Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1.1. Хитин и его производные 9
1.2. Использование хитина в промышленности и сельском хозяйстве 14
1.3. Разложение хитина разными группами микроорганизмов в почве 32
Глава II. Объекты и методы исследования 44
Глава III. Результаты и их обсуждение 60
Эмиссия диоксида углерода из почв при внесении хитина
Ш.2. Изучение структуры хитинолитического микробного сообщества в почве 65
III. 3. Оценка интенсивности использования хитина чистыми культурами микроорганизмов 77
Ш.4. Исследование структуры прокариотного комплекса чернозема обыкновенного 88
III. 4. 1. Интенсивность разложения хитина актиномицетами разных родов 92
III. 4. 1. 2. Длина мицелия и число спор, биомасса мицелия и спор актиномицетов, растущих на среде с хитином 92
III. 4. 1.3. Накопление СО2 актиномицетами разных родов, растущих на среде с хитином 93
III. 4. 1.4. Накопление ионов NH4+ актиномицетами разных родов, растущих на среде с хитином 94
Заключение 97
- Использование хитина в промышленности и сельском хозяйстве
- Разложение хитина разными группами микроорганизмов в почве
- Оценка интенсивности использования хитина чистыми культурами микроорганизмов
- Длина мицелия и число спор, биомасса мицелия и спор актиномицетов, растущих на среде с хитином
Использование хитина в промышленности и сельском хозяйстве
Благодаря выше указанным свойствам эти полимеры весьма перспективны для использования в медицине, фармацевтической и косметической промышленности, а также для дальнейшей химической модификации. Синтез хитозана из твердого хитина с небольшим количеством гидроксида натрия дает возможность получить препарат с низким молекулярным весом, это свойство обеспечивает лучшую адсорбцию, облегчение метаболизма и ускорение последующего удаления из организма этого препарата (Zelentski, Akopova, 2001). Некоторые соли хитозана являются эффективным стимулятором роста растений. Известно также, что комплекс хитозан-целлюлоза, обладая анионно-обменными и комплексообразующими свойствами, подходит для сорбции кислых реагентов, металлов протеинов, YL других-соединений (Zelentski, Akopova, 2001). Полиаминосахариды хитин и хитозан имеют ряд преимуществ перед неорганическими сорбентами: более высокие сорбционные емкости по отношению к радиоактивным элементам; при сжигании дают не более 30% золы, что резко снижает объемы радиоактивных отходов и затраты при их захоронении. Области применения хитина и хитозана постоянно расширяются. (Быков, Фурман, 1999). Биосорбенты на основе хитин-хитозана имеют ряд характеристик:
Емкости сорбентов по отношению к ионам металлов достигают: 300 мг металла на грамм сорбента по меди 500 мг/г по свинцу, ПО мг/г по цинку, 130 мг/г по кадмию, 500 мг/г по урану. S Биосорбенты обладают высокой степенью извлечения из разбавленных растворов (концентрации ионов металлов менее 1 мг/л). S Биосорбенты обладают высокой степенью извлечения металлов при высоком массовом соотношении раствор/сорбент (более 500000). S Окисляемость фильтрата, определяемая по стандартной методике, не превышает 50 мг-экв кислорода на г сорбента. Аналогичный показатель для других известных биосорбентов составляет 1000-3000 на 1г. S Сорбенты для извлечения золота и регенерации минеральных масел обладают хорошими механическими свойствами. S После сорбции ценные компоненты могут быть извлечены либо путем десорбции, либо разложением золы. Использованный сорбент образует при сжигании 1,5-30 % золы массы сухого сорбента, что позволяет легко компактировать токсичные отходы. Сорбенты на основе хитина и хитозана грибов являются активными сорбентами токсичных металлов, представляющих наибольшую опасность в сточных водах (Феофилова и др., 1990). Хитинсодержащие материалы наряду с ионами тяжелых металлов эффективно сорбируют углеводороды, пестициды, красители и фенолы (Тесленко и др., 1992; Tsezos, 1982).
