Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 6
2.1 Микробная биомасса почв и методы ее определения 6
2.1.1 Методы определения микробной биомассы в почве ..6
2.1.2 Субстрат-индуцированное дыхание микроорганизмов в почве 12
2.1.3 Сравнение величин микробной биомассы, полученных разными методами 14
2.2 Оценка вклада бактерий и грибов в микробную биомассу , 25
2.2.1 Применение антибиотиков для разделения вклада бактерий и грибов в микробную биомассу почвы 25
2.2.2 Содержание бактерий и грибов в разных почвах 28
2.3 Профильное распределение и запасы микробной биомассы в почвах 35
3. Объекты и методы 43
3.1 Почвы 43
3.2 Методы 46
3.2.1 Микробиологические . 46
3.2.2 Физико-химические 49
3.2.3 Статистическая обработка результатов 49
4. Результаты и обсуждение 54
4.1 Сравнительная оценка микробной биомассы почвы, определяемой методами субстрат-индуцированного дыхания и прямого микроскопирования 54
4.1.1 Особенности определения СИД почвы 54
4.1.2 Сравнение величин микробной биомассы, полученных разными методами 55
4.2 Изменение микробной активности по профилю серой лесной почвы и чернозема 66
4.3 Разделение грибного и бактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков почвах разных экосистем 80
4.3.1 Оптимизация процедуры разделения грибного и бактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков 81
4.3.2 Соотношение грибов и бактерий в биомассе разных типов почв, определяемое селективным ингибированием 91
4.4 Активная микробная биомасса (субстрат-индуцированное дыхание) разных типов почв 101
4.5 Взаимосвязь микробиологических параметров с физико-химическими и био климатически ми характеристиками почвы 119
5. Заключение 126
6. Выводы 128
7. Литература 130
- Микробная биомасса почв и методы ее определения
- Сравнение величин микробной биомассы, полученных разными методами
- Сравнительная оценка микробной биомассы почвы, определяемой методами субстрат-индуцированного дыхания и прямого микроскопирования
- Разделение грибного и бактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков почвах разных экосистем
Микробная биомасса почв и методы ее определения
Методы количественной оценки микробной биомассы в почвах можно разделить на две группы: I) прямые микроскопические методы, введенные в практику исследований Виноградским еще в 1925 г. и усовершенствованные, главным образом, по линии поиска более эффективных приемов окраски бактериальных клеток и грибного мицелия; 2) сравнительно недавно разработанные биохимические методы, основанные на определении активности метаболизма микроорганизмов или содержания в почве химических соединений, входящих в состав микробной биомассы.
Несомненным преимуществом прямого микроскопирования является возможность дифференцировать клетки различных групп микроорганизмов. Однако значительные недостатки этого метода заключаются в ненадежности дифференциации клеток на живые и мертвые, ошибочном учете почвенных частиц как микроорганизмов, условности выбора коэффициентов пересчета от числа клеток к биомассе и зависимости получаемых результатов от индивидуального мастерства исполнителя, что и определяет относительную условность микроскопических данных о биомассе почвенных микроорганизмов (Domsch et al., 1979; Мирчинк, Паников, 1985; Brookes et al„ 1986; Scheu, Parkinson, 1994).
Наибольшую популярность из новых приемов определения почвенной микробиологической биомассы завоевали методы, которые можно назвать биохимическими, поскольку их разработка связана с успехами в химии органического вещества почвы, структурной и функциональной химии микробной клетки, а также биохимии и кинетики роста микробных популяций. Биохимические методы потенциально способны давать не относительные, а абсолютные величины микробной биомассы. Применение этих методов позволяет почти полностью исключить влияние таких интерферирующих факторов, как адсорбция клеток, их экранирование почвенными частицами и гибель микроорганизмов при диспергировании почвы. К тому же результаты таких химических определений остаются объективными и не зависят от авторитета конкретного исследователя и научной школы, которую он представляет. Это открывает возможность непредвзятого сопоставления результатов, полученных в разных лабораториях, и способствует более активному обобщению литературных данных. Важное преимущество биохимических методов заключается еще и в том, что они лучше воспроизводимы и менее утомительны. Путем совершенствования техники определения, в частности, при создании автоматических анализаторов, их производительность может увеличиваться существенно.
