Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1. Систематика рода Actinomadura 6
1.1. Исторический аспект положения рода Actinomadura в систематике актиномицетов 6
1.2. Описание рода Actinomadura 24
2. Экология рода Actinomadura 34
2.1. Распространение актиномадур в природе 34
2.2. Место актиномадур в микробной сукцессии 40
2.3. Патогенность 46
3. Методы обнаружения актиномадур в природе 49
3.1. Селективные методы выделения актиномадур и близких им родов 49
3.2. Другие методы обнаружения актиномицетов рода Actinomadura в микробных сообществах экосистем 57
Глава 2 Материалы и методы
1. Объекты исследования 61
2. Методы исследования 66
2.1. Методы выделения и учета актиномицетов 66
2.1.1. Методы выделения и учета актиномицетов рода Actinomadura 66
2.1.2. Методы селективного выделения и экологической оценки актиномадур 69
2.2. Изучение таксономического положения выделенных культур актиномицетов 76
2.3. Методы идентификации видов рода Actinomadura 80
2.4. Сукцессионный анализ 82
2.5. Метод определения радиальной скорости роста актиномадур и стрептомицетов 84
2.6. Интродукция актиномицетных популяций в почву 85
2.6.1. Методы получения моноспоровых суспензий актиномицетов 8 5
2.6.2. Внесение моноспоровых суспензий в почву 85
2.6.3. Методы люминесцентной микроскопии с флуорохромированием акридином оранжевым 86
Глава 3 Результаты исследования
1. Вертикально-ярусное распределение актиномадур в биогеоценозах основных почвенно-климатических зон. Распространение актиномадур в различных типах почв 87
1.1. Распределение численности актиномадур по вертикально-ярусной структуре основных типов биогеоценозов 87
1.2. Распределение численности актиномадур в зональном ряду почв и пространственно-сукцессионном ряду субстратов 91
1.3. Место актиномадур в актиномицетных комплексах 96
2. Распределение рода Actinomadura по элементам рельефа. Сезонная динамика численности актиномадур
(на примере луговых биогеоценозов) 101
3. Динамика численности актиномадур в ходе микробной сукцессии в почве 103
4. Структура популяций актиномадур в почве 110
5. Определение радиальной скорости роста актиномадур 114
Глава 4 Идентификация выделенных культур актиномадур 117
Глава 5 CLASS Обсуждение результато CLASS в 135
Выводы 144
Список литературы 145
- Распространение актиномадур в природе
- Методы селективного выделения и экологической оценки актиномадур
- Распределение численности актиномадур по вертикально-ярусной структуре основных типов биогеоценозов
- Определение радиальной скорости роста актиномадур
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время группа актиномицетов и родственных им микроорганизмов включает более ста родов (Stackebrandt et al., 1997). Традиционно считалось, что в почве наиболее распространены представители родов Strep-tomyces и Micromonospora, применение селективных методов выделения актиномицетов из почвы позволило выявить в почве представителей редких родов, в том числе и рода Actinomadura.
Актиномадуры впервые были выделены из клинического материала, их традиционно считали редко встречающимися в почве актиномицетами. После обнаружения среди представителей рода продуцентов редких антибиотиков, эти актиномицеты начали интенсивно изучаться актиномицетологами с целью поиска антибиотически активных штаммов. Было выполнено большое число исследований (таксономических состав рода постоянно изменялся), были выделены новые продуценты противоопухолевых антибиотиков, антибиотиков резерва, ферментов (более 40 веществ). Однако исследования, направленные на поиск биологически активных штаммов, не решали экологических проблем, и вопросы экологической диагностики рода Actinomadura оставались открытыми.
Род Actinomadura (25 видов) (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1994) до сих пор представляет собой гетерогенный таксон актиномицетов, в большинстве своем почвенных сапротрофов, близких по своим морфологическим, физиологическим и хемотаксономическим свойствам представителям таких родов, как Microtetraspora, Nonomuraea, Actinocorallia и Mi-crobispora (Kroppenstedt et al, 1990, Zhang et al., 1998, Zhang et al., 2001). Решающим родовым дифференцирующими признаками являются состав клеточных жирных кислот, менахинонов и последовательности 16S и 23S рДНК. Нам представляется целесообразным объединить эти роды в группу родов актиномицетов, близких роду Actinomadura, как на основании их филогенетического родства, так и на основании схожести их морфологических и физиологических характеристик.
