Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы 9
1.1. Изменения свойств почвы под воздействием нефти и нефтепродуктов 9
1.2. Оценка состояния основных почвенных элементов в загрязненных нефтью почвах 10
1.2.1. Соотношение форм азота в загрязненной и незагрязненной нефтью почве 10
1.2.2. Влияние нефтяного загрязнения на содержание в почве фосфора 14
1.2.3. Формы калия в почве 15
1.2.4. Почвенный магний 16
1.3. Применение минеральных удобрений 16
1.4. Токсическое действие нефти на почвенную микробиоту 18
1.5. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью 19
1.6. Этапы естественной деградации нефти в почве 21
1.7. Рекультивация загрязненных нефтью почв 2 3
1.8. Микробиологические механизмы утилизации нефтяных УГВ .27
1.9. Биоремедиация 31
1.9.1. Принципы технологий биоремедиации 32
1.9.2. Эффективность различных методов ремедиации почв 33
1.10. Роль биопрепаратов-нефтедеструкторов в процессе биоре медиации 34
1.10.1. О роли ассоциаций микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов в почве 39
1.10.2. Адгезия микроорганизмов на носителях и иммобилизованные формы биопрепаратов в очистке почвы и воды от нефтезагрязнений 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Углеводородокисляющие культуры и условия их культивирования 4 4
2.2. Характеристика носителей 45
2.3. Получение иммобилизованных клеток 45
2.4. Условия проведения экспериментов по биодеструкции мазута нативными и иммобилизованными клетками 46
2.5. Методы определения содержания нефтепродуктов 47
2.5.1. Инфракрасная спектроскопия 48
2.5.2. Флуоресцентный метод определения НУГВ 50
2.5.3. ЯМР- спектроскопия 51
2.6. Методика проведения 1-го почвенного эксперимента 52
2.7. Методика проведения 2-го почвенного эксперимента 55
2.8. Методика проведения промышленного полевого эксперимента 56
2.9. Определение клеточного титра 57
2.10. Определение концентрации ионов аммония, нитратов, фосфатов и магния в почве 57
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 58
3.1. Скрининг микроорганизмов, окисляющих тяжелые нефтепродукты 58
3.2. Выбор носителей для иммобилизации алканотрофных культур 62
3.3. Выбор и оптимизация питательных сред для микроорганиз-мов-нефте деструкторов 63
3.4. Деструкция мазута в жидких питательных средах 69
3.5. 1-ый почвенный эксперимент 71
3.6. 2-ой почвенный эксперимент 7 6
3.6.1. Динамика снижения концентрации биогенных ионов во 2-ом почвенном эксперименте 77
3.6.2. Динамика изменения концентрации мазутных углеводородов во 2-ом почвенном эксперименте 80
3.6.3. Значения рН и влажности во 2-ом почвенном эксперименте 88
3.6.4. Состояние алканотрофной микрофлоры при биодеструкции мазутных углеводородов в почве 91
3.7. Натурная апробация (испытания) 92
Выводы 95
Список литературы 96
Приложения 107
- Соотношение форм азота в загрязненной и незагрязненной нефтью почве
- Адгезия микроорганизмов на носителях и иммобилизованные формы биопрепаратов в очистке почвы и воды от нефтезагрязнений
- Выбор и оптимизация питательных сред для микроорганиз-мов-нефте деструкторов
- Динамика изменения концентрации мазутных углеводородов во 2-ом почвенном эксперименте
Соотношение форм азота в загрязненной и незагрязненной нефтью почве
Азот почвы можно разделить на пять категорий: 1. азот органического вещества; 2. минеральный азот в почвенном растворе или в обменном состоянии; 3. азот растительных остатков; 4. аммоний, фиксированный в глинистых минералах; 5. газообразный азот в почвенной атмосфере. Взаимообмен различных форм азота определяется главным образом микробиологической активностью почвы. Обычно минерального азота гораздо меньше, чем органического. Органический азот можно разделить на легко минерализуемую и стабильную фракции. На долю первой обычно приходится менее одной трети всего органического азота почвы. В среднем, в органическом веществе почвы содержится 5% азота (масса/масса). Общее содержание азота в почве изменяется в широких пределах и зависит от степени богатства почвы гумусом. В мощных черноземах содержание общего азота доходит до 0,05% от веса почвы, а в бедных песчаных почвах оно падает до 0,03%.