Тем не менее, и биохимические методы имеют свои недостатки, связанные главным образом с тем, что определение предполагает измерение содержания в почве не собственно биомассы микроорганизмов, а какой-то ее части - одного индивидуального соединения (АТФ, ДНК, мурамовой или диаминопимелиновой кислот), суммы лепсоминерализуемых (в фумигационном методе) или функционально активных (в физиологическом методе) клеточных компонентов. Связь перечисленных показателей с биомассой, выраженной в весовых единицах, далеко не всегда однозначна и меняется не только у разных микроорганизмов, но и в зависимости от условий их роста. Кроме того, определению могут мешать другие почвенные организмы (корни растений, микро- и мезофауна), а также почвенный детрит, содержащий в некотором количестве те же индивидуальные соединения, что и живая микробная биомасса.
Аденозинтрифосфат. Применительно к анализу почвы основную методическую трудность представляет извлечение из нее АТФ. Наиболее совершенный способ, разработанный лишь относительно недавно, предусматривает обработку почвы ультразвуком и экстракцию АТФ смесью 0,5М трихлоруксусной кислоты, 0,25М Na2HP04 и 0,1М хлорида параквата (Jenkinson, Oades, 1979). Однако и этот прием позволяет извлечь АТФ из почвы на 45 - 84% от возможного. Следует отметить, что пределы колебаний содержания АТФ микроорганизмов, представленных 150-ю видами, составляли 1,4 - 16 мкмоль / г биомассы, однако для большинства изученных культур (более 90%) диапазон содержания АТФ уже (2-6 мкмоль / г биомассы). Показано также, что микробная биомасса, в среднем, содержит 0,4% АТФ от клеточного углерода, что соответствует величине соотношения С : АТФ=250 (Karl, 1980). Внутриклеточное содержание АТФ зависит от условий роста микроорганизмов и является очень чувствительным показателем состояния микробного сообщества почвы, реагирующим на внесение легкодоступных соединений, ингибиторов роста и метаболизма, изменения температуры и влажности почвы (Nannipieri et al., 1978). Необходимо учитывать также, что АТФ содержится не только в микроорганизмах, но и в микрофауне и высших растениях. Следует отметить, что ценность анализа АТФ заключается в том, что при одновременном измерении биомассы другими методами он дает емкую дополнительную информацию о физиологическом состоянии микробных популяций.
Дезоксирибонуклеиновая кислота. Химический анализ ДНК в почве как метод определения микробной биомассы имеет то несомненное преимущество, что внутриклеточное содержание этих соединений характеризуется абсолютным постоянством в расчете на нуклеоид прокариотной клетки или ядро одной степени плоидности у эукариотных микроорганизмов независимо от условий роста. Отмечено, что в расчете на единицу биомассы содержание ДНК может изменяться (Работнова, Помозгова, 1979). Однако, эти изменения не столь велики, как в случае АТФ, и представляются вполне предсказуемыми и закономерными: внутриклеточное содержание ДНК тем больше, чем, больше доля функционально активных клеточных компонентов. Поэтому содержание ДНК может быть мерой обогащенности почвы микроорганизмами (Благодатская и др., 2003). Однако скорость распада экзогенных нуклеиновых кислот намного ниже скорости превращений АТФ. Это приводит к накоплению в почве внеклеточной ДНК, доля которой в разных почвах составляет 30-70% от суммарной (Паников, 1976). Очевидно, что использование анализа ДНК для оценки микробной биомассы без знания доли внеклеточной ДНК лишено смысла. Дифференциация внутри- и внеклеточной ДНК может быть достигнуто на этапе выделения из почвы разных фракций органических веществ, поскольку внеклеточная ДНК существенно отличается от нативной (внутриклеточной) по своим свойствам (имеет меньшую молекулярную массу, частично апуринизована и дефосфорилирована). Очевидно, что для экологических исследований представляет интерес изучение скоростей образования ДНК и РНК in situ, которые связаны с синтезом микробной биомассы
Сравнение величин микробной биомассы, полученных разными методами
Для оценки микробной биомассы, содержащейся в единице веса или профиля почвы, используются преимущественно методы прямой микроскопии. Поэтому и основные закономерности распределения запасов микроорганизмов в различных почвах, в том числе и в градиенте биоклиматических условий, были получены с использованием разных модификаций прямого микроскопического учета клеток микроорганизмов. Исследования микробной биомассы почв были направлены в основном на получении сведений о ее двух важных компонентах: грибах и бактериях.