Цель работы - выявление закономерностей распространения актиномицетов рода Actinomadura в наземных экосистемах и составление их экологической характеристики.
Задачи исследования:
Разработка комплексных методов для селективного выделения актиномадур и близких им родов из почв и растительных субстратов.
Изучение закономерностей распространения группы актиномице-тов рода Actinomadura в зональных и интразональных почвах и основных типах биогеоценозов.
Определение места актиномадур среди других актиномицетов в микробной сукцессии в почве.
Установление структуры популяций (споры-мицелий) представителей рода Actinomadura в почве.
Научная новизна
Предложен комплексный метод для селективного выделения из почвы представителей рода Actinomadura и для экологической оценки этих актиномицетов в почвенном актиномицетном комплексе.
Впервые показано, что актиномадуры - минорный, но постоянный компонент почвенных актиномицетных комплексов. Они приурочены к органогенным горизонтам почв, субстратам, богатым растительными остатками (напочвенный ярус) и не обнаружены на поверхности растений. Встречаемость актиномадур в почвах увеличивается при движении от северных почв к южным, достигая максимума в черноземах и сероземах.
Использование сукцессионного анализа позволило проследить за динамикой популяционной плотности актиномадур на фоне динамики популяций других актиномицетных родов и выявить наиболее благоприятные для выделения актиномадур временные периоды и условия. Ранние сроки сукцессии наиболее благоприятны для выделения актиномадур из почвы при инициации сукцессии увлажением до уровня, близкого влаге завядания (ВЗ) (-3 атм).
Впервые исследована структура популяций актиномадур (споры-мицелий). Установлено, что споры исследованного штамма Actinomadura со-erulea в почве прорастают быстрее, чем споры штамма Streptomyces xantho-chromogenus, однако развитие проростков происходит медленнее, по сравнению со стрептомицетами. Популяции актиномадур в почве представлены спорами в большей степени, чем мицелием.
Практическая значимость
Выявление закономерностей распространения актиномадур в почве обогащает наши знания о биоразнообразии микробного мира в целом и разнооб-
разии почвенных актиномицетов в частности, и вносит вклад в разработку способов его сохранения.
Данные, полученные в ходе исследования динамики популяционной плотности актиномадур в ходе микробной сукцессии в почве и при изучении распределения этих актиномицетов по ярусам биогеоценозов и горизонтам почв, дают возможность оптимизировать процедуру поиска штаммов-продуцентов биологически активных веществ, а также позволяют подойти к проблеме управления поведением интродуцированных популяций непосредственно в почве.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на международных конференциях: IXth International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Sydney, Australia, 1999), «Ломоносов-99», «Ломонсов-2000», «Ломоносов-2001», «Биология - наука 21 века. 5ая Пущинская конференция молодых ученых» (Пущено, 2001), Xlth International Symposium on Biology of Actino-mycetes (Vancouver, Canada, 2001), «Экология и биогеохимическая деятельность микроорганизмов» (Одесса, 2001), «Биология — наука 21 века, бая Пущинская конференция молодых ученых» (Пущено, 2002), «Биогеография почв» (Сыктывкар, 2002), «Ломоносов-2003», «Биология — наука 21 века. 7ая Пущинская конференция молодых ученых» (Пущено, 2003), а также на III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000) и на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.
Публикации
Материалы диссертации изложены в 18 печатных работах.
Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой биологии почв проф. д.б.н. академику РАЕН Звягинцеву Д.Г. за постоянное внимание к работе.
Автор благодарит проф. д.б.н. Судницина И.И., проф. д.б.н. Чернова И.Ю., д.б.н. Кожевина П.А. и к.б.н. Початкову Т.Н. за консультации и ценные советы.
