Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1.. Проблема нефтяного загрязнения окружающей среды и ее влияние нефти на почвенный микробоценоз 9
1.1.1. Модифицирующее действие нефти на основные свойства почвы. 10
1.1.2. Специфичность действия углеводородов нефти на почвенный микробоценоз 11
1.1.3. Способы рекультивации нефтезагрязненных почв 16
1.2. Экологическая и морфолого-биохимическая характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов 19
1.2.1. Распространение микроорганизмов- деструкторов углеводородов нефти 19
1.2.2. Морфологические и биохимические особенности углеводо-родокисляющих микроорганизмов 22
1.3. Химические аспекты деградации нефти аэробными углеводоро-докисляющими микроорганизмами . 27
1.4. Биоремедиация нефтезагрязненных почв 31
1.4..1. Проблема выживания интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти 32
1.4.2. Роль микробных биопрепаратов в биоремедиации почвенных экосистем, загрязненных нефтью 35
Глава 2. Объекты, методы и условия проведения эксперимента
2.1. Объекты и условия проведения эксперимента 39
2.2. Выделение, идентификация и изучение активных штаммов углево-дородокисляющих микроорганизмов 43
2.3. Методика изучения микробиологического воздействия на химический состав нефти 47
2.3.1. Методика изучения трансформации углеводородов микроорганизмами 47
2.3.2. Газохроматографический анализ нефти 48
2.4. Методика приготовления комплексного микробного биопрепарата на основе выделенных углеводородокисляющих штаммов микроорга-нимов. 48
2.5. Изучение приживаемости углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в компосте и почве 49
2.6. Изучение микробных ценозов нефтезагрязненных почв 51
2.7. Определение остаточного содержания нефти в почве 52
2.7.1. Экстракция нефтепродуктов и их очистка 52
2.7.2. ИК-спектрометрический анализ экстрактов 53
2.8. Изучение влияния нефти на фитотоксичность нефтезагрязненных почв 54
2.9. Использование электронно-вычислительной техники и методы статистической обработки результатов 54
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти . 56
3.2. Морфологические и физиолого-биохимические особенности выделенных углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов 63
3.2.1. Диагностика выделенных углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas putida и Rhodococcus ruber 63
3.2.2. Диагностика выделенных углеводородокисляющих мик-ромицетов рода Trichoderma citrinoviride, Metarrhizium anisoplia и Aspergillus carneus 69
3.3. Исследование роста выделенных углеводородокисляющих микро организмов 74
3.3.1. Влияние температуры на рост углеводородокисляющих микроорганизмов 74
3.3.2. Влияние аэрации на динамику роста микроорганизмов...76
3.3.3. Особенности развития выделенных микроорганизмов на различных источниках углеводородов 77
3.4. Химические механизмы трансформации углеводородов нефти выделенными бактериями и микромицетами. 85
3.5. Конструирование микробного консорциума для биопрепарата, разрушающего нефть 90
3.5.1. Особенности инокуляции углеводородокисляющих микроорганизмов 91
3.6 Изучение влияния нефти на динамику численности почвенных микроорганизмов в условиях лабораторного опыта 96
3.6.1. Изменение общей численности гетеротрофных бактерий и почвенных микромицетов в нефтезагрязненной почве ...96
3.6.2. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненной почве 102
3.7. Особенности микробоценозов нефтезагрязненных почв 105
3.8. Исследование степени деградации нефти в почве 109
3.9. Сравнительное изучение микробиологических препаратов на основе углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов 112
3.10.. Биологический тест на фитотоксичность почвы, загрязненной нефтью 114
Выводы 117
Список используемой литературы. 118
Приложения. 131
- Специфичность действия углеводородов нефти на почвенный микробоценоз
- Химические аспекты деградации нефти аэробными углеводоро-докисляющими микроорганизмами
- Выделение, идентификация и изучение активных штаммов углево-дородокисляющих микроорганизмов
- Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти
Введение к работе
Актуальность проблемы
Многочисленные нарушения экологического равновесия в природе, в конечном счете, приводят к экологическим катаклизмам. Следствием безудержного и неконтролируемого внедрения человека в биосферу оказывается загрязнение почвы и водоемов вредными веществами.
В настоящее время среди различных техногенных нарушений природы одним из наиболее серьезных и трудно устраняемых является нефтезагряз-нение. Нефть и ее компоненты (ароматические, нафтеновые и парафиновые углеводороды) являются одними из самых опасных загрязнителей, попадающих в почву в процессах добычи, транспортировки, переработки и хранения. Хронические разливы нефти приводят к быстрой и полной деградации ландшафтов (Израэль, Ровинский 1986; Amadi et al., 1993).
