Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. НЕФТЬ КАК ИСТОЧНИК ЗАГРЯЗНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 12
Глава 2. ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ 15
2.1. Абиотическая деструкция нефти 15
2.2. Микробная утилизация углеводородов нефти 16
2.2.1. Метаболизм алифатических углеводородов 17
2.2.1.1. Окисление линейных углеводородов 20
2.2.1.2. Окисление циклических углеводородов 23
2.2.2. Метаболизм ароматических углеводородов 25
2.2.2.1 .Окисление моноароматических углеводородов 26
2.2.2.2. Окисление полиароматических углеводородов 28
2.2.3. Метаболизм асфальтенов 32
2.2.4.Биодеградация углеводородов нефти в экстремальных природных условиях
2.2.4.1 .При пониженных температурах 38
2.2.4.2.При повышенных температурах 43
2.2.4.3.В кислой и щелочной среде 45
2.2.4.4.В условиях повышенного содержания соли 46
Глава 3. МЕТОДЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ ТЕРРИТОРИЙ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ 50
3.1. Стимуляция аборигенной микрофлоры 51
3.2. Интродукция микроорганизмов-деструкторов 56
3.3. Биопрепараты: принципы их разработки и применения 63
3.3.1. Разработка биопрепаратов 63
3.3.2. Применение биопрепаратов 65
2. Материалы и методы 68
2.1. Бактериальные штаммы 6 8
2.2. Питательные среды, источники углерода и энергии, антибиотики 68
2.3. Сорбент 69
2.4. Условия культивирования 69
2.5. Определение эмульгирующей активности 70
2.6. Измерение индекса эмульгирования 70
2.7. Определение поверхностного натяжения 70
2.8. Определение степени деструкции нефти 71
2.9. Флуориметрический метод измерения массовой доли нефтепродуктов в почве 71
2.10. Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах 72
2.11. Определение степени адсорбции нефти 72
2.12. Выделение тотальной ДНК микроорганизмов 72
2.13. Полимеразная цепная реакция 73
2.14. Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (метод ARDRA)
2.15. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) анализ 74
2.16. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК 74
2.17. Определение влагоёмкости почвы 74
2.18. Определение рН почвы 74
2.19. Приготовление модельных почвенных систем 75
2.20. Внесение инокулята в почву 75
2.21. Отбор проб 75
2.22. Мониторинг штаммов-деструкторов в процессе деградации нефти в почве 16
2.23. Условия полевого эксперимента 76
2.24. Условия проведения ферментации 77
2.25. Световая микроскопия 78
2.26. Электронно-микроскопические методы 78
2.27. Статистическая обработка результатов 78 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ 79
3.1. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти
3.1.1. Характеристика штаммов-деструкторов углеводородов нефти 79
3.1.2. Изучение взаимодействия микроорганизмов-деструкторов с нефтью с 85
помощью световой и электронной микроскопии
3.1.3. Идентификация и генотипирование штаммов-деструкторов нефти 8 8
3.1.4. Биодеструкция нефти исследованными микроорганизмами 90
3.1.5. Изменение фракционного состава нефти после биодеградации 90
3.2. Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов нефти при пониженной температуре
3.2.1. Подбор ассоциации штаммов-деструкторов эмпирическим путём 93
3.2.2. Селекция ассоциации штаммов-деструкторов в жидкой минеральной среде и 93 адсорбция нефти биодеградабельным сорбентом
3.2.3. Эффективность деградации нефти отселектированной и эмпирически 98
составленной ассоциацией и её адсорбции сорбентом
3.3. Стимуляция микробной деструкции нефти в почве путём внесения бактериальной ассоциации и минерального удобрения в лабораторных условиях
3.3.1. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов 101
нефти в модельной почве
3.3.2. Мониторинг интродуцированных штаммов-деструкторов углеводородов нефти
3.3.3. Динамика убыли нефти в почве 104
3.4. Биоремедиация почвы, загрязнённой нефтью, в условиях полевого эксперимента
3.4.1. Изменение динамики численности микробной популяции в почве 105
3.4.2. Мониторинг интродуцированной микробной ассоциации 107
3.4.3. Убыль нефти 108
3.5. Полевые испытания опытного образца биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами
3.6. Депонирование штаммов, изучение их патогенности, патентование ассоциации и биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами
3.6.1. Депонирование штаммов 112
3.6.2. Изучение патогенности микроорганизмов 113
3.6.3. Патентование ассоциации и биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами
4. ОБСУЖДЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ 135
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
- НЕФТЬ КАК ИСТОЧНИК ЗАГРЯЗНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
- Абиотическая деструкция нефти
- Стимуляция аборигенной микрофлоры
Введение к работе
Среди многочисленных вредных веществ антропогенного происхождения, попадающих в окружающую среду, нефтепродуктам принадлежит одно из первых мест.
