Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Влияние нефти на окружающую среду 9
1.1.1. Воздействие нефтепродуктов на почву в условиях северного климата 10
1.1.2. Изменения в составе гумуса в результате загрязнения нефтью 12
1.1.3. Влияние загрязнения нефтью на почвенные ферменты 13
1.1.4. Особенности трансформации нефтезагрязнений в почве северных регионов 16
1.1.5. Влияние нефти на растения 17
1.1.6. Воздействие нефтепродуктов на животных и человека 24
1.2. Способы восстановления почв 27
1.2.1. Способы и определяющие факторы ремедиации 27
1.2.2. Сорбенты для сбора нефтепродуктов 29
1.2.3. Деструкция углеводородов микроорганизмами 35
1.2.4. Роль плазмид бактерий в биодеградации компонентов нефти 44
1.2.5. Коммерческие препараты на основе микроорганизмов для очистки почвы и водных объектов от нефтепродуктов 46
1.2.6. Фиторемедиация 49
1.2.7. Проведение биоремедиационных работ 52
Глава 2. Объекты и методы исследования 60
2.1. Методы выделения, идентификации и хранения штаммов- деструкторов нефтепродуктов 60
2.2. Методы изучения физиологических и биохимических свойств штаммов микроорганизмов 64
2.3. Методы изучения биодеградации нефтепродуктов 66
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 70
3.1. Выделение и идентификация штаммов-деструкторов нефтепродуктов 70
3.2. Морфолого-культуральные и физиологические свойства штаммов- деструкторов Yarrowia lipolytica, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter junii, Enterobacter sp. 75
3.3. Биодеградация нефти бактериальными и дрожжевыми штаммами микроорганизмов 83
3.4. Оценка деструкции н-алканов микроорганизмами 84
3.5. Оценка деструкции ароматических углеводородов микроорганизмами 94
3.6. Исследование биодеструкции нефти в природных условиях 102
3.7. Рост растений в загрязненной нефтью почве и почве, очищенной биодеструкторами Yarrowia lipolytica и Enterobacter sp. 106
Заключение 111
Выводы 117
Список литературы 118
Приложениие 141
- Влияние нефти на окружающую среду
- Методы выделения, идентификации и хранения штаммов- деструкторов нефтепродуктов
- Выделение и идентификация штаммов-деструкторов нефтепродуктов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Нефтедобывающая промышленность и трубопроводный транспорт по уровню негативного влияния на окружающую среду приближаются в перечне наиболее «грязных» отраслей в России к таким лидерам, как черная и цветная металлургия, нефтехимия и электроэнергетика. От всех объектов нефтегазовой отрасли в окружающую среду попадает большое количество загрязняющих веществ (Murygina et al., 2000).
Основные вредные выбросы загрязнителей при добыче нефти и газа происходят при аварийном фонтанировании, опробовании и испытании скважин, испарениях из мерников и резервуаров, очистке технологических емкостей, на установках комплексной подготовки и очистных сооружениях (Мазур, 1996). Проведение рекультивационных работ в местах утечек является одним из важнейших природоохранных мероприятий, направленных на восстановление биогеоценозов загрязненных земель и водоемов.
Проблема загрязнения окружающей среды нефтью особенно актуальна для Сибири, где располагается основной нефтегазоносный район России (территория Ханты-Мансийского автономного округа). Негативное влияние нефти распространяется на все составляющие экосистем Севера: ухудшается качество маломощного гумусового слоя, нарушаются аэрация, гидрологический режим и микрорельеф верхних горизонтов почвы, увеличиваются техногенные площади и, как следствие, изменяется биологическое разнообразие природных ландшафтов, разрушаются устоявшиеся трофические цепи. Загрязнение нефтью представляет собой экологическую опасность для живых организмов в связи с такими свойствами, как токсичность, канцерогенность, биоаккумуляция (возможность накопления компонентов нефти в живых организмах).
Для уязвимых северных экосистем со специфическими природно-климатическими условиями (длительный период с отрицательными температурами воздуха, наличие многолетнемерзлых пород), где самоочищение происходит медленно, необходимость биоремедиации не вызывает сомнений. Легко разрушаемые при техногенном воздействии в результате интенсивного освоения природных ресурсов и медленно восстанавливающиеся природные экосистемы требуют разработки особого подхода к решению экологических проблем. Одно из приоритетных решений для Сибири - проведение биоремедиационных работ с использованием микроорганизмов-деструкторов и/или применение органо-минеральных сорбентов естественного происхождения.