Для ускорения процесса самоочищения почв от нефти используются все природные резервы экосистемы, в том числе и биологические. Микробиологические методы очистки почв способны дополнять различные технологии, а в определенных ситуациях не имеют аналогов (Walker, 1985; Пиков-ский, 1993; Н.А. Киреева и др., 2001).
Значительный вклад в процесс биологического разрушения нефти вносят углеводородокисляющие микроорганизмы, являющиеся постоянным компонентом почвенных биоценозов. Микроорганизмы способны использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и доводить процесс трансформации органического вещества до полной минерализации. В результате биохимических процессов природные загрязнители превращаются в углекислый газ, воду, и другие экологически нейтральные соединения (Гузев, Корнелли 1981; Walker, 1985; Славина, Середина, 1992).
В настоящее время интенсивно разрабатываются и применяются методы микробиологической очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании чистых или смешанных культур углеводоро-докисляющих микроорганизмов в сочетании с различными веществами, сти мулирующими их активность. Эффективность этих методов может быть значительно повышена путем изменения соответствующих физико-химических условий среды и внесением ассоциации специально подобранных штаммов микроорганизмов, обладающих выраженными углеводородо-кисляющими свойствами. (Славина, Середина, 1992; Сидоров и др., 1997). Одним из важных условий микробиологической очистки нефтезагрязнений является способность различных групп микроорганизмов (бактерий, актино-мицетов, дрожжевых грибов и микромицетов) совместно «бороться» с загрязнением, а также обладать высокой иннокулятивной жизнеспособностью (Звягинцев и др., 2001).
За рубежом в последнее время широкое развитие получили биореме-диационные технологии на основе комплексных микробиологических препаратов. В отечественной же практике реальные методы по использованию комплексных микробиологических препаратов для очистки окружающей среды от углеводородного загрязнения упоминаются очень редко (Сидоров и др., 1997). Надеемся, что результаты изучения физиологии и экологии ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов и разработка методов их успешной интродукции в природные экосистемы позволят в дальнейшем развить экологическую биотехнологию в нашей стране.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение действия сырой нефти на почвенную микробиоту; выделение ассоциации аэробных микроорганизмов, активно утилизирующих углеводороды нефти и изучение их способности к биоремедиации нефтезагрязненных почв.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
• Выявить, выделить и культивировать в чистой культуре микроорганизмы, способные к потреблению углеводородов нефти.
• Отобрать штаммы микроорганизмов-деструкторов с наибольшей глубиной окисления углеводородов нефти.
• Установить таксономическую принадлежность и физиологе -биохими ческие особенности микроорганизмов-деструкторов нефти.
• Исследовать действие сырой нефти Харьягинского и Сугмутского мест о-рождений на почвенную микрофлору.
• Разработать комплексный микробный биопрепарат, способный к деград-ции углеводородов нефти.
• Изучить особенности микробоценозов нефтезагрязненных почв.
Научная новизна работы
Из загрязненных нефтью почв выделены бактериальные штаммы и штаммы микромицетов, использующие углеводороды, входящие в состав сырой нефти в качестве единственного источника углерода. Полученные культуры идентифицированы, изучены и отнесены к видам: Rodococcus ruber PS-02., Pseudomonas putida SP-203, Trichoderma citrinoviride VS-89, Metarrhkium aniscpliae AF-78, Aspergillus carneus SUM-03. Выявлена высокая деструктивная способность микромицетов Trichoderma citrinoviride VS9 и Metanbmum ariisoplwe AF-78, что ранее в литературе не отмечено. Установлено, что ассоциация углеводородо-кисляющих микроорганизмов обладает высокой иннокулятивной способностью. Показана высокая активность углеводородокисляющих микроорганизмов в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (нормальных алканов) при относительно низких температурах (8-15°С). Изучены микробоценозы нефтезагрязненных почв. Выявлена роль углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в деградации нефти на песке.
Практическая значимость
На основе ассоциации выделенных аборигенных штаммов-деструкторов углеводородов нефти разработан комплексный биопрепарат, показавший высокую активность в окислении сырой нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений и позволяющий в течение 4 месяцев снизить токсичность почвы, загрязненной сырой нефтью, до уровня, не препятствующего росту растений. Результаты проведенных исследований являются основой для разработки технологии получения новых биопрепаратов, используя аборигенные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки почв, загрязненных сырой нефтью в широком температурном диапазоне (t=15-28°C).