По степени вредного влияния на экосистемы нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие промышленные отходы занимают второе место после радиоактивного загрязнения (Черняховский и др., 2004). Работа автотранспорта и предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности, газообразные выбросы и сточные воды промышленных предприятий, многочисленные разливы нефти и нефтепродуктов в результате аварий трубопроводов и нефтеналивных судов (танкеров), аварий и пожаров на нефтехранилищах и нефтеперегонных заводах приводят к загрязнению воздуха, воды и почвы значительными количествами сырой нефти и продуктов её переработки и создают серьёзную угрозу экологии регионов России (Ревелль иРевелль, 1995).
В России большинство месторождений нефти расположено в северных регионах европейской части страны и Западной Сибири. Поэтому именно в регионах с холодным климатом часто происходит загрязнение нефтью наземных и водных экосистем. Потери нефти и нефтепродуктов в нашей стране при добыче, транспортировке, переработке и хранении, по официальным данным, оцениваются в 8-9 млн. тонн в год. Большая протяженность магистральных нефтепроводов (более 50 тыс км), объем транспортированной по ним нефти (1,2 млрд м в год) являются причиной различных аварий, количество которых достигает 70000 в год. В местах освоения нефтегазовых месторождений в западносибирском регионе выявлено свыше 800 тыс га нефтезагрязненных земель. Если оценивать потери нефти в 1,5% от добычи, то они превысят 5 млн т ежегодно, а по мнению специалистов «Гринпис» аварийные потери нефти в России превышают 25 млн т ежегодно. Один грамм нефти делает непригодной для биоты 100 л воды, тонна нефти загрязняет 12 кв. км водной поверхности, а один литр нефти лишает кислорода 40 тыс л воды. При концентрации нефти в воде 0,1-0,01 мг/л икринки рыб погибают за несколько суток (Булатов и др., 1997).
Попадание нефти и её компонентов в окружающую среду вызывает изменение физических, химических и биологических свойств и характеристик природной среды обитания, нарушает ход естественных биохимических процессов. При трансформации углеводородов нефти могут образоваться стойкие к микробиологическому расщеплению и ещё более токсичные соединения, обладающие канцерогенными и мутагенными свойствами (Ревелль и Ревелль, 1995; Корте и др., 1997).
Процесс естественного восстановления загрязненной окружающей среды является очень длительным. Ауторемедиация нефтезагрязненных почв при уровне загрязнения 5 г/кг длится от 2 до 30 лет и более. В северных регионах скорость этих процессов еще ниже. В связи с этим, последствия загрязнений нефтью там сказываются многие десятилетия, поскольку период деструкции нефти и её производных в условиях севера составляет минимум 50 лет (Оборин и др., 1988).