Показано, что наибольшие запасы грибной биомассы (около 400 г/м ), включающей мицелий и споры, были в подзолистых и дерново-подзолистых почвах под хвойными лесами, а также в серых лесных почвах зоны широколиственных лесов (Мирчинк, Степанова, 1982; Демкина, Мирчинк, 1983 б). В почвах южнее таежной и зоны широколиственных лесов содержание грибной биомассы уменьшалось до 80 - 160 г/м (Богоев, Гильманов, 1982). Тундровые почвы содержали около 100 г/м грибной биомассы, т.е. примерно столько же, сколько мощный чернозем, имеющий значительно большую глубину почвенного профиля по сравнению с северными почвами (Демкина, Мирчинк, 1983 б). При этом отмечено, что биомасса грибов тундровых почв в верхнем наиболее деятельном горизонте представлена в основном вегетативным мицелием (83%), доля которого велика и в дерново-подзолистой почве (до 70%). Следует отметить также, что в черноземе основная масса грибов представлена их спорами (78% и более). Высокое содержание спор отмечено в красноземах (Лимарь и др., 1975).
Наибольшая биомасса почвенных бактерий (40 - 100 г/м2) была отмечена в черноземных почвах лесостепной зоны (Богоев, Гильманов, 1982). В почвах северных и южных зон бактериальная масса заметно снижалась по сравнению с умеренными широтами, достигая наименьших значений (5 г/м") в песчаной пустынной почве (Богоев, Гильманов, 1982). Уменьшение величин биомассы бактерий в северных почвах было не столь значительно. Так, в почве корки пятна пятнистой тундры среднемесячные запасы оказались довольно большими - 41,8 г/м2 (Parinkina, 1974). Необходимо отметить, что в отдельные временные периоды количество бактерий в почве пятнистой тундры достигало 30-40 млрд. клеток / г, что составило примерно 6-10 мг сухого вещества на 1 г почвы, и эта величина превышала таковой показатель в черноземе. В другом исследовании показано, что биомасса грибов и бактерий в этой почве достигала 455 и 20 мкг С/г почвы соответственно (Schmidt, Bolter, 2002). Этими авторами показано, что в тундровой почве Таймыра низкая величина бактериальной биомассы обусловлена очень малыми объемами бактериальных клеток (0,04 - 0,05 мкм3).
Прямое микроскопическое исследование образцов бело-подзолистой почвы и бурозема (Центральный лесной государственный биосферный заповедник, Тверская область) выявило общие запасы микробной биомассы, которые составили 60,0 и 30,4 тонн / га для этих почв соответственно (Головченко, Полянская, 1996). Показано что микробная биомасса минеральных горизонтов этих почв составляла 65-90% от общих запасов биомассы во всем профиле в зависимости от сезона года. Выявлено также, что в микробном сообществе почв заповедника доминировали грибы, а доля прокариотных микроорганизмов в общей биомассе не превышала 2,5%.
В дерново-подзолистой почве под многолетними травами (Костромская область) сухая микробная биомасса составляла от 0,63 до 0,94 т / га в различные годы исследования (Матаруева, 1998).
Сравнение величин биомассы лесных почв и их пахотных аналогов выявило существенные различия. Так в дерново-подзолистой почве лесного ценоза (Мещерская низменность, Владимирская область) биомасса грибов составила 19,5 т / га, а в пахотной почве - 6,5 т / га (Полянская и др., 1997). Причем микробная биомасса лесной почвы существенно снижалась по профилю, а в пашне ее распределение по горизонтам было более равномерным. Показано также, что в структуре микробной биомассы дерново-подзолистой почвы доминировали грибы, причем в почве леса преобладал мицелий грибов, а в пахотной - их споры.
В другой работе выявлено, что микробная биомасса в дерново-подзолистой и серой лесной почвах естественных и пахотных ценозов, определенная по прямому микроскопированию, составляла от 1,9 до 6,7 и от 1,8 до 4,8 т/га соответственно (Свешникова и др., 2001). Наибольшие величины микробной биомассы отмечены авторами на лесных, болотных и лугово-болотных участках. Показано также, что доля прокариот в исследованных почвах колебалась от 7 до 25%, возрастая в окультуренных почвах.
В коричневой типичной и черно-коричневой почвах юго-западного Тянь-Шаня микробная биомасса, определенная методом люминесцентной микроскопии, составляла 22,7 и 6,4 т/га соответственно, и была представлена преимущественно мицелием и спорами грибов (Полянская и др., 1995 д). Показано также, что в черно-коричневой почве субстрат-индуцированное дыхание составляло 223, а в коричневой выщелоченной - 181 кг С-СО2 / (профиль » час). Активность типичной и карбонатной почв различалась слабо и составляла около 80-100 кг С-СО2 / (профиль час).