Работа выполнена в условиях лабораторного опыта, заложенного на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (г. Москва) в 2001-2004 гг.
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю — Д.С-Х.Н., профессору Сидоренко О.Д. за ценные консультации и советы при выполнении данной работы;
- также выражает признательность сотрудникам лаборатории газовой / хроматографии НИИ газа и нефти (г.Москва) м.н.с. Назаровой Е.С и др; заведующему кафедрой органической химии МСХА (г. Москва) д.х.н., профессору Князеву В.Н. за предоставленную возможность провести необходимые газохроматографические и спектрометрические исследования;
- сотрудникам лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии РАН (г.Москва) к.б.н. Милехиной Е.И. и др. за методическую поддержку и ценные консультации;
- заведующему лабораторией химии нефти НИИ нефти им. Крылова (г. Москва), к.тех.н. Ошмяну К.Д. за предоставленные образцы нефти;
- сотруднику кафедры микологии МГУ им. Ломоносова к.б.н. Александровой А.В. за помощь и ценные консультации в определении видовой принадлежности микромицетов;
- также сотрудникам кафедры микробиологии МСХА им. К.А. Тимирязева.
Специфичность действия углеводородов нефти на почвенный микробоценоз
Специфичность действия углеводородов нефти на почвенный микробоценоз Эффект длительного воздействия нефти на почву проявляется в изменении ее микробиологических свойств и комплекса почвенных микроорганизмов в целом. В почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять различные углеводороды. Они являются обычными компонентами биоценозов почв (Андрусенко, Рунов, 1973; Суржко и др., 1995; Benka-Cocer, Ekundayo, 1997). Нефть оказывает селекционное действие на почвенную микробиоту. В загрязненных почвах микроорганизмы, использующие углеводороды находятся в большем количестве, чем в почвах без нефти (Квасников, Клюшникова, 1981; Brown-Lewis, 1987).
Обнаружено увеличение количества узкоспециализированных форм микроорганизмов, окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические и алифатические углеводороды. Среди них выявлены бактерии родов Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomo-nas, Rhodococcus, Micrococcus, Micromonospora и др. (Stetzenbach et al, 1993; Глазовская, 1988; Ягафарова, Скворцова, 1996; Плотникова и др., 2001), микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillum, Mucor, Fusarium, Trichoderma (Билай и др. 1980; Ягафарова и др., 2001) и аспорогенные дрожжи родов Candida, Rhodotorula, Cryptococcus (Шлегель, 1988; Таранова, Жданова, 1996) и т.д.
Различные группы микроорганизмов обнаруживают разную устойчивость к нефтяному загрязнению. Так И.Г. Калачникова и Н.М. Колесникова (1988) отмечали долговременный отрицательный экологический эффект на дерново-подзолистой почве при загрязнении нефтью в концентрации 20 л/м , приводящий к существенному изменению микробоценоза. Е.А. Бусыгин (1986), на примере микроскопических водорослей, обитающих в почве, отмечает, что даже низкие концентрации нефти приводят к гибели Cheoro-phyta, Xantophyta, тогда как сине-зеленые водоросли являются устойчивыми к загрязнению нефтью.
Загрязнение почв нефтепродуктами препятствует разложению органического вещества (Mitchell et al., 1972). За счет этого в них происходит накопление органического углерода. В литературе имеются сведения, что нефтяное загрязнение почв подавляет фотосинтетическую активность и резко снижает численность почвенных водорослей (Штина, 1985).
Нефтяное загрязнение почвы вызывает снижение численности акти-номицетов, а численность бактерий и грибов возрастает, причем наименее чуствительными являются грибы видов Rhizopus nigricans, Fusarium monili-forme, Aspergillus flams и A. ustus (Рыбак и др., 1984). По другим данным (Исмаилов, Пиковский, 1985) при загрязнении нефтью возрастает доля бактерий, а актиномицетов и микромицетов - снижается. Причем некоторые компоненты нефти могут вызвать стимуляцию развития актиномицетов и сульфатредуцирующих бактерий в почве (Самосова и др., 1982)
Наиболее чувствительными к действию нефти среди микроорганизмов являются нитрифицирующие бактерии. Нитрификация ингибируется уже при 0,5% загрязнении (Глязов, 1980), и нитрифицирующие микроорганизмы практически отсутствуют в почве, обработанной 5-10 кг/м нефти (Odu, 1977). В литературе это влияние связывают со снижением содержания кислорода. Считается, что минимальное содержание растворенного кислорода, необходимого для нитрификации, должно составлять 2 мг/л. При неф-тезагрязнении концентрация кислорода снижается до 1,3 мг/л, что приводит к снижению скорости роста микроорганизмов - нитрификаторов. Она составляет 60% от максимальной величины (Bliss, Barnes, 1979). Численность и активность микроорганизмов, участвующих в процессах азотфиксации и аммонификации наоборот, могут увеличиваться (Исмаилов, 1983; Odu, 1977). Имеются сведения также о том, что углеводороды нефти могут интенсифицировать и процессы денитрификации (Халимов и др. 1996).