Автор выражает признательность к.б.н. Лихачевой А.А. и всему коллективу кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова за сотрудничество и поддержку.
Распространение актиномадур в природе
Анализ более 23000 литературных источников о биоактивных веществах, включая 8000 статей об антиинфекционных препаратах, показал, что роль так называемых «редких родов» актиномицетов как источника новых антибиотиков растет с каждым годом. Итальянские исследователи показали на примере Итальянской Коллекции Микроорганизмов, состоящей из более чем 20000 штаммов, что прошлые и настоящие успехи в области выделения редких актиномицетов (разработка селективных методов выделения и интенсивное их внедрение в практику) привели к пересмотру термина «редкие актиномице-ты», так как такие редкие роды, как Actinomadura, Actinoplana, Micromono-spora, Microtetraspora, Nonomuraea вовсе не являются редкими, так как могут быть обнаружены во множестве почвенных субстратах. В последнее время особое внимание уделяется выделению из природных источников членов семейства Streptosporangiaceae (Lazzarini et al., 2000).
Актиномадуры часто выделяются с надземных частей растений и с поверхности корней (овес, ячмень, морковь, травы и кустарнички) (The Procaryotes, 1991; Itoh et al., 1996). Существует ряд работ по поиску продуцентов противогрибковых антибиотиков для регулирования заболеваний растений разнообразными гнилями. В ходе таких работ из ризосферы картофеля были изолированы штаммы Actinomadura spp., обладающие противогрибковой активностью. При известковании почвы число редких актиномицетов, в том числе и актиномадур, выделяемых в чистую культуру и обладающих антибиотической активностью, увеличивается (El Tarabily et al., 1996; El Tarabily et al., 1997). Актиномадуры также выделяются из запасенного сена и овощей, компостов и других саморазогревающихся субстратов (The Procaryotes, 1991; Kleeberg et al., 1998).
В последнее время интенсивно исследуется распространение актиномицетов рода Actinomadura в почвах. В работах (Галатенко, 1983; Галатен-ко и др., 1988; Чормонова и Преображенская, 1990) актиномадуры выделялись из светлого серозёма, светло-каштановой почвы, чернозёма типичного, дерново-подзолистой почвы и почв арктической и южной тундры. Наблюдалось закономерное увеличение их численности при переходе от дерново-подзолистых почв к чернозёмам, светло-каштановым и окультурен ным светлым серозёмам, что соответствует нарастанию общей численности актиномицетов в том же порядке. На основании этих данных можно сказать, что закономерности распространения актиномадур в почве близки закономерностям распространения стрептомицетов (табл. 5).
Доля актиномадур в комплексе почвенных актиномицетов при переходе от почвы к почве практически не изменялась и не превышала 5%. Показатели видового и общего разнообразия увеличиваются при переходе от почв северных территорий к почвам южных, в то время как значения показателя концентрации доминирования понижаются (табл. 5).