Неорганический азот в почве присутствует обычно в форме ионов NH+4 и NO"3/ лишь в некоторых почвах с высокими значениями рН могут встречаться небольшие количества ионов NO"2 В почвах со значительным содержанием органического вещества минеральный азот составляет обычно менее 5% всего азота почвы. В почве постоянно идет процесс высвобождения азота из органической фракции благодаря микробиологическому распаду органического вещества (аммонифик-сация). В то же время неорганический азот превращается в органический в ходе микробиологического распада углеродсодержащих растительных остатков. Из-за микробиологической активности почвы содержание аммония и нитратов в ней никогда не бывает постоянным, при внесении неорганического азота, часть его связывается в органических соединений, а затем может снова высвобождаться в минеральной форме.
При денитрификации нитратов образуются оксид азота(IV)N02 и молекулярный азот N2. Эти газы накапливаются в порах почвы и могут выделяться в атмосферу. Молекулярный азот почвенной атмосферы используют как азотфиксирующие микроорганизмы, например Rhizobium, так и несимбиотичесике микроорганизмы, например Azoto-bacter и Clostridium/4/.
Азот занимает особое место среди химических элементов, участвующих в круговороте веществ в почве. Большинство его превращений осуществляется микробиологическим путем, хотя возможны и чисто химические реакции/5/. В связи с этим представляет интерес проблема влияния загрязнения нефтепродуктами на превращения соединений азота в почве. Она тесно связана с практическими вопросами биодеградации нефтяных углеводородов.
Парафиновые и циклопарафиновые углеводороды увеличивают численность бактерий, утилизирующих органические и минеральные формы азота. Ароматические углеводороды, напротив оказывают инги-бирующее действие на численность этих микроорганизмов. При воздействии н-парафиновых и циклопарафиновых углеводородов преобладает эколого-трофическая группа, потребляющая минеральные формы азота. При загрязнении ароматическими углеводородами это соотношение меняется/б/.
Интенсивное размножение аммонификаторов и бактерий, использующих минеральный азот при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами обедняет почву питательными веществами, что приводит к снижению уровня биогенности в дальнейшем при "старении" загрязнения/7/ .
Наиболее чувствительны к нефтяному загрязнению нитрифицирующие бактерии. Их численность падает с увеличением концентрации нефти, не восстанавливаясь до уровня фонового и через 10 лет после загрязнения/7/.
Снижение численности нитрофицирующих микроорганизмов в загрязненной почве связано с тем, что в почве создается неблагоприятный для них воздушный режим. Кроме того, одна из отличительных особенностей нитрификаторов - их очень высокая "чувствительность к присутствию в среде органических соединений. Нитрификаторы в нормальной почве не встречают большого количества легкоусвояемых органических веществ, а углеводороды нефти сами представляют собой относительно легкоусвояемые органические соединения. С другой стороны, как показали исследования, биодеградация нефти в процессе самоочищения сопровождается увеличением содержания органического вещества почвы/8/.
Загрязнение почвы нефтью ведет к исчезновению нитратного азота и к накоплению аммонийного азота. Обусловлено это подавлением жизнедеятельности нитрифицирующих бактерий. Развитие которых угнетается как избытком углеродосодержащих соединений и продуктов их распада, так и сдвигом соотношения C/N.
Значительную роль в азотном балансе почв играют азотфиксато-ры и олигонитрофилы. Как известно, многие олигонитрофильные бактерии способны фиксировать молекулярный азот атмосферы, что определяет их участие в регулировании азотного баланса почвы.