По данным Славиной Т.П. и др. (1992) в загрязненных сырой нефтью подзолистых почвах на первом месте по численности находятся микромице-ты, на втором - актиномицеты, на третьем - миксобактерии. В загрязненных нефтепродуктами почвах грибы рода Penicillium, потребляющие тяжелые фракции углеводородов, твердые битумы, сохраняются в небольшом количестве в самой верхней части почвы, актиномицеты исчезают полностью и остаются лишь миксобактерии, что коррелирует с обогащением почвы органическим веществом и ухудшением ее водно-физических свойств.
Н.М. Исмаилов (1988) также отмечает, что следствием увеличения содержания нефтепродуктов в почве является повышение содержания микроорганизмов. Свыше 40% общего количества микроорганизмов занимают ак-тиномицеты, незначительную часть составляют микромицеты. Наибольшего развития грибной мицелий достигает в почве, загрязненной высокими концентрациями нефти 20-25%. (Киреева, 1995). Устойчивость грибов к нефтяному загрязнению, по мнению исследователей (Киреева, Галимзянова, 1995), связана с тем, что рН загрязненной почвы смещается в кислую сторону, что благоприятствует росту микромицетов.
На примере изучения организации амилолитического микробного сообщества выделены четыре качественно отличных зоны состояния микробного сообщества в зависимости от концентраций нефти, внесенной в дерново-подзолистую почву (Звягинцев и др. 1989). Зона гомеостаза микробной системы почвы охватывает диапазон концентраций нефти (0 - 0,7 мл/кг почвы), в котором все показатели стабильны и практически неотличимы от контроля. Общая биомасса микроорганизмов сообщества может несколько возрастать, что свидетельствует о стимулирующем действии низких концентраций нефти на микробиологические процессы в почве. Это согласуется с имеющимися в литературе сведениями о том, что нефть содержит вещества, стимулирующие рост и развитие растений (Штина и др., 1985).
В зоне стресса (0,7-50 мл/кг почвы) происходит перераспределение популяций микроорганизмов по степени доминирования. В этом диапазоне концентраций степень загрязнения почвы такова, что возникают первые нарушения в микробном сообществе, характерном для данной почвы. Отмечается повышение биогенности нефтезагрязненных почв, увеличение катабо-лической активности, которое может быть вызвано как увеличением численности микробиоты, так и изменением структуры комплекса почвенных микроорганизмов (Звягинцев и др. 1989).
Химические аспекты деградации нефти аэробными углеводоро-докисляющими микроорганизмами
Нефть - сложная смесь алканов (парафиновых или ациклических насыщенных углеводородов), нафтенов и аренов различной молекулярной массы, а также кислородных, сернистых и азотистых производных углеводородов. Нефти различных месторождений по углеводородному составу неодинаковы. По преобладающему компоненту различают метановые, ароматические, нафтеновые, гибридные нефти и т.д. Все углеводороды, входящие в состав нефти подвергаются микробиологическому воздействию, но окисление их происходит с различной скоростью (Петров, 1984).
В настоящее время известно, что разрушению при благоприятных условиях могут быть подвергнуты углеводороды любых гомологических рядов, причем порядок разрушения зависит от вида микроорганизмов (Кирее ва,1995).
Ряд авторов (Song et al., 1990) утверждают, что по степени деграда-бельности сырая нефть и продукты ее переработки располагаются в следующем порядке: наиболее деградабельна сырая нефть, затем керосин, горючие масла, наименее деградабельным является мазут. Это связано с тем, что содержание в мазуте тяжелых фракций нефти, и в частности смолисто-асфальтеновых соединений в несколько раз выше, чем в сырой нефти. Данные соединения при окислении густеют и образуют прочные покровы, которые пагубно влияют на водно-физические свойства почвы. Они малодоступны микроорганизмам и утилизируются ими в течение нескольких лет (Пиковский, 1988; Оборин и др., 1988).