Таблица 5. Численность актиномадур и некоторые показатели их видового разнообразия в различных типах почв (по Чормонова и Преображенская, 1990)
Тип почвы Численность актиномадур, тыс. КОЕ/г Доля актиномадур в актино.ми-цстном комплексе (%) Количество Показатель доминирования Показатель видового богатства Выравненность распределения штаммов между видами Общее разнообразие видов видов штаммов Дерново-подзолистая целинная (Московская обл.) 6 ±2,8 5±2 7 168 0,68 1,17 0,38 0,73 Дерново-подзолистая окультуренная (Московская обл.) 19 ±5 5±1 10 343 0,23 1,54 0,78 1,79 Типичный чернозем целинный (Курская обл.) 24 ±10 1±0,6 13 92 0,15 2,65 0,84 2,16 Типичный чернозем окультуренный (Курская обл.) 23 ±12 3±2 13 202 0,25 2,26 0,71 1,84 Светло-каштановая, целинная (Волгоградская обл.) 93 ±32 3±1 17 232 0,22 2,94 0,69 1,96 Светло-каштановая, окультуренная (Волгоградская обл.) 76 ±36 3+2 18 205 0,14 3,19 0,78 2,26 Светлый серозем, целинный (Ашхабадская обл.) 37±16 2±1 13 85 0,18 2,70 0,79 2,03 Светлый серозем, окультуренный (Ашхабадская обл.) 160 + 88 4±1 15 544 0,20 2,22 0,74 1,98 Все полученные результаты свидетельствует о том, что видовое разнообразие актиномадур более отчетливо выражено в типичном черноземе, светло-каштановой почве и светлом сероземе по сравнению с дерново-подзолистой почвой. Видовое разнообразие изменяется также при переходе от целинной к окультуренной почве: оно увеличивается в окультуренных дерново-подзолистой и светло-каштановой почвах по сравнению с целинными, а в типичном черноземе и светлом сероземе — уменьшается. В каждом типе почвы имеется специфический спектр наиболее распространенных видов актиномадур, особенно это заметно в целинных почвах (табл. 6). В окультуренных почвах по сравнению с целинными изменяется соотношение различных видов актиномадур, и повышается удельный вес таких видов, которые редко встречаются в целинной почве данного типа, но играют не последнюю роль в микробном ценозе других типов почв. Различие видового состава актиномадур в различных целинных типах почв выражено более рельефно, чем в случае окультуренных почв.
Галатенко и др. (Галатенко и др., 1990) в ходе экспериментов был проанализирован спектр видов актиномадур, выделяемых из ряда почв: дерново-подзолистая — типичный чернозем - светло-каштановая — светлый серозем. Всего было выделено 25 видов актиномадур (часть из выделенных в этом эксперименте видов в последствии была переведена систематиками в роды Nonomuraea и Actinocorallia); из них Actinomadura pusilla {N. pusilla), A. recti-catena (N. recticatena), A. vinacea, A. turkmeniaca (N. turkmeniaca), A. roseola (N. roseola), A. fulvescens редко встречались в исследованных почвах. Вид A. spiralis (N. spiralis) наиболее распространен в этих почвах. Для большинства видов актиномадур была отмечена явная приуроченность к определенному типу почв. Так, A. helvata (N. helvata) чаще встречались в черноземах и дерново-подзолистых почвах, A. libanotica (Actinocorallia libanoticd) — в дерново-подзолистых. Вид A. rubra (N. rubra), наиболее распространенный в типичном черноземе, часто встречался в окультуренном светлом сероземе. Культуры А. spadbc, A. fastidiosa (N. fastidiosa), A. umbrina выделены только из светлого серозема, A. polychroma (N. polychroma) и A. carminata (N. roseoviolacea subsp. carminata) — главным образом из светло-каштановых почв, A. ferruginea (N.fer-ruginea) - из типичного чернозема, A. aurantiaca {Actinocorallia aurantiaca) — из чернозема и окультуренной дерново-подзолистой почвы.
По данным Галатенко и др. (Галатенко и др., 1990) актиномадуры-антагонисты составляли 33-88% в зависимости от типа почвы и ее окульту-ренности. В окультуренных почвах (дерново-подзолистой и светлом сероземе) их меньше, чем в целинных, при этом общая численность актиномадур в окультуренных почвах этих типов была выше. В окультуренных почвах (светло-каштановой и типичном черноземе) доля актиномадур-антагонистов также больше, чем в целинных, однако число всех актиномадур в целинных окультуренных почвах этих типов практически не различалось.
Методы селективного выделения и экологической оценки актиномадур
Процесс подбора селективного метода для выделения актиномадур можно разделить на два этапа: подбор селективной среды и подбор режимов предобработки высеваемого образца.
В качестве объекта исследования взят горизонт А1 чернозема обыкновенного, как наиболее традиционный субстрат при выделении актиномадур (Преображенская и др., 1978; Терехова и др., 1990; Галатенко и др., 1990).
