arthrobacter (1 штамм), Kocuria (2 штамма) и Planococcus (1 штамм). Выборка включала , ряд штаммов, предварительно идентифицированных как нокардиоморфные актиномицеты.