В России эта экологическая проблема имеет особое значение вследствие масштабов загрязнения, при которых экскавация почв и их восстановление ex situ (вне места
загрязнения) невозможны. Основную роль в ремедиации in situ (на месте загрязнения) играет биологический фактор - активность микроорганизмов, участвующих в процессах утилизации и трансформации углеводородов нефти. Микробиологичекие методы являются неотъемлемым компонентом современной биотехнологии очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную очистку, приводящую к уменьшению концентрации как отдельного загрязнителя, так и смеси поллютантов. Препятствиями в достижении этой цели являются низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций. Короткий летний период - основной лимитирующий фактор при биоремедиации в северных регионах. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов биоремедиации в регионах с холодным климатом. При разработке стратегий биоремедиации загрязненных территорий и акваторий необходимо учитывать существование аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с разным сродством в отношении различных фракций нефти и возможность активации их метаболизма за счёт добавления биогенных элементов (источников азота, фосфора и
калия). Внесение эффективных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти в почву совершенно необходимо в северных районах, где тёплый период года непродолжителен и природная микрофлора не успевает адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Штаммы родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococciis, Serratia, Bacillus и некоторые другие бактерии обладают значительным деградативным потенциалом; показано, что они способны утилизировать устойчивые загрязнители и ксенобиотики. Эти микроорганизмы часто выделяют из нефтезагрязненных мест, культивируют и используют для очистки при разливах нефти.
Необходимость очистки загрязненных почв и морских акваторий предполагает изучение разнообразия микроорганизмов данной среды обитания, способностей отдельных микроорганизмов и их ассоциаций к деградации различных поллютантов в присутствии повышенного содержания соли (Ventosa et al., 1998; Van Hamrne et al., 2003). В последнее время в биоремедиации используют микробные ассоциации, состоящие из двух и более штаммов, поскольку интродукция монокультуры углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязнённую среду не может полностью решить проблему очистки.
Разработка и совершенствование технологий биоремедиации, особенно почв, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, является областью прикладных исследований.
Наиболее широкое распространение получили методы биоремедиации, основанные на активации аборигенной микробной популяции (биостимуляция) за счёт применения ряда агротехнических мероприятий (рыхление почвы, увлажнение, внесение удобрений), а также интродукции в место загрязнения специально отобранных микроорганизмов, активно утилизирующих загрязнитель (биоаугментация), что значительно ускоряет процессы восстановления почв (Градова и др., 2003).
В настоящее время большинство проводимых исследований посвящено влиянию нефтезагрязнения на изменение состава природных популяций микроорганизмов различных экологических ниш (Prince et al., 1997; Delille et al., 2002; Margesin et al., 2003; 2007). Работ, посвященных селекции микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах, крайне мало. В связи с этим особенно актуально исследование психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.
Целью данной работы являлось создание ассоциации активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти как основы биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязнённых почв и определение её эффективности в лабораторных и полевых условиях. Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмовдеструкторов углеводородов нефти.
2. Составление микробных ассоциаций на основании комбинирования свойств микроорганизмов (психротрофность, галотолерантность, эмульгирующая
способность), а также путём селекции в условиях периодического культивирования с нефтью в качестве субстрата.
3. Определение эффективности деградации нефти ассоциациями в жидкой среде и её адсорбции растительным сорбентом.
4. Разработка метода мониторинга интродуцированных в почву штаммовдеструкторов, с использованием культурально-морфологических признаков, маркеров антибиотикорезистентности и метода геномных фингерпринтов.
5. Исследование процессов деструкции нефти и численности микробных популяций в почве в лабораторных и полевых условиях.
6. Разработка опытного образца биопрепарата и проведение полевых испытаний по очистке почв от нефтяных загрязнений.
Научная новизна Получена микробная ассоциация как основа биопрепарата для биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Впервые в её составе использованы психротрофные, галотолерантные микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти родов Rhodococcus и Pseudomonas, продуцирующие биоэмульгаторы. Кроме того, впервые в ассоциации для деструкции нефти присутствуют конъюгативные плазмиды биодеградации. Таким образом, они являются потенциальными донорами катаболических плазмид, которые за счёт горизонтального переноса могут расширять деградативный потенциал аборигенных почвенных микроорганизмов и ускорять биодеградацию углеводородов.
С помощью двух различных подходов - эмпирического на основании физиологических и метаболических характеристик штаммов и селекции микроорганизмов-деструкторов при периодическом культивировании с нефтью при пониженной температуре — составлены две микробные ассоциации, состоящие из четырёх штаммов, причём три из них являются одинаковыми для каждой ассоциации: Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142). При периодическом культивировании в минеральной среде с добавлением нефти в качестве источника отселектированной ассоциацией по сравнению с эмпирически составленной ассоциацией.