Нефть в различных концентрациях стимулирует развитие олиго-нитрофилов, аэробных и анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов/7/. Однако между численностью азотфиксирующих микроорганизмов и азотфиксацией нефтезагрязненной почвы тесной связи не обнаруживается. Наоборот, с увеличением дозы нефти азотофиксирующая активность почвы снижается.
Адгезия микроорганизмов на носителях и иммобилизованные формы биопрепаратов в очистке почвы и воды от нефтезагрязнений
Естественная очистка воды и почвы от нефтепродуктов и других органических загрязнений осуществляется путем сложных окислительных процессов в естественных биоценозах, содержащих ассоциации микроорганизмов, водорослей, простейших. Для ускорения этого процесса используют биологический метод очистки/83/, заключающийся в том, что к естественной ассоциации микроорганизмов добавляют чистые или смешанные культуры микроорганизмов супердеструкторов/3,83/. В настоящее время большой интерес представляют не штаммы чистых культур, а искусственно созданные ассоциации, которые более активно и полно утилизируют нефтяные углеводороды. В модельных экспериментах/83,84,85/ показано, что в результате применения штаммов-деструкторов нефтепродуктов были найдены основные биологические составляющие препарата для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений. Действующим началом его является искусственно подобранная ассоциация микроорганизмов с различным типом метаболизма, относящихся к далеко стоящим токсикологическим группам/83/. Методом накопительных культур из дерново-подзолистой почвы была выделена ассоциация бактерий - деструкторов нефти, состоящая из Rhodococcus longus и Spirillum sp., способная утилизировать нефть при пониженных температурах/34,86/.
Из нефтесодержащих почв выделены штаммы Rhodococcus sp.1418 и Rhodococcus sp. 1716, использующие углеводородсодержащие субстраты, в т.ч. нефть и ее тяжелые фракции (смолы, асфальтены, мазут), в качестве единственного источника углерода и энергии. Обнаружено, что данная ассоциация способна биодеградировать до 62% нефти при 5% содержании ее в жидкой среде/85/ в течение 2-5 недель при 2 6 С. В модельном эксперименте по очистке почвы этой ассоциацией культур на 11 сутки наблюдалось снижение концентрации нефти от 5 до 1,25%/85/.
Таким образом, разработанные методы позволяют создавать на основе ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов препараты регионального действия, т.е. для различных климатических зон/83/. В ряде природных ассоциаций важную роль играют фотосинтезирующие водоросли. Этот факт изучен сотрудниками отдела Ботаники и Микробиологии Кувейтского университета С.С.Радваном, Н.Сорховом, Р.Х.Аль-Хасаном- появление в Арабском заливе скоплений сине-зеленных водорослей в виде матов (до 5 кг на метр кв.) на поверхности нефтяных загрязнений в полосе прилива вдоль Кувейтского и Саудовского берега. В этих матах сформирован ценоз из нокардиевых форм (Rhodococcus), бактерий(Bacillus, грибов Penicillium), но основная биомасса -резистентные к токсикантам нитчатые цианобак-терии родов Phormidium, Microcoleus, способные не только к фотосинтезу, но и к активному усвоению НУГВ. Члены консорциума дополняют друг друга, так как специализированы на деградации различных компонентов нефти/76,87/. Изучение естественных биоценозов в северных климатических зонах так же указывает на важную роль фото-синтетиков в процессах самоочистки почв и вод. В первые периоды самоочистки особо обильно развиваются эвгленовые водоросли/88/.