В качестве сравниваемых сред использованы следующие: среда с про-пионатом натрия, Гаузе 1 и Гаузе 2. В них добавляли нистатин (50 мкг/мл) для подавления роста грибов, налидиксовую кислоту (1,5; 10 мкг/мл) для подавления роста немицелиальных бактерий, рубомицин (1 мкг/мл) или карми-номицин (1,5; 3; 5; 10 мкг/мл) для подавления роста колоний стрептомице-тов. Предпосевная обработка почвенных образцов включала тепловую предобработку их и фильтрование почвенных суспензий через стерильный ватный фильтр. Тепловая обработка заключалась либо в прогревании воздушно-сухих образцов при 120 С в течение 1 ч, либо в прогревании почвенных суспензий при 60С в течение 10 мин.
Первым этапом работы был подбор питательной среды, обеспечивающей ограничение роста грибов и немицелиальных бактерий на чашках с питательной средой при посеве почвенных суспензий. Из всех используемых питательных сред - среды Гаузе 1, Гаузе 2 и среды с пропионатом натрия - наиболее высокая доля (более 70 %) актиномицетов среди бактерий отмечена на среде Гаузе 1 с добавлением нистатина и налидиксовой кислоты (1,5 мкг/мл).
Таксономическая структура актиномицетных комплексов, выявляемых в черноземе на всех используемых средах, характеризовалась доминированием стрептомицетов. Доля этих мицелиальных прокариот в комплексе почвенных актиномицетов составляла более 80%. Наиболее широкий родовой спектр отмечен для комплекса, выявляемого на среде с пропионатом натрия и на среде Гаузе 1 без добавления рубомицина. Максимальная доля (8%) актиномадур выявлена в актиномицетном комплексе, вырастающем на среде Гаузе 2 с добавлением нистатина, налидиксовой кислоты (1,5 мкг/мл), рубомицина (рис.1).
Увеличение концентрации налидиксовой кислоты до 10 мкг/мл уменьшало количество немицелиальных бактерий, выделяющихся на среде с про пропионатом натрия. На других используемых средах доля актиномицетов среди бактерий не увеличивалась, а спектр выявляемых в актиномицетном комплексе родов снижался. Тем не менее, использование налидиксовой кислоты в концентрации 10 мкг/мл оказалось эффективным для выделения актиномадур, доля которых составляла 33% и была сопоставима с долей стреп-томицетов в актиномицетном комплексе, выявляемом на среде Гаузе 1 с добавлением рубомицина и нистатина (рис. 2).
Добавление в питательные среды Гаузе 1 и среду с пропионатом натрия антибиотика карминомицина оказалось эффективным приемом для увеличения численности и доли актиномадур в актиномицетном комплексе. В случае использования среды Гаузе 1 добавление карминомицина (3 и 10 мкг/мл) способствовало увеличению доли актиномадур в комплексе актиномицетов в 2 и 6 раз соответственно по сравнению с контролем и уменьшению доли стрептомицетов в 1,3 и 1,2 раза соответственно (рис. 3). В случае использования среды с пропионатом натрия добавление карминомицина оказалось менее эффективным средством, однако, и в этом случае доля актиномадур в комплексе актиномицетов увеличивалась при добавлении карминомицина (1,5; 5 и 10 мкг/мл) при одновременном уменьшении доли стрептомицетов.
Таким образом, согласно нашим исследованиям, для выделения актиномадур из чернозема следует рекомендовать использовать среду Гаузе 1 с добавлением комплекса антибиотиков следующего состава: нистатин (50 мкг/мл), нали-диксовая кислота (10 мкг/мл), рубомицин (1 мкг/мл). Менее эффективным по сравнению с комплексом перечисленных антибиотиков является добавление в среду Гаузе 1 нистатина (50мкг/мл), налидиксовой кислоты (10 мкг/мл) и карминомицина (10 мкг/мл).