В настоящее время доказана принципиальная возможность биологического окисления нефтей как в аэробных, так и анаэробных условиях (Квасников, Клюшникова, 1981; Atlas 1988). Значение анаэробной биодеградации составляет небольшую долю в общем объеме биодеструкции углеводородов нефти (Bertrand et al., 1989). Основная роль принадлежит аэробному процессу биодеградации. Однако в ряде работ приведены данные о способности сульфатредуцирующих, нитрифицирующих и ряда других бактерий разлагать алифатические и ароматические углеводороды в анаэробных условиях (Давыдов и др., 1998; Корнелли и др., 2001).
Биологическое окисление приводит к постепенному превращению парафинистых нефтей в нафтеновые в силу избирательного потребления микроорганизмами углеводородов ряда метана. Так, в процессе биодеградации происходит повышение плотности нефтей и увеличение доли смолистых соединений. За счет остаточного накопления увеличивается концентрация нафтеновых и ароматических углеводородов (Петров, 1984; Солнцева, 1985).
Температура влияет на скорость биодеградации за счет изменения физических и химических свойств нефти. При понижении температуры увеличивается вязкость нефти, снижается испарение легколетучих веществ, и скорость биодеградации понижается (Atlas, 1988).
Первым признаком микробиологического разложения нефти является изменение ее цвета: от черного к бурому; меняется консистенция нефтепродукта, она превращается в слабую эмульсию, т.к. под действием нефтеокис-ляющих микроорганизмов происходит разрыв длинных углеродных цепей на более короткие составляющие (Квасников, Клюшникова, 1981).
Благодаря селективному характеру процесса биодеградации происходит последовательное удаление нормальных, а затем разветвленных и изопреноидных алканов, что особенно четко прослеживается на хромато-граммах нефтей. Эта особенность используется для выделения химических типов нефтей, отражающих отдельные стадии процесса их биодеградации. Термин «биодеградация» не совсем верно отражает существо процесса. В данном случае происходит химическая или, вернее, биохимическая эволюция нефтей, свойства которых при этом изменяются, но не всегда в худшую сторону. Например, результатом этого процесса является образование бес-парафинистых нефтей, на основе которых могут быть получены хорошие смазочные масла (Петров, 1984). В литературе утвердилось мнение, что углеводороды с цепью от Сзо до См с большим трудом используются микроорганизмами (Розанова, 1967). Отмечается, что легкие н-алканы угнетают рост некоторых бактерий, и наиболее токсичны они для Е. coli и Bacillus cereus. Характер влияния индивидуальных алканов на аэробные термофильные споровые бактерии изменяется в зависимости от вида бактерий, температуры культивирования и длины углеродной цепи. Гептан и н-декан - полноценные субстраты для ряда штаммов термофильных бактерий - Bacillus brevis, В coagulans, В. circulans - при оптимальных для роста каждого вида температурах (45-6(ГС). Н-алканы Сб — Сю являются ингибиторами термофильных штаммов В. subtilis, при 60С н-нонан угнетает рост значительной части исследованных штаммов В. circulans (Квасников, Клюшникова, 1981).
Влияние микробиологического окисления на углеводородный состав нефти носит вполне закономерный и направленный характер. В начальные этапы окисления (2 мес), как обычно, затрагиваются более легкие ароматические углеводороды и нормальные алканы Сіг—С25 (Артемьева, Штина, 1985; Atlas 1983).
На более поздних этапах бактериального окисления содержание алканов непрерывно убывает, при этом окислению подвергается более широкий спектр углеводородов вплоть до Сз4- Это уменьшение происходит в основном за счет вовлечения в процесс окисления монометилзамещенных структур (изо- и антеизоалканов). Относительное содержание изопреноидов возрастает за счет остаточного накопления, не меняется и соотношение трудно усвояемых компонентов нефти пристана и фитана. На последней стадии, когда микроорганизмы почти полностью используют алканы различного строения, начинают окисляться и моноциклические углеводороды.
Можно отметить, что в процессе биодеградации в первую очередь разрушаются углеводороды, вьщеляющиеся над хроматографическим фоном в виде четких пиков, в то время как углеводороды фона окисляются позднее. В силу избирательности процесса биодеградации, состоящего в постелен зо ном потреблении микроорганизмами алифатических углеводородов, нефть, обогащалась циклическими углеводородами, изменяет свой химический тип (Петров, 1984).