Сейчас в России создаются и проходят полевые испытания и санитарно-гигиеническую оценку биопрепараты на основе иммобилизованных микроорганизмов-нефтедеструкторов/89,90/. В настоящее время иммобилизованными полагают такие клетки, для которых созданы искусственные ограничения подвижности во внешней среде, а материальный посредник, обеспечивающий эти ограничения подвижности, считается носителем. Биопрепараты, представляющие собой иммобилизованные формы микроорганизмов состоят из биологического компонента и питательных добавок, нанесенных на минеральную или синтетическую основу. Иммобилизация микроорганизмов (то есть удерживание их носителем) может быть как необратимой, так и временной. Создание иммобилизованных биопрепаратов требует использования в качестве носителя материалов, удовлетворяющих следующим параметрам: экологически нейтральные, инертные, имеющие большое сродство к нефтезаг-рязнениям, обладающие развитой удельной поверхностью, характеризующиеся высокой сорбционной емкостью по отношению к микроорганизмам, для воды - желательно, чтобы носитель обладал хорошими флотационными характеристиками. Ко всем методам иммобилизации клеток предъявляются определенные требования: 1) Прежде всего используемый способ иммобилизации не должен в значительной степени затрагивать ферментативные системы клетки, необходимые для реализации конкретной технологии. Поэтому при проведении иммобилизации желательно исключить, либо свести к минимуму контакт клеток с токсичными для них веществами, а так же предотвратить нежелательное воздействие на микроорганизмы температурных и осмотических воздействий. 2) Как правило, предпочтительно осуществлять иммобилизацию таким образом, чтобы в результате ее клетки надежно удерживались носителем. 3) Желательно, чтобы трудоемкость стадии иммобилизации была по возможности минимальной, как и число манипуляций с клетками (существенно для сохранения стерильности). 4) Необходима хорошая операционная стабильность получаемых иммобилизованных биопрепаратов для их длительной эксплуатации, что зависит от механической, химической и биологической устойчивости носителя в условиях конкретного технологического процесса. 5) Очень важным моментом, особенно при работе с живыми клетками, является обеспечение иммобилизованных микроорганизмов питательными веществами, газообразными субстратами (кислородом для дыхания аэробных клеток) и отвод продуктов жизнедеятельности, то есть материал носителя не должен создавать значительных диффузионных препятствий массообменным процессам. 6) Важную роль играет невысокая стоимость применяемого метода иммобилизации клеток и исходных компонентов. Известно много минеральных носителей природного происхождения: кремнеземы, силикагели, перлит, вермикулит и т.д.; органического происхождения: торф, опилки, солома, отходы сельского хозяйства; синтетического происхождения: поликапрамидные волокна, жгуты, ткани и т.д.
Выбор и оптимизация питательных сред для микроорганиз-мов-нефте деструкторов
Первый почвенный эксперимент/100/ основан на общих положениях биодеградации НУГВ в почве, изложенных в работах Звягинцева /15/. Для изучения процессов деструкции тяжелых фракций нефти в почве, и свойств свободных и иммобилизованных микроорганизмов нефтедеструкторов был поставлен модельный эксперимент из 7 вариантов имитирующий значительное 190 мг/г загрязнение грунта мазутом. В варианты внесено расчетное /15/ количество биогенов (азот-но-фосфорно-калиевые соли) и биомассы микроорганизмов (106 кл/г грунта). В течение всего эксперимента (70 дней) измерялись концентрацию НУГВ (таблица №20), ионов аммония (таблица №21), фосфат-ионов (таблица №22).
На 2 8 сутки были дополнительно внесены биогенные элементы в количествах равных вносимым в начальной точке. Данные лучшего варианта (вариант №3) представлены на рисунке №3.
В результате проведения исследований по биодеградации 190 мг/г нефтезагрязнения различными алканотрофными культурами и их ассоциациями было показано, что весь процесс биодеградации можно разделить на три временных этапа: первый- с 1-ых по 21 сутки; второй- с 22 по 55 сутки; третий- с 56 по 70 сутки.