При подборе режимов предобработки высеваемого почвенного образца наиболее благоприятные условия для выделения актиномицетов из исследуемых образцов складывались при посеве прогретых и отфильтрованных почвенных суспензий на среду с пропионатом натрия (доля актиномицетов от общего числа бактерий составила 85%). Использование для посева прогретых почвенных суспензий повлекло за собой увеличение численности и доли актиномадур, микромоноспор и других редких родов в комплексе актиномицетов, выявляемом на используемых средах, особенно на среде с пропионатом натрия. Сочетание фильтрования суспензий и их последующего прогре вания, значительно уменьшая долю стрептомицетов в комплексе, увеличило долю выявляемых актиномадур до 19% (рис.4).
Прогревание почвенных образцов при 120С 1 ч оказалось более эффективным по сравнению с приемом прогревания почвенных суспензий для выявления в комплексе актиномадур (24% от всех выявляемых родов актино-мицетов) и других редких родов (15% от всех выявляемых родов актиноми-цетов), снижая долю стрептомицетов (до 61%) в комплексе актиномицетов, вырастающих на среде Гаузе 1 (рис. 5).
Перечисленные селективные приемы увеличивают долю актиномадур, « выявляемых в почвенном актиномицетном комплексе и значительно снижают долю стрептомицетов. Численность актиномадур, обнаруженная в черно-земе без использования селективных приемов, не превышает 2x10 КОЕ/г почвы. При использовании селективных приемов для выделения актиномадур из чернозема количество актиномадур, выявляемых в почве, достигает 8х104 КОЕ/г почвы, т.е. численность актиномадур увеличивается в 1000 раз.
Наиболее перспективные комплексные методы выделения актиномадур приведены на рис. 6.
Для оценки доли актиномадур в почвенном актиномицетном комплексе следует использовать среду с пропионатом натрия с добавлением комплекса антибиотиков (рубомицин (1 мкг/мл) или карминомицин (5 мкг/мл), налидиксовая кислота (1,5 мкг/мл), нистатин (50 мкг/мл) без предобработки посевного материала. При использовании концентрации налидиксовой кислоты 10 мкг/мл необходимо проводить термическую обработку почвенной суспензии (60С Юмин), так как при этом достигается значительное увеличение доли выделяемых акти номадур (на 12% по сравнению с контролем) на фоне некоторого уменьшения числа стрептомицетов (на 18% по сравнению с контролем).
Распределение численности актиномадур по вертикально-ярусной структуре основных типов биогеоценозов
Численность представителей рода Actinomadura сравнивали с численностью актиномицетов рода Streptomyces и Micromonospora (как наиболее изученных родов), а также с рядом олигоспоровых актиномицетов (Saccharopolyspora, Nocardiopsis, Microtetraspora, Saccharomonospora, Microbispora и Thermomono-spora), обладающих, как и актиномадуры, малым числом спор в цепочках (до 20), превышающих по диаметру размер гиф.
Численность актиномадур в исследованных биогеоценозах колебалась в пределах от десятков (минеральные горизонты почв) до сотен тысяч (разрастания зеленого мха и горизонты подстилки) КОЕ/г, в зависимости от места субстрата в пространственно-сукцессионном ряду и типа биогеоценоза, что сопоставимо с численностью стрептомицетов и микромоноспор. В травяном и древесном ярусах изученных экосистем актиномадуры не были обнаружены. В почвенном ярусе они не были выделены из элювиальных горизонтов.
Лесные биогеоценозы
В ельнике-черничнике на дерново-грунтово-глееватой почве максимальная численность актиномицетов приурочена к F слою подстилки; в L слое их численность несколько ниже, а при переходе к кустарничковому и моховому ярусам и горизонту А1 почвы количество выделенных актиномицетов резко снижалось (рис. 7).
Наиболее широкий спектр родов актиномицетов выявлен в моховом ярусе - роды Streptomyces, Actinomadura, Saccharopolyspora и Thermomono-spora, в то время как из почвенного горизонта выделены представители лишь двух родов - Streptomyces и Actinomadura.