Сравнительная оценка микробной биомассы почвы, определяемой методами субстрат-индуцированного дыхания и прямого микроскопирования
Метод субстрат-индуцированного дыхания применяют для определения суммарной (в основном грибы + бактерии) микробной биомассы почв с широким диапазоном содержания органического вещества и значений рН (Schnurer et al., 1985; Sparling, 1992; Alphei et al,, 1995; Anderson, Joergensen, 1997; Blagodatskaya, Anderson, 1998; Bailey et al., 2002; Baath, Anderson, 2003). В нашей работе были исследованы почвы из разных климатических областей. Поэтому были проведены эксперименты по определению величин микробной биомассы почвы (МБ), предварительно инкубированной при температурах 10 и 22С. Оказалось, что величина МБ тундровой (Ненецкий АО, Воркутинская обл.) и серой лесной почв, измеренная методом СИД достоверно не зависела от температуры предынкубации образца (табл. 6).
Важное значение для определения МБ методом СИД имеет концентрация вносимого источника энергии и углерода - глюкозы. Показано, что ее концентрация должна быть достаточной, чтобы, с одной стороны, не лимитировать дыхательный отклик всех почвенных микроорганизмов, а с другой не вызывать токсический или ингибируїощий эффект (Anderson, Domsch, 1978, West, Sparling, 1986; Ананьева и др., 1993). Нашими экспериментами показано, что оптимальная концентрация глюкозы для получения наибольшего субстрат-индуцированного дыхательного составила 10 мг / г почвы, Концентрации глюкозы больше или меньше 10 мг / г почвы приводили к недооценке микробной биомассы (табл.7).
Таким образом, в исследуемом наборе образцов почв из разных климатических зон Европейской части для определения микробной биомассы показана целесообразность использования глюкозы в концентрации, равной 10 мг/г почвы, и температуры предынкубации образца, равной 22С.
Методы количественной оценки микробной биомассы в почвах можно разделить на две группы: 1) прямые микроскопические методы 2) косвенные, среди которых наиболее распространенным является метод субстрат-индуцированного дыхания.
Несомненным преимуществом прямого ми крое копирования является возможность дифференцировать клетки различных групп микроорганизмов и учитывать споры грибов. Достоинством метода субстрат-индуцированного дыхания является то, что он прост в исполнении, оперативен, дает хорошо воспроизводимые результаты с относительной ошибкой не более 5% и учитывает, с очевидностью, только активные клетки микробной биомассы. Тем не менее, оба метода имеют свои ограничения и недостатки. Поэтому исследователи давно уделяют внимание вопросу сопоставимости результатов оценки микробной биомассы разными, в том числе и этими двумя методами (СИД и прямое микроскопирование).
В ряде работ отмечена тесная положительная корреляция между оценками биомассы методами СИД и прямого микроскопировання (West et al., 1986; West, Sparling, 1986; Lin, Brookes, 1999 б). Показано также, что величины отношения грибов и бактерий на растительных остатках, определяемых селективным ингибированием СИД и прямым микроскопированием, были примерно одинаковы (Neely et al., 1991). Сходная оценка величин микробной биомассы и соотношения грибов и бактерии в почвах по прямому микроскопированию и СИД показана в работе Lin, Brookes (1999 б).
Однако в ряде исследований было констатировано, что биомасса, определяемая СИД (Scheu, Parkinson, 1994) или фумигационным (Schnurer et al., 1985; Ingham, Horton, 1987) методами, была больше на 25%, 50% и в 2,5-14,7 раза соответственно, чем прямым микроскопированием. Другие авторы сообщали, что биохимические методы (СИД, фумигация) недооценивали микробную биомассу (на 23-19%) по сравнению с прямым микроскопированием (Domsch et al., 1979; Brookes et al., 1986).
Задачи нашего исследования были сфокусированы на определении микробной биомассы: а) прямым микроскопированием и СИД методами в разных типах почв, представленных разными экосистемами; б) в двух верхних слоях (0-5 и 5-10 см) почвы; и в) корреляционной связи между величинами микробной биомассы, определяемой разными методами, а также между микробной биомассой и другими физико-химическими характеристиками почвы.