На первом временном отрезке наблюдалось устойчивое потребление внесенных азотно-фосфорных удобрений и утилизация НУГВ во всех опытных вариантах. На первом этапе наибольшую скорость биодеструкции НУГВ наблюдали в варианте №3 с иммобилизованной культурой Rh. erythropolis (таблица №20, рисунок №3). В третьем варианте показана наибольшая скорость биодеструкции НУГВ по сравнению с нативнои монокультурой Rh. erythropolis (вариант №2), а так же с ассоциацией двух культур Rh. erythropolis и Ac. oleo-vorum (вариант №5). По потреблению биогенных элементов, на первом этапе, третий вариант показал среднюю скорость (таблица №21). За первых три недели концентрация азота (ионы аммония) в третьем варианте снизилась с 375 мг до 200 мг, а концентрация фосфора сократилась с 760 мг до 600 мг. Достаточно высокие скорости потребления биогенных элементов, на первом этапе, показала свободная культура Rh. erythropolis (вариант №2) и ассоциация двух свободных культур Rh. erythropolis и Ac. oleovorum (вариант №5), таблица №22. Высокие скорости потребления биогенов соответствуют высоким скоростям биодеструкции НУГВ. Возможно, внесение иммобилизованных клеток Rh. erythropolis в варианте №3 обеспечивает более высокую скорость утилизации НУГВ за счет сокращения периода адаптации клеток.
Высокая скорость потребления минеральных компонентов, т.е. активное развитие культуры, в 5 варианте на первом этапе приводило к увеличению скорости биодеструкции НУГВ во втором временном промежутке с 22-ых по 55-е сутки. Он характеризуется умеренными скоростями утилизации НУГВ, кроме 5 варианта, где концентрация НУГВ сократилась в 2 раза (со 165 мг/г до 80 мг/г грунта) и умеренным потреблением минеральных удобрений, что видно даже в 5 варианте. Некоторое торможение процесса биодеструкции на втором этапе, возможно, связано с закислением среды из-за активного биоокисления НУГВ на 1 этапе и вторичном внесении биогенов на 21 сутки. Для почвенных структур показано /94/, что при смещении значений рН в кислую область блокируются или существенно замедляются процессы нитрификации, а следовательно, и скорости роста микроорганизмов и биотрансформации углеводородного субстрата.
Третий этап, начинающийся с 56 суток, характеризуется повышением скоростей потребления НУГВ и солей. Видимо, это связано с внесением на 55 сутки мела, что привело к нейтрализации кислотности среды и тем самым активизировало процессы биоокисления. На третьем этапе наибольшую скорость утилизации НУГВ показал опять 3 вариант, где концентрация мазута сократилась в 2 раза (с 12 до 5,8 %) . Такой же уровень биодеструкции продемонстрировал 5 вариант (ассоциация 2 монокультур). Свободная культура Rh. erythropo-lis показала более высокие скорости утилизации тяжелых фракций нефти, чем свободная культура Ac. oleovorum. В контрольных вариантах так же отмечается понижение концентрации НУГВ и азотно-фосфорных удобрений, хотя и незначительное по сравнению с рабочими вариантами. Это понижение концентрации НУГВ связано с тем, что, кроме выветривания, в контрольных вариантах активизируется аборигенная микрофлора находящаяся в загрязненном грунте. Причем в контрольном варианте с удобрениями степень утилизации НУГВ выше, чем в контрольном варианте (6 вариант) без минеральных добавок. В б варианте уменьшение концентрации НУГВ может происходить за счет процессов выветривания, испарения, что составляет 16%, (контроля с удобрениями не было).
Следует отметить, что за 7 0 дней содержание НУГВ снизилось, по сравнению с исходным количеством, в 3 раза (со 190 до 5 8 мг/г), вариант №2 со свободной монокультурой Rh. erythropolis имеет конечную концентрацию остаточных нефтепродуктов 66 мг/г.
При проведении эксперимента проводилась оценка клеточного титра культур алканотрофов, высевом на твердую питательную среду СПА, в присутствии парафина (таблица №23).
Динамика изменения концентрации мазутных углеводородов во 2-ом почвенном эксперименте
Во втором эксперименте начальный клеточный титр вносимых микроорганизмов бал сразу же специально завышен с 106 до 108 кл/г почвы. Титр был увеличен для более массированного и активного микробиологического воздействия на замазученную почву.