Представители рода Actinomadura обнаружены во всех ярусах хвойного леса, кроме кустарничкового (черника). Их наибольшая численность приурочена к наземному ярусу: в F слое лесной подстилки актиномадуры составляют 660 тыс. КОЕ/г, относительно велика их численность и в ярусе зеленых мхов -260 тыс.КОЕ/г субстрата, в то время как в L и А1 горизонтах значения этого показателя не поднимались выше 13 тыс. КОЕ/г, что на 1-2 порядка ниже численности стрептомицетов (рис. 7). Численность актиномадур в F слое подстилки сопоставима с численностью микромоноспор и олигоспоровых актиномицетов, а в разрастаниях мха даже с численностью стрептомицетов.
В ельнике сложном на бурой лесной кислой грубогумусной почве наибольшая численность актиномицетов, как и наибольшее их родовое разнообразие, отмечены для F-слоя подстилки; в древесном, моховом и почвенном ярусах отмечена более низкая численность актиномицетов (рис. 7).
Из группы олигоспоровых актиномицетов выделены представители рода Saccharopolyspora.
Актиномадура была выделена только из F слоя лесной подстилки, где ее численность составила десятки тысяч КОЕ/г субстрата.
В ельнике-черничнике на оторфованной подзолистой профильно-оглееной почве наибольшее количество актиномицетов отмечено для мохового яруса (мох - сфагнум). Здесь актиномицеты представлены только стреп-томицетами. При переходе к почвенным горизонтам численность актиномицетов заметно падает (рис. 8).
Из горизонта Т2 выделен наиболее широкий спектр родов: стрептомице-ты, микромоноспоры, актиномадуры, сахарополиспоры и нокардии, стреп-тоспорангиумы.
Актиномадуры обнаружены только в почвенных горизонтах. Численность актиномадур в ТІ горизонте почвы составила десятки тысяч КОЕ/г почвы, а в Т2 горизонте - сотни КОЕ/г почвы.
В экосистеме широколиственного леса актиномадуры сосредоточены в почвенном ярусе (рис. 8). Максимальная численность актиномадур приурочена ко второму гумусовому горизонту Ah, здесь же отмечено наибольшее разнообразие актиномицетных родов {Streptomyces, Micromonospora, Strepto-sporangium, Saccharopolyspora, Saccharomonospora, Nocardiopsis, Nocardia, Microtetraspora).
Актиномадуры не были выделены из элювиального горизонта, в минеральных горизонтах почв их численность была минимальна.
Таким образом, в исследованных лесных биогеоценозах максимальная численность актиномадур приурочена к напочвенному ярусу (моховым разрастани ям) и органогенным горизонтам почв (подстилке (слою F), торфяным горизонтам) (рис. 9). В разрастаниях мха количество представителей этого рода превышает численность других олигоспоровых актиномицетов на порядок.
Луговые биогеоценозы
Актиномадуры здесь сосредоточены на корнях и вокруг корней растений, на ветоши и в верхних горизонтах почвы; на живых растениях актиномадуры обнаружены не были (рис. 10). Относительный максимум численности актиномадур был отмечен для очеса и корней растений, численность актиномадур была минимальная в минеральных горизонтах почв.
Степной биогеоценоз
В степном биогеоценозе численность актиномицетов достаточно велика во всех ярусах биогеоценоза, она распределена равномерно по всем ярусам (рис. 11).
Наиболее широкий родовой спектр актиномицетов отмечен в горизонте Ad, А1, В1, откуда были выделены представители родов Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura, Nocardiopsis, Saccharopolyspora, Microbispora, Streptosporangium.
Актиномадуры были выделены из всех горизонтов почвенного яруса, кроме горизонта Вса, причем значения их численности мало варьировали, не превышая тысяч КОЕ/г почвы.
Полупустынный биогеоценоз
В полупустынном биогеоценозе наибольшая численность актиномицетов отмечена в надземном и наземном ярусах; при переходе к почвенной толще количество обнаруживаемых актиномицетов уменьшается на порядок (рис. 11).
Наибольший спектр актиномицетных родов обнаружен в Alca горизонте почвы (представители родов: Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura, Saccharopolyspora, Thermomonospora, Microbispora, Streptosporangium).
Актиномадуры были выделены из всех почвенных горизонтов, однако их численность не превышала значения тысяч КОЕ/г почвы.