Биосорбенты имеют и некоторые существенные недостатки, сужающие возможности их применения во многих технологических процессах: низкая селективность, малая механическая прочность в воде, высокие показатели окисляемости фильтрата, сложная регенерация, часто сопоставимая по затратам с производством сорбента. Однако, при применении сорбентов в экомониторинге отсутствие селективности позволяет определять сразу широкий спектр загрязнений, причем элементы могут сортироваться как в катионной, так и в анионной формах. Механическая прочность биосорбентов в воде ниже, чем у синтетических ионитов, однако для использования при определении загрязненности водоемов вполне достаточна. Высокие показатели окисляемости фильтрата (примерно в 10 раз выше, чем у синтетических сорбентов) в данном случае не являются препятствием для использования биосорбентов. При неизбежной деструкции биосорбентов в процессе эксплуатации в водную фазу попадают не производные ароматических углеводородов, как это имеет место при применении синтетических сорбентов, а безвредные вещества (олигосахариды, аминокислоты), которые всегда в небольших количествах содержатся в воде открытых водоемов. Наконец, в регенерации биосорбентов при их небольшой стоимости нет никакой необходимости (Кириллова и др., 1999).
Полиаминосахариды находят в последние годы все большее применение в сельском хозяйстве. Это обусловлено такими их свойствами как биосовместимость, биоразлагаемость, отсутствие токсичности, высокая способность к комплексообразованию. Препараты на основе хитина и хитозана применяют в сельском хозяйстве США, Японии и Канаде. Ценность препаратов состоит в том, что предпосевная обработка семян увеличивает урожайность культур и устойчивость к грибковым заболеваниям (Muzzarelli, 1977).
В Японии специальные фирмы ("Taiyo Chemical Industry Со", "Nisshia Kasei Co") разработали стимулятор роста растений, состоящий из хитозана, органических кислот и аминокислот. Хитозан действует на Fusarium solani, останавливая рост этих патогенных для растений грибов, органические кислоты способствуют тому, что почвенные бактерии быстрее растворяют фосфорные соединения почвы, облегчая тем самым корням растений сорбировать фосфорную кислоту. Аминокислоты генерируют этилен, служащий растительным гормоном, что также стимулирует рост растений (Набаулин и др., 1992). Важной особенностью современных технологий выращивания сельскохозяйственных культур является применение биологически активных, экологически безопасных препаратов с целью повышения урожайности, устойчивости к различным заболеваниям и неблагоприятным воздействиям внешней среды (Госсе, 2004; Hallman et al., 1999; De Boer et al., 1999). Хитозан в растениеводстве применяют в качестве химического иммуномодулятора, т.е. вещества, повышающего неспецифическую устойчивость растений к болезням. Так,. опрыскивание растений огурца хитозаном эффективно против возбудителя мучнистой росы и возбудителя антракноза. Последнее достигалось замачиванием семян в 0,2%-ом растворе хитозана (Namura, 1988).
Механизм действия хитозана состоит в том, что он стимулирует специфические гены у растений и в определенных концентрациях может полностью ингибировать, синтез РНК у некоторых грибов-паразитов (Тютерев и др., 1995).
Таким образом, хитозан у растений может выполнять двойную роль во взаимодействиях между растением-хозяином и грибом-паразитом. Во-первых, хитозан ингибирует рост мицелия гриба и прорастание его спор. Во-вторых, индуцирует защитные реакции растения против проникновения патогена. Поэтому хитозан, и особенно хитозан грибов, все шире применяется в сельском хозяйстве как почвенный аддитив, средство для обработки семян перед посевом, а также для опрыскивания листьев растений. Последнее может защитить при использовании в строго контролируемых концентрациях молодую листву от мучнистой росы и полосатой ржавчины, вызываемой Puccinia striiformis (Hadwiger et al., 1986).
Разложение хитина разными группами микроорганизмов в почве
Исследование интенсивности образования диоксида углерода в почвах при внесении хитина показало, что активность эмиссии С02 была выше по сравнению с контрольным вариантом (почва, увлажненная водой), причем такая закономерность отмечалась во все сроки эксперимента. Длительность срока эксперимента (один месяц) определялась выходом на некоторую климаксную систему, что выражается стабилизацией эмиссии диоксида углерода к концу опыта.
