Введение к работе
Актуальность проблемы. Такие биополимеры как хитин и пектин являются распространенными полисахаридами в природе и постоянно присутствуют в почве (De Boer W., 2004). Хитин представляет собой азотсодержащий полимер ІЧ-ацетил-О-глюкозамина, выступает неотъемлемым компонентом клеточных стенок микромицетов, экзоскелета беспозвоночных животных. Пектин -безазотистый полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, является структурным компонентом клеточных стенок высших растений, придающий прочность растительным тканям. Оба биополимера представляют собой существенный источник углерода и азота для почвенных микроорганизмов, а их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Gooday, 1990; Kang et al, 2005).
Жизнедеятельность гидролитических микробных сообществ в существенной степени определяет уровень плодородия почв, включая снабжение растений доступными питательными ресурсами, формирование почвенной структуры и способность к подавлению нежелательных фитопатогенных популяций (Downing & Thomson, 2000; Kobayashi et al., 2002). Масштабы микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) отличаются в биогеоценозах разных биоклиматических зон, однако в научной литературе информация о структуре и особенностях формирования микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов (в частности, температуры) практически отсутствует. С одной стороны, важна роль психрофильных и психротрофных микроорганизмов в процессах деструкции биополимеров, особенно в зонах холодного и умеренного климата. С другой стороны, известная приуроченность максимальной активности большинства хитинолитических и пектинолитических ферментов микроорганизмов к температуре 40-55С (Kashyap, 2001; Dahia, 2006) делает интересным вопрос о деструкции полисахаридов почвенным микробным комплексом при повышенных температурах, с целью оценки потенциальной
гидролитической активности микробного сообщества почв и поиска
продуцентов гидролитических ферментов.
Целью диссертационной работы явилось исследование особенностей
комплекса микроорганизмов, осуществляющих деструкцию полисахаридов
(хитина и пектина) в почвах при различных температурах (5, 27, 50С).
В задачи исследования входило:
Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов почв с добавлением субстрата (хитина и пектина) и без него, инкубируемых при разных температурах.
Изучение динамики численности и биомассы эукариотных и прокариотных микроорганизмов, развивающихся в исследуемых микрокосмах при различных температурах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением полисахаридов.
Оценка разнообразия и численности отдельных филогенетических групп прокариотных микроорганизмов гидролитиков в почвах при различных температурах.
Детекция хитиназного гена при различных температурах в исследуемых почвах и чистых культурах хитинолитиков.
Выявление наиболее активной группы микроорганизмов, участвующих в разложении хитина и пектина в почве при разных температурах. Выделение доминантов гидролитичеких сообществ почв, определение их видового разнообразия и активности разложения ими полисахаридов.
Научная новизна. Впервые в экспериментах с микрокосмами проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур.
Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов микробным сообществом вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов - мицелиальных и одноклеточных прокариот. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.
Впервые с использованием метода FISH (флюоресцентная гибридизация
in situ) оценена численность и выявлен филогенетический состав
метаболически активного бактериального гидролитического
(хитинолитического и пектинолитического) комплекса в гумусовых горизонтах серой лесной, глее-слабоподзолистой, бурой пустынно-степной почв и чернозема в зависимости от температуры. Установлено, что при всех исследуемых температурах среди возможных агентов деструкции полисахаридов их разложение осуществляется представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. При понижении температуры в почвенном гидролитическом бактериальном комплексе особенно возрастает численность метаболически активных форм Firmicutes и Betaproteobacteria. С ростом температуры на порядок увеличивается биомасса мицелиальных представителей группы Actinobacteria, а также возрастает роль Gammaproteobacteria.
С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).
Практическая значимость. Выделены штаммы микроорганизмов, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа. Полученные штаммы могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогенами.
Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение при разработке биотехнологического процесса получения хитинолитических и пектинолитических ферментов.
Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур,
и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов.
Знание закономерностей микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями и раскрыть экологическую роль микроорганизмов в углеродных и азотных циклах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на XIII и XIV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007 и Ломоносов-2006, на XIV Докучаевских молодежных чтениях - 2011 в Санкт-Петебургском государственном университете, на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ и в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, Германия).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи, трое тезисов докладов.
Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы и заключение. Материалы диссертации изложены на .... страницах машинописного текста, содержат .... рисунков, ... .таблиц. Список литературы включает ... источников, из них .... зарубежные.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность своим научным руководителям д.б.н., проф. Д.Г. Звягинцеву и к.б.н. Н.А. Манучаровой за постоянную помощь и поддержку, повседневное внимание к работе, ценные советы и консультации. Автор особенно благодарен д.б.н. П.А. Кожевину за помощь в проведении многомерной математической статистики и математического планирования эксперимента, И.К. Кравченко и А.К. Кизиловой за помощь в постановке ДГГЭ и ценные практические советы. Автор искренне благодарит А.Л. Степанова, Г.М. Зенову, Т.Г. Добровольскую, Т.П. Турову за ценные рекомендации и помощь в работе, а также весь коллектив кафедры биологии почв МГУ.
