Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из острых экологических проблем современности является загрязнение экосистем полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Антропогенное воздействие на окружающую среду становится все более необратимым. Среди множества соединений, образующихся в результате сжигания ископаемых топлив, в производствах химической, нефтехимической, целлюлозно-бумажной, металлургической промышленности, наибольшую опасность представляют вещества группы ПАУ. Особо загрязненными являются территории скопления крупных промышленных предприятий, а также городские земли (Лазарев, 1976; Пурмаль, 1998; Капелькина, 2008).
ПАУ отвечают основным признакам, характерным для стойких органических загрязнителей (СОЗ): стойкость в окружающей среде, устойчивость к деградации, острая и хроническая токсичность, биоаккумуляция, трансграничный перенос на большие расстояния в окружающей среде. ПАУ включены в биосферный круговорот, переходят из одной среды в другую, при этом происходит непрерывный перенос этих веществ по пищевым цепям и их аккумуляция в конечных звеньях, к которым относится и человек. ПАУ токсичны, обладают потенциальным мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием, представляют собой опасность для живых организмов (Fernandez et al., 1992; Sutherland et al., 1995).
Адсорбируясь на твердых частицах пыли, ПАУ оседают в почву, которая является депонирующей средой для этих соединений. Нередко масштабы загрязнений превышают природную способность почвы к самоочищению, поэтому существует необходимость в разработке и применении эффективных методов очистки загрязненных территорий.
Для интенсификации процесса деструкции используют методы биореме-диации загрязненных экосистем. Эти методы основаны, в том числе, на применении микроорганизмов, обладающих огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма, осуществляющих процесс биодеструкции. Микроорганизмы-деструкторы способны использовать большой круг органических экотоксикантов в качестве единственного источника углерода и энергии (Eriksson et al., 2000).
В этой связи актуален поиск новых штаммов бактерий для рекультивации почв, которые были бы устойчивы к условиям восстанавливаемых территорий и могли бы обеспечивать деструкцию ПАУ в значительных количествах.
Все выше изложенное явилось предпосылкой для проведения исследований, результаты которых представлены в данной работе.
Целью данной работы являлось выделение природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ из техногенно загрязненных источников и изучение возможности использования этих ассоциаций для биоремедиации почв, относящихся к категории опасных и чрезвычайно опасных.
В соответствии с целью работы решались следующие задачи:
Выделить устойчивые природные сообщества микроорганизмов-деструкторов ПАУ из загрязненных источников.
Выделить и идентифицировать чистые культуры микроорганизмов-деструкторов из природных ассоциаций.
Изучить способность выделенных бактериальных культур к деградации ПАУ в условиях пониженных температур, экстремальных значений рН, высокой засоленности почв и в присутствии тяжелых металлов.
Произвести подбор носителя для иммобилизации клеток ассоциаций микроорганизмов.
Изучить эффективность применения биопрепаратов на основе природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, загрязненных ПАУ, в лабораторных экспериментах.
Оценить токсичность продуктов деструкции ПАУ полученными биопрепаратами с помощью биологических тест-объектов.
Научная новизна. Селекционированы и охарактеризованы 5 новых природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, состоящих из представителей следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.
Выделены новые штаммы бактерий, способные к деградации ПАУ в условиях пониженных температур (+4С; представители видов Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Vibrio mediterranei, Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas sp., Beijerinckia indica, Vibrio sp.), экстремальных значений рН (4,5 и 8,5); представители видов Pseudomonas sp., Flavobacterium odoratum, Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Pseudomonas mendocina, Aeromonas sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Vibrio sp.), высокой засоленности почв и в присутствии тяжелых металлов.
Среди исследованных микроорганизмов-деструкторов ПАУ обнаружены штаммы, проявляющие гиперустойчивость к тяжелым металлам {Aeromonas sp., Alcaligenes xylosoxidans - к 25 ПДК кадмия; Vibrio sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas pickettii - к 9 ПДК меди) и при этом сохраняющие способность к утилизации ПАУ.
Впервые продемонстрировано, что бактерия рода Curtobacterium, входящая в состав микробной ассоциации II, способна утилизировать трехкольцевой ПАУ фенантрен, присутствующий в среде в качестве единственного источника углерода и энергии.
Методами хромато-масс-спектрометрии показано, что исследованные микробные ассоциации подвергают бактериальной деградации такие многоядерные ПАУ, как индено[1, 2, 3-cd]nnpeH и бенз[к]флуорантен, которые, по литературным данным, окисляются только грибами.
Научно-практическая значимость работы. Коллекция природных ассоциаций и микроорганизмов-деструкторов ПАУ представляет интерес как для
разработки новых эффективных биопрепаратов-деструкторов ПАУ и других СОЗ, так и для изучения различных аспектов их деградации в лабораторных, пилотных и полевых условиях. В работе продемонстрирована возможность совместного использования коммерческого препарата - нефтедеструктора и выделенных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ для более полной очистки почвы от углеводородных загрязнений. Результаты биотестирования почв после биоремедиации с применением биопрепаратов на основе ассоциаций-деструкторов ПАУ, свидетельствуют о возможности их использования для очистки и детоксикации загрязненных почв.
Основные положения, выносимые на защиту:
Выделенные из загрязненных образцов почвы и воды сообщества бактерий-деструкторов ПАУ таксономически гетерогенны, включают в свой состав микроорганизмы, способные использовать в качестве ростового субстрата фе-нантрен в широком диапазоне температуры окружающей среды (4-37 С), рН (4,5-8,5), концентраций хлорида натрия (до 2 %) и тяжелых металлов (12 ПДК РЬ, 18 ПДК Cd, 5 ПДК Си).
Иммобилизация ПАУ-деградирующих бактерий на торфе способствует сохранению их жизнеспособности и катаболической активности в течение года в отсутствии загрязнения и увеличению численности деструкторов при поллю-тантном давлении.
В процессе биоремедиации почвы, загрязненной ПАУ, иммобилизованными на торфе сообществами бактерий-деструкторов деградации подвергаются все 16 ПАУ, определяемых хромато-масс-спектрометрическим методом, и суммарная деградация этих поллютантов составляет не менее 50 % за 30 суток.
Продукты деградации ПАУ, образующиеся при биоремедиации загрязненных почв, сообществами бактерий-деструкторов, иммобилизованных на торфе, не оказывают острого токсического действия на биологические тест-объекты.
Эффективность очистки почв коммерческим биопрепаратом БАК возрастает в отношении утилизации персистентных ПАУ при дополнительной интродукции выделенных в этом исследовании и иммобилизованных на торфе сообществ бактерий-деструкторов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2006), на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино, 2006), на четвертом и пятом международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009), на научно-практической конференции «Исследования и разработки по предупреждению аварийных разливов нефти и ликвидации их последствий» (Москва 2007), на международном биотехнологическом симпозиуме «Биотехнология для устойчивого развития человеческого общества» (Китай, Далянь, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 1 из которых в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков и 34 таблицы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов исследования, 4 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, и библиографического списка, включающего 172 источника литературы, в том числе зарубежных - 82.