Особенно четко различия между контрольным и опытным вариантами проявлялись, начиная с 7-х суток опыта. Наличие разницы между контрольным и опытным вариантами дает возможность предположить, что интенсивное использование хитина почвенными микроорганизмами происходит уже на начальных этапах сукцессии. К 7-ым суткам эмиссия диоксида углерода из чернозема при внесении хитина достигала 16 мкг С-С02/г почвы за сутки (рис. 1).
Методом сравнения средних было показано, что значения контрольного и опытного вариантов достоверно различались во всех почвах (рис. 2).
В дальнейшем использовали понятие отклика почвы на внесение хитина (или коэффициент трансформации хитина, КТХ), представляющего собой отношение между значениями эмиссии диоксида углерода из опытного образца к контрольному. При наблюдении за динамикой разложения хитина в образцах изучаемых типов почв следует отметить, что разложение хитина в черноземе и серой лесной почве протекало почти в 2 раза интенсивнее (рис. 3). Динамика эмиссии диоксида углерода почвами разных типов в процессе сукцессии при добавлении хитина и без него. -4UШхити П2хити ПЗхити П4хити П5хити Пбхити Швода П2вода ПЗвода П4вода Пбвода Пбвода Рис. 2. Сравнение средних значений эмиссии диоксида углерода из почв: Ш-чернозем, П2-каштановая, ПЗ-солонец, П4-серая лесная, П5-бурозем, П6-дерново-подзолисто-глеевая.
Рис. 3. Динамика разложения хитина в разных почвах; КТХ= мкг С-С02 опыт /мкг С - СОг контроль. По результатам кластерного анализа отклика эмиссии диоксида углерода из почв на внесение хитина исследуемые образцы почв объединяются в следующие группы: каштановая и солонец, бурозем и дерново-подзолисто-глеевая почва. Следует отметить, что серая лесная почва и чернозем не входили ни в одну из этих групп и представляли отдельную категорию в ряде рассматриваемых почв (рис.4).
Следующей задачей наших исследований было определение динамики численности хитинолитических микроорганизмов в образцах исследуемых почв. С этой целью использовали метод инициированного микробного сообщества. III. 2. Динамика структуры хитинолитического микробного сообщества в почве.
Исследование динамики структуры хитинолитического микробного сообщества проводили на образцах чернозема обыкновенного, серой лесной, каштановой почв и солонца. В результате эксперимента показано, что численность прокариотного и эукариотного комплекса практически во всех изучаемых почвах с внесением хитина была выше по сравнению с контрольным вариантом, причем такая закономерность наблюдалась на всех, начиная с ранних, этапах сукцессии. Важно отметить, что увеличение эмиссии диоксида углерода кореллировало с возрастанием численности микроорганизмов в почве при внесении хитина. Максимальных значений численность бактерий и длина мицелия грибов достигала к 4-7 суткам сукцессии. Длина актиномицетного мицелия достигала своих максимальных значений к 7-14 суткам, спорообразование грибов происходило на 14-30 сутки. В черноземе, при сравнении численности бактерий в контрольном и опытных вариантах, отмечаются резкие различия на 4-е сутки сукцессии. На этом этапе численность бактерий в варианте с хитином достигает значений, в два раза превышающих таковые в контроле. Такие же закономерности наблюдаются и для мицелиальных прокариот. При сравнении же длины мицелия грибов в опытных и контрольных вариантах на 4-е сутки сукцессии отличия менее значимы. Более того, на ранних этапах сукцессии в солонце и каштановой почвах отмечается снижение длины мицелия эукариот в опытных вариантах с хитином по сравнению с контролем. Эта особенность, по всей видимости, объясняется созданием недостаточно благоприятных условий для развития. эукариот, в результате чего происходят сопряженные процессы отмирания части мицелия и перехода к стадии спороношения. Количество грибных спор в черноземе в вариантах с хитином не отличалось от количества спор в контрольном варианте в течение всего эксперимента. К середине и концу сукцессии (14-е, 30-е сутки опыта) численность спор грибов возрастает. К концу эксперимента (30-е сутки сукцессии) наблюдается некоторое снижение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов. Из полученных закономерностей можно заключить, что система приобретает некоторое стационарное состояние.