У. Мак Гилл (McGill, 1977) разделяет нефтяные углеводороды по легкости физико-химического выветривания из почвы. Н-алканы и изоалканы до Сю легко испаряются из почвы; углеводороды керосиновой (Сц-Сп), га-зойловой (Си-Сп) и соляровой (С18-С25) фракций мало выветриваются, а фракция смазочных веществ и машинных масел (С26-С35) и гудроновой (С3в-С6о и более) практически не подвержены физико-химическому выветриванию.
Выделение, идентификация и изучение активных штаммов углево-дородокисляющих микроорганизмов
Для получения накопительных культур углеводородокисляющих микроорганизмов изучали углеводородокисляющую микрофлору красновато-бурой почвы, компоста высокого нагрева, нефтей, а также нефтезагрязнен-ных почв (дерново-подзолистой и черноземной) и нефтезагрязненного песка.
Экспериментальное загрязнение почв и песка нефтью проводили в стеклянных сосудах. Для этого брали навески почв и песка массой 200 г и вносили в них нефти в массе 500 мг/кг от веса почвы. Почву (или песок) тщательно смешивали и выдерживали при температуре 18С в течение 3-суток. Для получения накопительных культур углеводородокисляющих микроорганизмов каждый исследуемый субстрат (нефтезагрязненные почвы, песок и компост) в массе 1 г вносили в колбы с 99 мл стерильной воды, смесь взбалтывали и 1 мл суспензии переносили в колбы с 20 мл стерильной минеральной среды Раймонда с 1% NaCl (Raymond, 1961). В качестве единственного источника углерода в среду добавляли 5% стерильной нефти.
Стерилизацию нефти и нефтепродуктов проводили методом мембранной ультрафильтрации через бактериальные фильтры с диаметром пор D=0,22 мкм (Millex 22шп, MILLIPORE).
Для изучения углеводородокисляющей микрофлоры нефтей Сугмут-ского и Харьягинского месторождений сырые нефти в массе 2 г вносили в колбы с 20 мл стерильной минеральной среды Раймонда. Культивирование вели при температуре 26С в течение 5 суток.
Далее из всех накопительных культур проводили высев на плотные питательные среды: МПА, Чапека и Кинга по методу Коха. Для изучения потребления углеводородов и изменения химического состава нефти каждый выросший штамм микроорганизма пересевали на жидкую минеральную среде Раймонда с 3% нефти в качестве единственного источника углерода и 1% NaCl. Микроорганизмы культивировали в 300 мл колбах по 100 мл с нефтью при аэрировании (26С) в течение двух недель. По истечении двух недель в каждую колбу вносили 30 мл гексана (марки - ч) в качестве растворителя углеводородов нефти, полученную смесь углеводородов пропускали через хроматографические колонки с мелкодисперсным селикагелем для отделения алифатической фракции и подвергали газохроматографическому анализу (см. раздел 2.4.1.).
Культуры выделенных микроорганизмов поддерживали на богатой агаризованной среде Кинга следующего состава (г/л): пептон - 20,0; глицерин - 10,0; MgS04-7H20 - 1,5; К2НР04 -ЗН20—1,5; агар - 15,0; Н2ОДИСт-1000 мл (Stolp, Dilip, 1981),
Углеводородокисляющую активность чистых культур микроорганизмов изучали на жидкой минеральной среде Раймонда с 1% NaCl. Единственным источником углерода и энергии служили сырые нефти, легкие фракции нефти (керосин, соляровое масло), тяжелая фракция (мазут), а также ароматическая фракция (толуол).
Идентификацию полученных наиболее активных культур микроорганизмов проводили общепринятыми методами, пользуясь определителями бактерий (Смирнов, 1990; Бержи, 1997, Вейант и др., 1999), определителями грибов (Domsch, Grams., Anderson, 1980; Саттон, Фотергилл, 2001; Билай и др., 1988), а также определителем грибов рода триходерм (Samuel s, Petini, Kuhes, 2000). Изучали культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов. Морфологию клеток изучали в фазовом контрасте (световой микроскоп "ЛОМО, Микмед- 1" Россия) при увеличении 40x1,5 и 90x1,5. При микроскопировании бактерий отмечали величину и форму клеток, особенности морфологии и характера обособления клеток, подвижность, тенденцию к образованию спор и плодовых тел. Также использовали биохимические методы идентификации бактерий (Методы общей бактериологии, 1984; Поздеев, 2001):
Тест на катализу у бактерий проводили на глюкозо-пептон-дрожжевой среде (г/л): глюкоза - 5.0, пептон - 10.0, дрожжевой экстракт -5.0, NaCl-5.0, агар — 20.0, Н2ОдиСТ—1000 мл. После инкубации вносили 1 мл 3% раствора пероксида водорода (Н202) и наблюдали за образованием пузырьков, которые свидетельствовали о положительной реакции.