В связи с тем, что биологическая деградация нефти в окружающей среде начинается микроорганизмами-деструкторами, важно, чтобы их численность была высокой (особенно на начальном этапе восстановления экосистемы). Это не всегда возможно, поскольку микробоценоз страдает от токсического шока, вызываемого поступлением больших количеств нефти в случае разлива, и численность микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-деструкторов (биодеструкторов) позволяет усилить и ускорить разрушение нефти. Для условий севера оптимальным является внесение психротолерантных микроорганизмов, способных функционировать при пониженных температурах. Целесообразным является внесение подкормки для микроорганизмов в виде минеральных и органических веществ для создания оптимальных условий жизнедеятельности. Одним из эффективных приемов биоремедиации является сочетание использования штаммов-деструкторов, природных сорбентов, высева травянистых растений. Эти технологии очистки от нефтепродуктов являются перспективными, поскольку позволяют без значительного ущерба для природы восстановить экосистемы.
Цель исследования. Целью исследования являлось выделение психротолерантных микроорганизмов-нефтедеструкторов и создание ассоциаций, способных эффективно деградировать нефть и нефтепродукты в климатических условиях Сибири с перспективой их использования для биоремедиации.
Основные задачи исследования:
1. выделение и идентификация штаммов микроорганизмов, утилизирующих нефть;
2. оценка степени биодеградации н-алканов и ароматических углеводородов микроорганизмами-деструкторами, выделенными из природных биоценозов;
3. создание ассоциаций штаммов микроорганизмов, включающих разные таксономические группы, способных к эффективной утилизации нефти;
4. оценка роста и развития растений в очищенной биодеструкторами почве.
Научная новизна работы. Выделены и идентифицированы новые штаммы микроорганизмов, обладающие высокоэффективной нефтеутилизирующей активностью, адаптированные к климатическим условиям Сибири, способные к росту в широком диапазоне рН и содержания NaCl. Определена степень утилизации углеводородов нефти Западной Сибири и республики Коми штаммами выделенных микроорганизмов.
Практическая значимость. Полученные штаммы микроорганизмов, часть из которых защищена патентами (№ 2272071, № 2271390 в приложении), предложены для использования с целью биоремедиации окружающей среды (почв, водоемов), очистки нефтезагрязненных промышленных объектов в условиях северного климата.
Положения, выносимые на защиту:
1. бактериальные штаммы Acinetobacter junii El 133, Acinetobacter calcoaceticus El 134, Acinetobacter calcoaceticus El 135, выделенные из антропогенно загрязненной реки, Enterobacter sp. В 1024, выделенный из эвтрофного озера, дрожжи Yarrowia lipolytica Y 1064, выделенные из торфа, являются эффективными биодеструкторами нефти, утилизирующими до 97% н-алканов и до 53,5% ароматических компонентов нефти.
2. обработка нефтезагрязненных сред ассоциацией штаммов Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024, штаммами Acinetobacter способствует ускорению деструкции нефти.
3. утилизация нефти происходит с большей эффективностью в ассоциации Yarrowia lipolytica Y 1064 и Enterobacter sp. В 1024 по сравнению с применением монокультуры штамма Yarrowia lipolytica Y 1064.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международных конференциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов» (Иркутск, 2005), международном Конгрессе «Экватэк-2004» (Москва, 2004), международных конференциях «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2004), «Наука и Бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Украина, 2003), «Innovate roles of biological resource centers» (Tsukuba, Japan, 2004), межрегиональных научно-практических конференциях «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), «Современные проблемы геохимической экологии и сохранения биоразнообразия» (Бишкек, Киргизия, 2003), Международном Байкальском Симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водоемов» (Иркутск, 2003), межрегиональном совещании «Проблемы биоремедиации в XXI веке» (Красноярск, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.