Разработан метод мониторинга интродуцированных в почву штаммовдеструкторов родов Rhodococcus и Pseudomonas. На основании культуральноморфологических признаков, маркеров антибиотикорезистентности и с использованием метода геномных фингерпринтов впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в открытой окружающей среде и показать их выживаемость и конкурентоспособность.
При проведении полевого эксперимента температура почвы изменялась в ассоциации оставалась на достаточно высоком уровне. Таким образом, тот факт, что интродуцированные микроорганизмы являются психротрофными (с диапазоном роста 2- деградации нефти происходил даже в этот период времени, только с меньшей скоростью.
Научно-практическая значимость работы На основании скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, способных к деградации различных углеводородов, отобраны и охарактеризованы активные психротрофные штаммыдеструкторы нефти и нефтепродуктов и на их основе составлена ассоциация как основа биопрепарата.
В условиях лабораторных и полевых экспериментов показана высокая эффективность применения созданной микробной ассоциации для очистки почвы от нефти и разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для биоремедиации почв. В полевом эксперименте продемонстрирована способность микробной ассоциации к деградации нефти в широком температурном диапазоне. С помощью разработанного метода мониторинга впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в открытой окружающей среде.
При ликвидации нефтезагрязнений с водных поверхностей целесообразно сначала использовать плавучий и биодеградабельный сорбент, который способен адсорбировать до 95% нефти в течение 1 часа. Ассоциация психротрофных микроорганизмов может быть использована для деградации остаточного количества нефтепродуктов на водной поверхности после адсорбции нефти сорбентом.
Получен патент РФ №2312891 «Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде». Подана заявка №2007125403 на изобретение «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения».
Эффективность опытного образца биопрепарата доказана в полевых испытаниях по очистке грунта от загрязнений смесью нефтепродуктов в Тульской области на протяжении осенне-зимнего периода.
Полученные в работе результаты по изучению биодеградации нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами и их ассоциациями в модельных почвенных системах и открытой окружающей среде создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований особенностей биодеградации углеводородов нефти при низких температурах.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 9-10-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2005-2006), 2-ой Всероссийской научно-технической интернет-конференции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология-современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула
•Пущино, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), международных съездах и конференциях: 2nd-4th International Conference on «Science and Business» (Pushchino, 2005- 2007), 8th International Семинар-Презентация инновационных научно-технических проектов «Biotechnology - 2005» (Pushchino, 2005), 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, 2005), International Conference on Alpine and Polar Microbiology (Insbruck, 2006), International Conference on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), 4th Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Moscow, 2007), Thirtieth Arctic and Marine Oil Spill Teclmical Seminar (Edmonton, Canada, 2007), International Conference on Contamination Soil (Milan, Italy, 2008), III Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008).
Публикации По материалам диссертации опубликована 23 работы, в том числе 6 статей (из них 4 по списку ВАК), патент РФ №2312891, заявка на получение патента РФ на изобретение и 15 тезисов.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц и 33 рисунка. Библиография насчитывает 236 наименований, нз них 71 отечественных и 165 зарубежных работ.
Нефть как источник загрязнений окружающей среды
Нефть является одним из важнейших видов минерального сырья. Путем её фракционирования получают различные виды топлива, смазочные масла, вазелиновое масло, парафин, креозот, различные растворители, гудрон (асфальт) (Степаненко, 1974). Кроме того, нефть является сырьем для получения органических веществ, лекарств, парфюмерных изделии, лавсана, каучука, пластмасс, красителей, пестицидов.
По данным отечественных исследователей ежегодное антропогенное поступление нефти в воды Мирового океана составляет 12-15 млн. т (Стадницкий, 1988). при этом примерно 1/3 его поверхности постоянно или временно покрыта нефтяной пленкой. До 30% загрязнений вод нефтью приходится на бытовые и промышленные отходы, 27% на суда, 12% на аварии танкеров и нефтяных платформ, но в тоже время 24% загрязнений Мирового океана поступает со дна из естественных источников (Стадницкий, 1988). Таким образом, нефтезагрязнение не является чисто антропогенным, что объясняет наличие в биосфере организмов, способных к жизнедеятельности в загрязнённых нефтью средах.