При определении биомассы прокариот было показано, что на всех этапах эксперимента в вариантах с хитином она была выше по сравнению с контролем (рис. 5-8). Особенно четко эта разница проявлялась в черноземе и серой лесной почве. Уже на начальных этапах эксперимента (к 4-м суткам опыта) биомасса прокариот, как мицелиальных, так и одноклеточных, в образцах с хитином была примерно в два раза выше по сравнению с контролем. В предыдущих наших работах с чистыми культурами мицелиальных прокариот, растущих на среде с хитином, таюке отмечалось возрастание биомассы мицелия и количества спор актиномицетов к 7-м суткам опыта (Манучарова и др., 2004).
При рассмотрении биомассы эукариот в ходе хитинолитической сукцессии в почве наблюдается некоторая особенность. В образцах солонца и каштановой почвы на ранних этапах сукцессии биомасса грибов в опытных вариантах с хитином была несколько ниже контрольного варианта, увлажненного только водой (рис. 5, 6). В черноземе и серой лесной почве биомасса грибов в этот срок в исследуемых вариантах изменялась в пределах ошибки опыта (рис. 7, 8).
Оценка интенсивности использования хитина чистыми культурами микроорганизмов
Исследование интенсивности образования диоксида углерода в почвах при внесении хитина показало, что активность эмиссии С02 была выше по сравнению с контрольным вариантом (почва, увлажненная водой), причем такая закономерность отмечалась во все сроки эксперимента. Длительность срока эксперимента (один месяц) определялась выходом на некоторую климаксную систему, что выражается стабилизацией эмиссии диоксида углерода к концу опыта.
Особенно четко различия между контрольным и опытным вариантами проявлялись, начиная с 7-х суток опыта. Наличие разницы между контрольным и опытным вариантами дает возможность предположить, что интенсивное использование хитина почвенными микроорганизмами происходит уже на начальных этапах сукцессии. К 7-ым суткам эмиссия диоксида углерода из чернозема при внесении хитина достигала 16 мкг С-С02/г почвы за сутки (рис. 1).
Методом сравнения средних было показано, что значения контрольного и опытного вариантов достоверно различались во всех почвах (рис. 2).
В дальнейшем использовали понятие отклика почвы на внесение хитина (или коэффициент трансформации хитина, КТХ), представляющего собой отношение между значениями эмиссии диоксида углерода из опытного образца к контрольному. При наблюдении за динамикой разложения хитина в образцах изучаемых типов почв следует отметить, что разложение хитина в черноземе и серой лесной почве протекало почти в 2 раза интенсивнее (рис. 3).
Динамика разложения хитина в разных почвах; КТХ= мкг С-С02 опыт /мкг С - СОг контроль. По результатам кластерного анализа отклика эмиссии диоксида углерода из почв на внесение хитина исследуемые образцы почв объединяются в следующие группы: каштановая и солонец, бурозем и дерново-подзолисто-глеевая почва. Следует отметить, что серая лесная почва и чернозем не входили ни в одну из этих групп и представляли отдельную категорию в ряде рассматриваемых почв (рис.4).
Следующей задачей наших исследований было определение динамики численности хитинолитических микроорганизмов в образцах исследуемых почв. С этой целью использовали метод инициированного микробного сообщества. III. 2. Динамика структуры хитинолитического микробного сообщества в почве.