В процессе проведения эксперимента клеточный титр колебался в пределах 108-1010, а в 17 варианте на 116 сутки достигал величины 1011 кл/г почвы. При начальном внесении микроорганизмов 108 кл/г почвы клеточный титр составлял на первых неделях 107 кл/г почвы и на 18 день эксперимента достигал 1010 кл/г почвы. В ходе всего процесса были созданы оптимальные условия для развития и поддержания высокого клеточного титра- 1010 кл/г почвы. После 137 суток проведения эксперимента, когда, как видно из динамики потребления НУГВ, процессы замедлились, уровень клеточного титра понижался до 105-106 кл/г почвы, что может быть связано с исчерпанием всего количества доступного для биоокисления субстрата, так и нарастанием процессов метаболического ингибирования развития и роста алканотрофов.
В 1998-1999 годах была осуществлена натурная апробация разработанных технологических принципов очистки сильно загрязненных мазутом территорий. Работа проводилась по инициативе Управления по экологии и рациональному природопользованию Администрации Ногинского района и Территориальной Администрации поселка им. Воровского и способствовала улучшению экологической обстановки в поселке и в районе в целом (приложение №6). После первой биообработки в течение недели на загрязненной территории произошла адаптация и размножение микроорганизмов-нефтедеструкторов, входящих в состав биопрепаратов «Олеоворин» и «Руден», клеточный титр углеводородокисляющих микроорганизмов составил 105-106 кл/г почвы. Свидетельством активно протекающего процесса утилизации мазута явилось снижение содержания нефтяных углеводородов с 200 до 40 мг/г через два месяца после первой обработки.
Повторная обработка биопрепаратами и рекультивационные работы проводились в период 10-20.08.99 г. Третья биообработка проводилась в период 13-20.09.99 г. Содержание нефтепродуктов в грунте, в целом, после всех рекультивационных мероприятий снизилось до 10 мг/г. Общее количество гетеротрофных микроорганизмов составило 108 кл/г грунта. В октябре содержание углеводородокисляющих микроорганизмов в почве составило 106-107 кл/г грунта. Полученные показатели характерны для процессов биоокисления углеводородных загрязнений: микрофлора грунта представлена, в основном, нефтео-кисляющими микроорганизмами и после каждой обработки биопрепаратами и структурирования грунта их титр возрастает и достигает величины 106 кл/г грунта. После зимы, весной 2000 г. в очищенный грунт высаживалась трава. Концентрация нефтепродуктов снижалась с 10 (октябрь 1999 г.) до 2 мг/г (июнь 2000 г.). В дальнейшем очищенный грунт /101/ и имеющий сплошной травяной покров вывозился для озеленения поселка им. Воровского.
Разработанная нами технология позволяет получить очищенные почво-грунты пригодные для озеленения промышленных территорий. В настоящее время идет промышленное внедрение разработанной нами технологии и осуществляется разработка нормативно-технической документации. 1.Разработаны научные принципы биотехнологической очистки почв Северо-Западного региона сильнозагрязненных мазутом, заключающиеся во внесении в почвы иммобилизованных на торфе ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов, создании и поддержании высокого титра культур в процессе очистки, дробном внесении биогенных элементов, поддержания нейтрального уровня реакции среды в очищаемой почве, аэрации. 2.Проведен мониторинг углеводородокисляющих культур, в результате которого отобраны культуры: Rh. erythropolis, Ac. oleovorum, Ps.putida, П-45, Д1-7, способные окислять мазутные углеводороды. 3. В качестве эффективных и доступных источников N,P,K для роста алканотрофных микроорганизмов предложены минеральные удобрения азофоска и аммофос, расход которых для утилизации 1 г мазута составляет 100 мг. 4.В качестве носителя для иммобилизации алканотрофов предложен верховой торф, позволяющий получить иммобилизованные бактериальные ассоциации с высоким клеточным титром- 1010 кл/г носителя. Выбранный носитель является также хорошим структуратором почвы, обеспечивает создание оптимальных значений влажности и эффективной аэрации. 5.Для нейтрализации почвенной среды и стабилизации величины рН, при биодеструкции мазута алканотрофными микроорганизмами, предложено внесение мела. б.Применение иммобилизованных ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов дает высокий эффект утилизации мазута, биодеструкция при использовании свободных клеток достигала 14-41%, с иммобилизованными клетками - 55-73%.