Личный вклад. Автору принадлежат постановка задач, выделение природных изолятов микроорганизмов из различных биоценозов, их идентификация, выявление биохимических и физиологических свойств, выделение ДНК, амплификация, оценка нефтеутилизирующей активности, создание ассоциаций штаммов микроорганизмов, постановка и осуществление опытов с растениями.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы из 236 наименований, в т.ч. 85 на иностранном языке, приложения. Работа изложена на 143 листах машинописного текста и содержит 16 таблиц и 21 рисунок.
Влияние нефти на окружающую среду
Нефть представляет собой сложную смесь трудноутилизируемых в природе компонентов. 70 - 90 % от всех веществ нефти составляют углеводороды трех классов: парафиновые, нафтеновые, ароматические (Панченко и др., 2003). Чем меньше молекулярный вес компонентов нефти, тем выше скорость ее распространения в окружающей среде. Токсичные бензиново-керосиновые фракции и ароматические соединения, хорошо растворяясь в воде, способны мигрировать на значительные растояния в горизонтальной плоскости и глубоко распространяются по почвенному профилю. Моноядерные углеводороды - бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое воздействие на организмы, чем ПАУ, так как крупные молекулы ПАУ медленнее проникают через мембраны клеток (Ягафарова, 2001).
Вредное экологическое влияние смолисто-асфальтеновых компонентов на почвенные экосистемы заключается не в химической токсичности, а в значительном изменении водно-физических свойств почв. Смолисто асфальтеновые компоненты обладают крайне низкой степенью миграционной активности, сорбируются в основном в верхнем, гумусовом горизонте, вызывая его прочную цементацию и уменьшая поровое пространство почв. Присутствие сернистых соединений, входящих в состав смол и асфальтенов нефти, увеличивает ее токсичность (Сергиенко и др., 1979).
Неуглеводородными компонентами нефти являются минерализованные пластовые воды (преимущественно хлоридно-натриевые и хлоридно-кальциевые), которые содержат от 10 до 50 г солей в литре, а также повышенное содержание хлора, брома, йода, бора, бария, стронция, железа. В результате поступления промысловых вод увеличивается плотность почв, нарушается структура, уменьшается водопрочность, происходит дегумификация, ухудшается питательный режим (Габбасова, Сулейманов, 2007).
Добываемая сырая нефть, особенно на месторождениях частично выработанных, как правило, сильно обводнена. При ее разливах сплошной покров нефти отсутствует, нефтяное загрязнение комбинируется с засолением, вызванным пластовыми водами. В среднем на каждом 1 м нефтезагрязненной почвы концентрируется до 1,5-1,7 кг нефтяных углеводородов (Васильев, 1998).
Расчеты по Ватинскому месторождению нефти в Западной Сибири показывают, что на его территории концентрации углеводородов превышают в 28 раз их максимальное фоновое содержание, а на каждый 1 м2 поверхности (исключая собственно поверхности разливов) приходится около 20 г нефти (Сивоконь, 1997).
Методы выделения, идентификации и хранения штаммов- деструкторов нефтепродуктов
Штаммы-нефтедеструкторы выделяли из загрязненных грунтов в районе месторождений нефти в Ханты-Мансийском автономном округе (ХМАО), Ямало-Ненецком автономном округе (ЯНЛО), реликтового торфа Васюганской низменности (ХМАО), почвы прибрежной зоны реки Катунь (Горный Алтай), почвы зоны вечной мерзлоты Якутии, ила загрязненного эвтрофного озера Кротовая Ляга (Новосибирская область), иловых осадков и воды антропогенно загрязненных рек Новосибирской области: Ельцовки-1, Койнихи, Власихи, Чика, Издревой.
Грунты на территориях нефтедобычи (ХМАО, ЯНАО), антропогенно преобразованные места (водные объекты на территории города или в зонах активного природопользования) содержат, как правило, в составе микробиоты значительное количество микроорганизмов-деструкторов.
ХМАО и ЯНАО располагаются в центральной части Западной Сибири на территории сильно заболоченной тайги и являются основным нефтегазоносным районом России, одним из крупнейших нефтедобывающих регионов мира. Крупными месторождениями нефти на территории ХМАО являются Сугмутское, Западно-Ноябрьское, Средне-Итурское, Суторминское, Вынгапуровское, Муравленковское, Меретояхинское, Романовское, Спорышевское, Суторминское, Холмогорское, Лас-Еганское и др.