Тест на уреазу_г среде Кристенсена с мочевиной (г/л): пептон - 1,0; глюкоза - 1,0; NaCl - 5,0; К2НР04- 2,0; мочевина - 20,0; феноловый красный - 0,012; агар - 20,0; Н2ОдИСТ-1000 мл. Изучали способность бактерий гидро-лизовать мочевину с образованием аммиака за счет активности уреазы. После инкубации наблюдали за изменением окраски в темно-розовый цвет.
Активность протеолитических ферментов (протеаз) бактерий оценивали по изменению окраски индикатора. Для определения способности к образованию NH3 проводили посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляли полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синела. Для определения выделения H2S между поверхностью пробирки и пробкой закрепляли бумажку, пропитанную раствором ацетата свинца (при образовании H2S бумажка чернеет).
Тест на нитратредуктазную активность проводили в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3 . Для определения нитритов в среду добавляли несколько капель реактива Грисса. При положительном результате наблюдали появление красного кольца.
Активность целлюлоз определяли по степени распада клетчатки на среде Гетчинсона следующего состава (г/л): К2НРО4-1,0; СаС12 / 6Н20 - 0,1; MgS04 7Н20 - 0,3; NaCl - 0,1; FeCl3 6Н20 - 0,01; NaN03 - 2,5; агар безуглеродный -18 г; Н2Одаст-1000мл; рН-7,2 ± 0,2.
Образование казеинолитических ферментов, коагуляцию казеина и восстановление в процессе роста бактерий лакмусового индикатора изучали на лакмусовом молоке следующего состава: Bacto-skim milk 100,0 г; Bacto-litmus 5,0 г; Н2ОдиСТ-1000мл (Difco). Развитие голубой окраски указывало на подщелачивание среды, розовой - на кислотообразование, обесцвечивание -на восстановление индикатора. Отмечали также створаживание или пептони-зацию. Отношение бактерий к антибиотикам изучали диффузионным методом дисков. Диски из фильтровальной бумаги, пропитанные препаратами, наносили на поверхность агаризованной среды, засеянной тест культурой. При наличии чувствительности к антибиотикам через 48 часов культивирования при 35 С вокруг дисков изучали зоны задержки роста.
Культивирование микроорганизмов проводили на среде Раймонда с нефтью при разных температурных режимах: при 37 С, 28 С, 16 С и при 8 С, а также при разной аэрации: в стационарной культуре и на качалке (при 100 об/мин). Углеводородокисляющую активность и рост чистых культур микроорганизмов изучали на жидкой минеральной среде Раймонда с 1% NaCl. Единственным источником углерода и энергии служили сырые нефти, легкие фракции нефти (керосин, соляровое масло), тяжелая фракция (мазут), а также ароматическая фракция (толуол).
Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти
Культуры с бело-кремовой пигментацией, маслянистые, грамполо-жительные. Клетки палочковидные, плеоморфные (0,8-1,2 х 1,0-8,0 мкм), характерно образование V-форм посредством сгибания (bending). Четко выражен цикл развития кокк - палочка - кокк. Старые культуры состояли из кокков. На основании данных признаков отнесены к роду Arthrobacter (Берджи, 1997). Культуры требовали для роста дрожжевой экстракт.