Нефтяное загрязнение приводит к негативным изменениям в почвенных биоценозах (Штина и др., 1988), а также к коренным изменениям в химическом составе, структуре и свойствах почв (Гайнутдинов и др., 1988; Демидиенко и Демурджан, 1988), вследствие чего резко снижается продуктивность и ухудшается хозяйственная ценность земель. В нефтезагрязненной почве изменяется состав микробного сообщества (Исмаилов, 1988), подавляется фотосинтетическая активность высших растений (Бузмаков и Ладыгин, 1993).
В результате разливов нефти почвы могут превращаться в типичные техногенные пустыни, в которых практически полностью подавлена жизнедеятельность биоты. Такие явления в широком масштабе имеют место в нефтедобывающих районах России (Поволжье, Западная Сибирь, Коми, Башкортостан), а также в большинстве населенных пунктов, где расположены нефтеперерабатывающие заводы и крупные хранилища горюче-смазочных материалов.
Процесс естественного восстановления загрязненной среды является очень длительным. Ауторемедиация нефтезагрязненных почв при уровне загрязнения 5 г/кг длится от 2 до 30 лет и более. В северных регионах скорость этих процессов еще ниже. В связи с этим, последствия нефтезагрязнения там сказываются многие десятилетия, поскольку период деструкции нефти и её производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет (Оборин и др., 1988).
Всего из нефти выделено и идентифицировано более 500 индивидуальных химических соединений — углеводородных и гетероорганических. Элементный состав нефти характеризуется обязательным наличием пяти химических элементов — углерода, водорода, кислорода, серы и азота; при резком количественном преобладании первых двух — свыше 90%, максимальное содержание остальных трех элементов может в сумме достигать 5-8% (Богомолов и др., 1995).
В составе нефти выделяют углеводородную, асфальтеносмолистую и зольную составные части, а также порфирины и серу. Углеводороды, содержащиеся в нефти, подразделяют на три основные группы: метановые, нафтеновые и ароматические. Метановые (парафиновые) углеводороды химически наиболее устойчивы, а ароматические - наименее устойчивы (в них минимальное содержание водорода). При этом ароматические углеводороды являются наиболее токсичным компонентом нефти. Асфальтосмолистая составная нефти частично растворима в бензине: растворимая часть -это асфальтены, нерастворимая - смолы.
Абиотическая деструкция нефти
Уже в первые часы после попадания нефтепродуктов в окружающую среду начинается процесс их деградации, в котором доминируют абиотические физико-химические процессы. Часть нефтепродуктов (бензин, керосин) может частично удаляться из среды путём выветривания. За первые 15 суток с верхнего слоя в летнее время может испариться около 30% нефтепродуктов, в основном, за счёт лёгких фракций (Другов и Родин, 2007). Компоненты нефти и нефтепродуктов на поверхности почв частично могут подвергаться фотоокислению. Абиотические факторы деструкции нефти существенно зависят от климатических особенностей различных географических зон.
Дизельное топливо и лёгкие масла мало выветриваются, но способны легко проникать в нижние слои почвы, в осадочные породы и грунтовые воды. Тяжёлые нефтепродукты, асфальтены практически не выветриваются и относительно медленно проникают вглубь почвы. Разлившаяся нефть и нефтепродукты адсорбируются почвой и в основной массе локализуются в её верхнем горизонте. Лишь небольшая часть углеводородов может проникать в подпочвенные слои, грунтовые воды. Это касается, главным образом, наиболее простых по строению низкомолекулярных парафиновых, нафтеновых и ароматических углеводородов нефти. Большую часть легкой фракции составляют алканы с числом углеродных атомов С5-С10. Именно эта фракция нефти проявляет максимальную токсичность, но сравнительно легко удаляется за счет вымывания или испарения (Стабникова и др., 1996).