Определение радиальной скорости роста актиномадур
Закономерности динамики численности актиномицетных популяций в ходе инициированных сукцессии, как следует из теории (Кожевин, 1989), могут определяться показателем темпа размножения, в качестве которого для актиномицетов может использоваться радиальная скорость роста колоний на плотной питательной среде. Радиальная скорость является количественным критерием определения сукцессиоиных этапов.
Как правило, виды, выделяющиеся из почвы в течение сукцессии в большем количестве, по сравнению с другими видами, имеют и более высокую скорость роста на плотных питательных средах.
Если считать, что радиальная скорость роста в первом приближении пропорциональна удельной скорости размножения (Перт, 1978), то при прочих равных условиях (весь комплекс действующих в течение сукцессии экологических параметров) объекты с быстрой скоростью размножения должны иметь и более высокие значения Кг как указание на относительную г-стратегию. Таким образом, можно ожидать, что на первых этапах сукцессии преимущество получит мицелии быстрорастущих видов стрептомицетов (Кожевин, 1989; Кочкина, 1981).
При исследовании скорости роста колеи пій актиномадур и стрептомицетов были получены данные, которые подтверждают информацию, полученную при исследовании прорастания спор актиномицетов этих родов в почве, то есть тот факт, что споры актиномадур прорастают в большем количестве и быстрее, чем стрептомицетньте споры, по развитие мицелия у них тормозится на ранней стадии, в то время как стрептоминеты очень быстро развиваются и формируют мицелий (рис. 26).
Замеры скорости роста показали, что кинетика роста стрептомицетов и актиномадур различна: стрептомицеты растут по линейному закону, в то время как для актиномадур скорее всего характерен нелинейный закон роста, свойственный бактериальным колониям, однако для подтверждения этого заключения необходимы более детальные исследования этого вопроса.
Если для стрептомицетов можно просчитать скорость роста колоний по линейному закону, она составила 50 мк.\!Лі ;іля Streptomyces xanthochromoge-nus, но для актиномадур {Actinomadura cncrnlea) такой показатель вычислять некорректно, можно лишь говориті. об изменении скорости роста на разных этапах роста колонии, так в момент интенсивного роста колонии скорость роста составляет порядка 50 мкм/ч, тогда как- па этапах лаг-фазы и затухания развития колонии (это временные промежутки 0-48 часов и 96-400 часов с начала эксперимента) она составляет около 5 мкм/ч.
Таким образом, если стрептомипетм являются относительными г-стратегами, то актиномадуры можно пазі тп. относительными К-стратегами.
При первичном микроскопировании колоний актиномицетов, выделенных из почвы на плотных средах Гаузе 1, Гаузе 2 и среде с пропионатом натрия, все идентичные штаммы были сгруппированы в морфологические типы на основании культуральных признаков и особенностей морфологии, выделенные затем в чистую культуру. Дальнейшее изучение культуральных, морфологических, хемотаксономических и физиологических характеристик проводилось на питательных средах, подобранных для каждой группы актиномицетов. Группу актиномадур отличали от стрептомицетов, микромоноспор, стрептоспорангиумов (см. гл. 2, п. 2.2), а также от представителей редких родов актиномицетов - Microbispora, Microtetraspora, Saccharopolyspora, Ther-momonospora. Актиномадуры содержали ліезо-ДАПк и мадурозу в гидроли-затах целых клеток. По морфологии они схожи со стрептомицетами - наличие цепочек спор (до 20), формирующих спирали в 1-2 (иногда 4) оборота или крючки и псевдоспорангии. От стрептомицетов их отличает разница в диаметре спор и спороносящих гиф (диаметр спор больше диаметра гиф), в то время как у стрептомицетов диаметры спор и гиф не отличаются.
Предварительная идентификация выделенных культур актиномадур до вида проводилась на основании ключа для определения актиномадур (Ргео-brazhenskaya et al., 1977; Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 1989; The Procaryotes, 1991) и идентификационных таблиц Bergey s Manual of Determinative Bacteriology (1994).