Васюганская низменность располагается в заболоченной среднетаежной и южнотаежной подзонах. Крупными месторождениями нефти на территории Васюганской низменности являются: Ломовое, Оленье, Первомайское, Западно-Катыльгинское, Катыльгинское, Игольско-Таловое и Лотынь-Яхское.
С целью выделения штаммов, способных не только к деструкции нефти, но и устойчивых к другим антропогенным загрязнителям, в качестве субстратов для выделения использовали образцы воды и донных отложений малых рек, протекающих по территории г. Новосибирска и области. Наиболее характерными загрязняющими веществами городских водных объектов являются нефтепродукты. Например, среднегодовая концентрация нефтепродуктов в воде реки Ельцовки-1 весьма существенна, составляет 0,73 мг/л. Н-алканы являются типичными углеводородами, содержащимися в составе нефтепродуктов, поступающих с ливневым стоком в русла рек. Вода городской реки Ельцовки-1 относится к 5 классу качества (абсолютная непригодность для всех видов водопользования и опасность для здоровья населения). Малые реки Чик, Издревая, Койниха, Власиха, протекающие в Новосибирской области, подвергаются антропогенному воздействию из-за наличия садовых обществ и населенных пунктов по берегам. Река Власиха, кроме этого, подвергается загрязнению стоками аэропорта. Деструкцию углеводородов обеспечивает эндогенная углеводородокисляющая микробиота воды и донных отложений реки, которая способствует естественным процессам самоочищения.
С целью выделения штаммов, имеющих широкий спектр ферментов, разрушающих сложные органические вещества, использовали образцы воды и иловых отложений эвтрофного озера Кротовая Ляга. Особенностями озера являются замедленный водообмен и накопление питательных веществ вследствие антропогенного воздействия. В связи с распашкой земель и использованием удобрений в озеро Кротовая Ляга усиливается поток биогенных элементов, что ведет к увеличению биологической продуктивности и является основной причиной эвтрофирования и деградации водоема. Такие бессточные или слабопроточные водоемы постепенно превращаются в накопители различных загрязнителей (Экология зарастающего озера..., 1999).
Выделение и идентификация штаммов-деструкторов нефтепродуктов
Идентификация на основе определения жирнокислотного профиля микроорганизмов, разработанная MIDI Sherlock System (США), позволяет определить штаммы по видоспецифичному признаку - составу и соотношению жирных кислот в клетке.
В клетках бактерий найдено более 300 жирных кислот и связанных с ними компонентов. Жирные кислоты с количеством атомов углерода в цепочке от 9 до 20 являются характерными и видоспецифичными для бактерий, поэтому именно на их основе разработана Система MIDI Sherlock System (Sasser, 2001). Штаммы, отнесенные к роду Acinetobacter, имели в составе клеток жирные кислоты с количеством атомов углерода от 10 до 18 (Табл. 6).
Жирные кислоты с разветвленными цепочками (метальные остатки в изо- и антеизо-конфигурациях) характерны для грам положительных бактерий, в то время как жирные кислоты с прямыми короткими углеродными цепочками характерны для грамотрицательных бактерий. Однако, жирнокислотный состав грамотрицательных штаммов Acinetobacter показал также наличие метальных остатков в разных положениях углеродной цепи. Наличие липополисахаридов в клетках штаммов грамотрицательных бактерий предполагает повышенное содержание гидроксилированных жирных кислот. Гидроксигруппы в составе жирных кислот находят, преимущественно, у грамотрицательных бактерий, в том числе найдены они и у представителей рода Acinetobacter. Присутствие гидроксигрупп в положениях 10:0 ЗОН, 12:0 ЗОН, и/или 14:0 ЗОН у жирных кислот показывает, что штамм относится к грам отрицательным бактериям. Соответственно, отсутствие гидроксигрупп в этих положениях свидетельствует о том, что штамм является грамположительным. Таким образом, при проведении жирнокислотного анализа выявляется, относится штамм к грамположительным или к грамотрицательным бактериям, и необязательно предварительно осуществлять традиционную окраску по Граму. Циклопропановых кислот, характерных для жирнокислотного профиля грамотрицательных бактерий, у штаммов Acinetobacter не обнаружено.