В ряду таких абиотических механизмов деградации углеводородов нефти, как вымывание и фотоокисление, наиболее значимым механизмом является испарение. Показано, что за первые сутки в летний период из нефтяного пятна на поверхности почвы испаряется до 80% технического бензина, 22% - керосина, 2-15% - сырой нефти и около 0,3% - летучих компонентов мазута (Изъюрова, 1950). На третий день загрязненная почва теряет около 16% попавшей в нее сырой нефти, а через 15 дней ее потеря может составлять уже 36% но, в дальнейшем, скорость этого процесса постепенно замедляется. То есть, большое значение имеют физические характеристики видов нефти, загрязняющих среду; их летучесть и текучесть. Дальнейшее разрушение углеводородов нефти связано с процессом их биохимического окисления, которое происходит лишь при участии нефтеокисляющих микроорганизмов.
Стимуляция аборигенной микрофлоры
Низкие темпы самоочищения окружающей среды приводят к тому, что без проведения мероприятий по очистке площадь загрязнённых нефтью и нефтепродуктами территорий будет неуклонно расти. Существующие в настоящее время способы локализации и ликвидации разливов нефти и нефтепродуктов, а также переработки нефтяных загрязнений, образовавшихся как в результате аварийных разливов, так и вследствие сверхлимитного накопления отходов, можно достаточно условно подразделить на несколько групп:
1. Механические методы.
2. Физико-химические методы.
3. Биологические методы.
4. Сорбционные методы.
5. Фитомелиоративные методы.
Но ни один из перечисленных методов не позволяет полностью решить проблему очистки нефтезагрязнённой среды. Методы технической рекультивации в большинстве случаев позволяют собрать лишь часть нефти, либо значительно понизить концентрацию загрязнителя, однако не ликвидируют загрязнение полностью (Арчегова, 1997), а физико-химические и термические методы не рекомендуется использовать для рекультивации нефтезагрязнённых земель, так как они ведут к уничтожению плодородного слоя и накоплению токсикантов.
Основную роль при очистке почв от нефти и нефтепродуктов играет биологический фактор — активность микроорганизмов, участвующих в процессах трансформации углеводородов. Для активизации микробиологических процессов самоочищения нефтезагрязнённых почв используются различные приёмы биоремедиации. Биоремедиация (от био и лат. remedio - лечение, восстановление) - использование живых организмов (бактерий, дрожжей, грибов, водорослей и растений) для детоксикации загрязняющих веществ (поллютантов) или снижения их концентрации в окружающей среде (Биотехнология защиты окружающей среды. Учебное пособие). Благодаря биоремедиации нормализуются природные процессы, а экологические показатели приближаются к исходному состоянию (до техногенного воздействия). Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную очистку, приводящую к уменьшению концентрации как отдельного загрязнителя, так и смеси поллютантов. Препятствиями в достижении этой цели являются низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций (Бельков, 1995).
Существует два подхода, основанные на использовании эндогенных или интродуцируемых микроорганизмов в местах загрязнения. Первый называется эндогенной биоремедиацией или биостимуляцией {intrinsic bioremediation) и предполагает активацию аборигенной микрофлоры, адаптированной к конкретным условиям данной загрязнённой территории. Второй подход основан на внесении активных микроорганизмов-деструкторов в места загрязнения и называется биоулучшением или интродукцией микроорганизмов-деструкторов или биопрепаратов на их основе (bioaugmentatiori).
Агентство по защите окружающей среды США (U.S. ЕРА) дало такое определение веществам, применяемым в биоремедиации - «микробные культуры, ферменты или питательные вещества, добавление которых значительно увеличивает скорость биодеградации вредных веществ» (Nichols, 2001). Агенты для биоремедиации также классифицируются как вещества для биоаугментации и биостимуляции, основанные на двух основных подходах, применяемых в биоремедиации. Многие продукты для биоремедиации были предложены фирмами, которые их производили, особенно на протяжении 1990-х годов, когда биоремедиация популяризовалась как «завершающий раствор» для нефтяных разливов (Hoff, 1993).
Применяют также ex situ биоремедиацию, которая предполагает экскавацию и вывоз нефтезагрязнённой почвы с места загрязнения с последующей её утилизацией и on-site биоремедиацию, которая требует экскавации, но не дорогостоящего вывоза загрязнённых почв с сайтов, и предполагает дальнейшую переработку загрязнённого материала непосредственно на месте аварии.