Культуры с кремовой пигментацией, клетки палочковидные (0,3-2,2 х 1,2-7,0 мкм), подвижные, соединены в цепочки, образовывали цилиндрические споры, располагающиеся терминально и субтерминально. Спорангии не раздувались. По данным признакам культуры отнесены к роду Bacillus (Берджи, 1997). - Культуры с желтой пигментацией, гладкие. Клетки сферические, диаметром 0,5-2 мкм, попарно - соединенные или в виде скоплений непра вильной формы, но не в цепочках. Граммположительные, неспорообразую щие. Облигатные аэробы. Каталазоположительные, галотолерантные (растут при 5% NaCl). На основании данных признаков вид отнесен к роду Micrococ cus (Берджи, 1997). - Культуры с розовой или кремовой пигментацией, грамположитель ные, аэробы, с палочковидными или нитевидными, часто ветвящимися клет ками (8-10-12 мкм), складывающимися в характерные V-формы. Воздушный мицелий отсутствует. Деление клеток осуществлялось в основном по раска лывающемуся типу (snapping); четко выражен цикл развития, старые культу ры состояли из кокков и коротких палочек. На основании этих свойств куль туры отнесены к роду Rhodococcus (Берджи, 1997). - Культуры серые или коричневые, гладкие. Имеют вегетативные гифы диаметром 0,5-1,2 мкм, часто проникающие внутрь агаризованной среды. Гифы распадаются на бактероидные элементы (палочки и кокки). Образуют воздушные гифы, видимые в микроскоп. Окраска по Граму вариабельная. Аэробы. На основании этих свойств культуры отнесены к нокардиеформным актиномицетам, к роду Nocardia (Берджи, 1997). Выделенные нами микромицеты обладали следующими таксономическим характеристиками - Гифы септированные, бесцветные, многократо супротивно разветв ленные конодиеносцы, поднимающиеся над мицелием, фиалиды вздутые у основания, расположенные на конидиеносце в большинстве под углом 90 и несущие шаровидные конидии, собранные в головки, каждая из которых со стоит из 10-20 одноклеточных бесцветных конидий. Колонии зеленого цве та с участками рыхлой клочковатой или войлочной поверхности. Согласно морфологическим и культуральным признакам выделенный микромицет от несен к роду Trichoderma (Domsch et al, 1980; Gary Samuel s, 2000). - Гифы септированные, бесцветные, фиалоконидии удлиненные, одноклеточные, сухие, почти бесцветные, элипсоидные, размером 6-9 х 2,5-4,5 мкм. Конидии сгруппированы в цепочки и колонки, в массе дают зеленую окраску. Колонии белые, цилиндрические, "пушистые", диаметром до 5-6 мм. С возрастом их диаметр увеличивается до 15-20 мм и они становятся серыми. Морфологические и культуральные признаки выделенного микро-мицета дают основание отнести его к роду Metarrhizium (Domsch et al, 1980; Саттон и др, 2001). - Гифы септированные, бесцветные. Конидиальные головки с фиали дами на метулах, конидиеносцы бесцветные, длиной от 200-800 мкм, кони дии зеленоватые, гладкие. Колонии дымчатые, серовато-зеленые, с желто зеленой обратной стороной, быстрорастущие. По фактуре колонии шерсти стые. Согласно полученным морфологическим признакам выделенный мик ромицет отнесен к роду Aspergillus (Domsch et al, 1980; Билай, 1988). - Гифы септированные, бесцветные. Конидиеносцы простые и разветвленные. Конидиогенные клетки - монофиалиды, дающие макро- и микроконидии. Макроконидии многочисленные, серповидные, с 3-5 септами (30-38 х 3-5 мкм). Микроконидии (6-26 х 2-4 мкм) многочисленные, овальные, с 0-1 септой. Хламидоспоры с шероховатой поверхностью, коричневого цвета. Колонии крупные, хлопьевидные (ватообразные), кремово-розоватые, по мере старения культуры приобретают коричневый оттенок. Согласно морфологическим и культуральным свойствам выделенный микромицет отнесен к роду Fusarium (Domsch et al, 1980; Саттон и др., 2001). - Колонии мелкие (D= 2-4 мм), от белых до светло-кремовых, гладкие, иногда слегка морщинистые. При росте на среде Сабуро могут образовывать обильно ветвящиеся псевдогифы. Могут присутствовать скопления удлиненных бластоконидий. Согласно морфологическим и культуральным признакам выделенный дрожжевой гриб отнесен к классу Endomycetes, к роду Candida (Domsch et al, 1980; Саттон и др., 2001).
Изучалась способность выделенных штаммов микроорганизмов окислять углеводороды нефти. Для этого каждый штамм микроорганизмов культивировали в жидкой среде Раймонда, в которой нефть использовалась в качестве единственного источника углерода. После 10 дней инкубации нефть, содержащую в среде, экстрагировали гексаном и подвергали газохромато-графическому анализу. Анализировали изменение состава насыщенных фракций углеводородов нефти в процессе микробной деградации.
Для дальнейших исследований методом селективного аналитического отбора и данным газохроматографического анализа нами оставлены наиболее активные штаммы микроорганизмов: Pseudomonas putida (рис.2а); Rhodococ-cus ruber (рис.2б); Trichoderma citrinoviride (рис.2в);Metarrhizium anisopliae (рис.2г); Aspergillus carneus (рис.2д). Критериями отбора наиболее активных штаммов были такие показатели, как снижение коэффициента труднодоступных соединений пристан/фитан и снижение количества н-алканов в насыщенной фракции нефти. Результаты газохроматографического анализа показали, что данные штаммы микроорганизмов характеризуются как активные деструкторы насыщенной фракции углеводородов (табл.2).