Исследование динамики структуры хитинолитического микробного сообщества проводили на образцах чернозема обыкновенного, серой лесной, каштановой почв и солонца. В результате эксперимента показано, что численность прокариотного и эукариотного комплекса практически во всех изучаемых почвах с внесением хитина была выше по сравнению с контрольным вариантом, причем такая закономерность наблюдалась на всех, начиная с ранних, этапах сукцессии. Важно отметить, что увеличение эмиссии диоксида углерода кореллировало с возрастанием численности микроорганизмов в почве при внесении хитина. Максимальных значений численность бактерий и длина мицелия грибов достигала к 4-7 суткам сукцессии. Длина актиномицетного мицелия достигала своих максимальных значений к 7-14 суткам, спорообразование грибов происходило на 14-30 сутки. В черноземе, при сравнении численности бактерий в контрольном и опытных вариантах, отмечаются резкие различия на 4-е сутки сукцессии. На этом этапе численность бактерий в варианте с хитином достигает значений, в два раза превышающих таковые в контроле. Такие же закономерности наблюдаются и для мицелиальных прокариот. При сравнении же длины мицелия грибов в опытных и контрольных вариантах на 4-е сутки сукцессии отличия менее значимы. Более того, на ранних этапах сукцессии в солонце и каштановой почвах отмечается снижение длины мицелия эукариот в опытных вариантах с хитином по сравнению с контролем. Эта особенность, по всей видимости, объясняется созданием недостаточно благоприятных условий для развития. эукариот, в результате чего происходят сопряженные процессы отмирания части мицелия и перехода к стадии спороношения. Количество грибных спор в черноземе в вариантах с хитином не отличалось от количества спор в контрольном варианте в течение всего эксперимента. К середине и концу сукцессии (14-е, 30-е сутки опыта) численность спор грибов возрастает. К концу эксперимента (30-е сутки сукцессии) наблюдается некоторое снижение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов. Из полученных закономерностей можно заключить, что система приобретает некоторое стационарное состояние.
При определении биомассы прокариот было показано, что на всех этапах эксперимента в вариантах с хитином она была выше по сравнению с контролем (рис. 5-8). Особенно четко эта разница проявлялась в черноземе и серой лесной почве. Уже на начальных этапах эксперимента (к 4-м суткам опыта) биомасса прокариот, как мицелиальных, так и одноклеточных, в образцах с хитином была примерно в два раза выше по сравнению с контролем. В предыдущих наших работах с чистыми культурами мицелиальных прокариот, растущих на среде с хитином, таюке отмечалось возрастание биомассы мицелия и количества спор актиномицетов к 7-м суткам опыта (Манучарова и др., 2004).
При рассмотрении биомассы эукариот в ходе хитинолитической сукцессии в почве наблюдается некоторая особенность. В образцах солонца и каштановой почвы на ранних этапах сукцессии биомасса грибов в опытных вариантах с хитином была несколько ниже контрольного варианта, увлажненного только водой (рис. 5, 6). В черноземе и серой лесной почве биомасса грибов в этот срок в исследуемых вариантах изменялась в пределах ошибки опыта (рис. 7, 8).
Таким образом, добавление хитина в образцы всех исследуемых почв приводило к значительному возрастанию, начиная на ранних этапов сукцессии, численности и биомассы прокариотных микроорганизмов, как бактерий, так и актиномицетов по сравнению с контрольным вариантом, где сукцессии инициировались простым увлажнением. Биомасса грибов в почвах с достаточно высоким содержанием органического вещества (чернозем и серая лесная почва) при добавлении хитина возрастала по сравнению с контролем, в отличие от почв с пониженным содержанием гумуса (солонец и каштановая), где уже на ранних сроках опыта (3-й сутки)
Длина мицелия и число спор, биомасса мицелия и спор актиномицетов, растущих на среде с хитином
В дальнейших экспериментах изучались образцы почв, в которых трансформация хитина, по исследуемым нами параметрам (СОг и биомасса), протекала наиболее активно - серая лесная почва и чернозем.
К 7-10-м суткам эксперимента в образцах исследуемых почв спектрофотометрическим методом нами был обнаружен экзофермент хитиназа, как в контрольном, так и в опытном вариантах.