Разделение грибного и бактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков почвах разных экосистем
Бактерии и грибы - две различные группы почвенной микрофлоры, которые занимают различные экологические ниши и потому по-разному влияют на круговорот питательных веществ (Nakas, Klein, 1980; West, 1986; Beare et al., 1990). Соотношение бактерий и грибов зависит от типа почвы и ее свойств, типа экосистемы и ее нарушенности. Отношение грибы : бактерии может быть индикатором возвращения экосистемы к «природному» естественному состоянию (Полянская и др., 1997; Bardgett, McAlister, 1999), присутствия поллютантов в почве, например S02 (Bewley, Parkinson, 1985), интенсивности использования лугов (Bardgett et al., 1996) и изменения рН почвы (Anderson, Baath, 2003). Существуют различные методы определения доли грибов и бактерий в почве: 1) подсчет на агаризованных средах; 2) прямая микроскопия; 3) определение содержания специфических клеточных компонентов в почве (дезокси-рибонуклеиновая кислота, диамшюпимелиновая кислота, хитин, аденозин-три осфор.ная„кислота, эргостерол и жирные кислоты) и 4) физиологические подходы. Подсчет колоний на чашках учитывает только небольшую часть (обычно 0,01-1%) общей микробной биомассы. Специфические компоненты клеток (грибных и бактериальных) могут находиться и вне клеток. Прямое микроскопирование позволяет в известной степени дифференцировать бактерии и мицелий грибов, но не позволяет определить их активность. Метод селективного ингибирования (СИ) позволяет снять многие из этих ограничений (Anderson, Domsch, 1973; 1975). Метод основан на угнетении субстрат-индуцир ованного дыхания (СИД) грибов или бактерий под действием антибиотиков, избирательно действующих на эти две группы микроорганизмов. В настоящее время наиболее часто используют антибиотики: бактерицид - стрептомицин, и фунгицид -циклогексимид, которые угнетают белковый синтез бактериальных (70S) и грибных (80S) рибосом соответственно (Jacobi, Gorin, 1967). Метод СИ удобен для оценки соотношения грибов и бактерий в почвенном микробном сообществе. Сложность применения этого метода заключается в строгом соблюдении условий (синергетический эффект бактерицида и фунгицида не должен превышать 5%) для достоверного расчета отношения грибы : бактерии в каждой почве (Anderson, Domsch, 1975; Lin, Brookes, 1999 b; Bailey et al., 2003; Сусьян и др., 2005). Однако, сведений о структуре микробного сообщества различных типов почв, в том числе и с контрастными свойствами (Сорг, рН, растительность) крайне мало.
Цель нашего исследования - оценить вклад грибов и бактерий в субстрат индуцированное дыхание (СИД) разных типов почв методом селективного ингибирования. Задачи исследования были направлены на: 1) оптимизацию процедуры разделения вклада грибов и бактерий в СИД почвы; 2) определение структуры микробного сообщества разных типов почв и при разном землепользовании; и 3) определение соотношения грибы : бактерии в разных слоях почвы.
Концентрации ингибиторов. На рис. S показано уменьшение субстрат-индуцированного дыхания (СИД) серой лесной почвы (лес и пашня) под действием различных концентраций стрептомицина (А) и циклогексимида (Б). Для пахотной почвы использовали ряд концентраций стрептомицина от 10 до 40, а для лесной -от 10 до 60 мг/г. Устойчивое подавление СИД отмечено с 10 мг стрептомицина на 1 г пахотной, и с 20 мг/г - лесной почвы. Наибольшее подавление дыхания под влиянием циклогексимида в почве этих экосистем было отмечено при 30 мг циклогексимида на грамм лесной почвы и при 20 мг/г - пахотной.
Изменение СИД под влиянием различных концентраций стрептомицина в каштановой почве трех экосистем приведено на рисунке 10. Устойчивое подавление дыхания начиналось с концентрации стрептомицина, равной 5 (пашня) и 10 (залежь, лесополоса) мг/г почвы. Высокие концентрации антибиотика (20-30 мг/г почвы) приводили к возрастанию выделения СОг, что можно объяснить потреблением стрептомицина нецелевыми микроорганизмами (Bewley, Parkinson, 1985; Badalucco et al., 1994). Наибольшее подавление СИД под действием циклогексимида в каштановой почве лесополосы и пашни отмечено при 15 мг/г (49 и 59% угнетения соответственно), Циклогексимид в меньших концентрациях угнетал 4 и 44% на пашне, и 28 и 35% в лесополосе (для 5 и 10 мг/г соответственно).
Таким образом, в пахотных почвах (невысокая микробная биомасса, МБ) ингибирующее действие стрептомицина достигалось, в целом, при его меньших концентрациях, а в почвах естественных экосистем (высокая МБ) для достижения этого эффекта - необходимо его повышенное содержание. Для циклогексимида такая зависимость четко не выражена.
Время предынкубации почвы с антибиотиком. Раствор стрептомицина вносили в почву за 0,5 и 1,0 час до внесения глюкозы. Оказалось, что увеличение времени предынкубации почвы (до 1 часа) не способствовало, в целом, большему ингибированию СИД по сравнению с 0,5 часа (табл. 16). Поэтому в дальнейших экспериментах стрептомицин вносили за 30 мин до внесения глюкозы.