Исследование микробного комплекса чернозема и серой лесной почвы методом посева на среду с хитином в качестве единственного источника углерода и азота выявило доминантов хитинолитического микробного комплекса в черноземе обыкновенном: - - - - - - . среди одноклеточных прокариот - Bacillus cereus, представители родов Alcaligenes и Arthrobacter; среди мицелиальных прокариот — представители родов Streptomyces, Streptosporangium и Micromonospora; среди одноклеточных прокариот - представители родов Bacillus, Cytophaga и Bosea (по определению нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК оказался практически идентичным типовым штаммам двух видов Bosea vestrisii и Bosea eneae); среди актиномицетов - разные роды Streptomyces (S. wedmorensis; S. nitrosporeus; S. omiyaensis); среди грибов - представители родов Penicillium и Mortierella. Определение таксономического положения наиболее активной хитинолитической бактерии проводили методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК. При проведении предварительного BLAST-анализа секвенированного фрагмента гена 16S рРНК штамма 1 (1453 нуклеотида), соответствующего (E.coli) позициям с 10 по 1467, было установлено, что исследуемый штамм принадлежит к семейству Bradyrhizobiaceae альфа-протеобактерий.
Для определения точной филогенетической позиции исследуемого штамма внутри семейства Bradyrhizobiaceae были использованы доступные из базы данных GenBank последовательности представителей других родов этого семейства.
Последовательность гена 16S рРНК изучаемого штамма оказалась практически идентичной (99,3-99,4% гомологии) с последовательностями, типовых штаммов двух видов рода Bosea - Bosea vestrisii 34635 и Bosea eneae 34614 . На построенном филогенетическом дереве последовательность гена 16S рРНК исследуемого штамма и близких к нему штаммов, вместе с остальными видами рода Bosea (98,2-99,88% гомологии) составили единый кластер (рис.У), отдельный от других последовательностей других родов семейства Bradyrhizobiaceae с максимальной степенью достоверности (значение бутстреп-поддержки точки ветвления 100%). Уровень сходства последовательностей членов этого кластера с другими представителями семейства Bradyrhizobiaceae был заметно ниже, составляя не более 92%.
В соответствии с правилами таксономии штаммы, имеющие более 98,7-99% сходства последовательностей генов 16S рРНК, можно относить к одному виду (Stackebrandt et al., 1994, 2006). Поэтому исследуемый штамм можно равновероятно идентифицировать как представителя видов Bosea vestrisii и Bosea eneae. В тоже время, учитывая идентичность последовательностей генов 16S рРНК типовых штаммов этих двух самостоятельных видов (99,9% гомологии) нельзя исключить возможность описания выделенного нами штамма в качестве нового вида рода Bosea. Это может быть осуществлено при обнаружении значительных фенотипических различий с типовыми штаммами близких видов, а также низкого уровня гибридизации ДНК-ДНК. 0.0
Филогенетическое дерево последовательности гена 16S рРНК исследуемого штамма и близких к нему штаммов, вместе с остальными видами рода Bosea. Работа, проведенная с выделенными нами культурами, показала, что эмиссия диоксида углерода культурами, растущими на среде с хитином, была выше по сравнению с контролем для всех исследуемых штаммов микроорганизмов (рис. 16).
Динамика эмиссии диоксида углерода чистыми культурами микроорганизмов в черноземе (а) и серой лесной почве (б). Следует отметить, что для хитинолитического комплекса выделенного из чернозема обнаруживается прирост эмиссии диоксида углерода у всех исследуемых групп: как для прокариот, так и для эукариот. При рассмотрении комплекса серой лесной почвы особенного внимания заслуживают актиномицеты. Эмиссия диоксида углерода в опытном варианте представителей рода Streptomyces по сравнению с контролем возрастает на порядок.
При рассмотрении динамики биомассы чистых культур хитинолитиков отмечается похожая картина: все исследуемые штаммы, выделенные из чернозема, достаточно активно накапливали биомассу при росте на хитине. По сравнению с контролем биомасса всех групп микроорганизмов (и бактерий, и актиномицетов, и грибов) увеличивалась примерно в 5 -7 раз (рис. 17
