Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Фукоиданы 7
2.1.1. Распространение 7
2.1.2. Структура 7
2.1.3. Функции, выполняемые фукоиданами в бурых водорослях и иглокожих
2.1.4. Биологическая активность фукоиданов
2.2. Фукоиданазы 13
2.2.1. Номенклатура. Известные представители 13
2.2.2. Физико-химические свойства фукоиданаз 13
2.2.3. Тип действия и специфичность фукоиданаз 17
2.2.4. Условия культивирования морских бактерий, синтезирующих фукоиданазу 20
2.3. Альгиновые кислоты 23
2.3.1. Распространение 23
2.3.2. Структура 23
2.3.3. Биологическая активность альгиновых кислот 25
2.3.4. Применение альгиновых кислот и их солей 26
2.4. Альгинат-лиазы 26
2.4.1. Распространение. Номенклатура 26
2.4.2. Свойства и специфичность альгинат-лиаз моллюсков и водорослей 27
2.4.3. Альгинат-лиазы морских бактерий 28
2.4.4. Альгинат-лиазы почвенных бактерий 29
2.4.5. Альгинат-лиазы морских грибов, бактериофагов и вирусов 37
2.4.6. Классификация альгинат-лиаз 37
2.4.7. Биосинтез альгинат-лиаз 41
2.4.8. Сведения о структуре каталитического центра 41
2.4.9. Возможный механизм каталитического действия альгинат-лиазы АМН из Shingomonas sp. Al 44
2.4.10. Биологические функции альгинат-лиаз 45
2.4.11. Применение альгинат-лиаз 46
3. Материалы и методы исследования 47
3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования 47
3.2. Реагенты 48
3.3. Субстраты 48
3.4. Аналитические и физико-химические методы 49
3.5. Определение активности О-гликозилгидролаз 49
3.6. Выделение и очистка ферментов 50
3.6.1. Фукоидан-деградирующие ферменты морской бактерии P. citrea КММ 3296 50
3.6.2. Альгинолитические ферменты морской бактерии P. citrea КММ 3297 51
3.7. Исследование свойств ферментов 51
3.8. Получение и характеристика субстратов и продуктов их деградации 53
4. Обсуждение результатов 56
4.1. Распространение О-гликозилгидролаз в морских бактериях 56
4.1.1. Фукоиданазы морских бактерий-эпифитов бурых водорослей 57
4.1.2. Фукоиданазы морских бактерий-изолятов голотурии Apostichopus japonicus , 58
4.1.3. Гликозилгидролазы морских бактерий P. cilrea 62
4.2. Особенности деградации фукоидана морскими бактериями P. citrea 65
4.2.1. Физико-химические свойства фукоиданаз 66
4.2.2. Специфичность фукоиданаз 67
4.2.3. Особенности деградации фукоидана из F. evanescens под действием фукоиданазы из морской бактерии P. citrea КММ 3296 69
4.3. Внутриклеточные альгинолитические ферменты морской « бактерии P. citrea КММ 3297 73
4.3.1. Влияние компонентов питательной среды на синтез альгинолитических ферментов 73
4.3.2. Выделение, очистка и разделение альгинолитических ферментов 76
4.3.3. Физико-химические свойства альгинолитических ферментов морской бактерии P. citrea КММ 3297 77
4.3.4. Влияние ионов Na+ и двухвалентных металлов на активность апьгинат-лиаз 79
4.4. Субстратная специфичность альгинолитических ферментов морской бактерии P. citrea КММ 3297 80
4.4.1. Структурные характеристики субстратов 80
4.4.2. Действие альгинолитических ферментов на альгиновые кислоты и фукоидан 81
4.4.3. Исследование энзиматических свойств альгинат-лиаз 85
Выводы 88
Список литературы 90
- Тип действия и специфичность фукоиданаз
- Сведения о структуре каталитического центра
- Фукоиданазы морских бактерий-изолятов голотурии Apostichopus japonicus
- Влияние компонентов питательной среды на синтез альгинолитических ферментов
Введение к работе
Целью работы является изучение ферментов морских бактерий, катализирующих трансформацию полианионных полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и альгиновой кислоты), включающее поиск, выделение и характеристику свойств, установление их специфичности и деталей механизма действия.
Полианионные полисахариды клеточных стенок бурых водорослей -фукоиданы и альгиновые кислоты обладают разнообразной биологической активностью. Наибольший интерес представляет антикоагулянтное и антивирусное действие фукоиданов, в том числе против ВИЧ, вирусов гепатита и герпеса. Фукоиданы применяют как антиопухолевые препараты, а также для получения лечебно-профилактических средств с антикоагулянтными свойствами. Альгиновые кислоты известны как гелеобразователи и энтеросорбенты. Они используются в различных областях промышленности, медицины и сельского хозяйства.
Фукоиданы бурых водорослей представляЕОТ собой семейство гомо- и гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, которые связаны в основной цепи а-1—»3- или а-1—>3-;а-1—>4-0-гликозидными связями. Помимо фукозы, фукоиданы могут содержать как в основной цепи, так и в разветвлениях, минорные моносахариды: маннозу, галактозу, ксилозу, рамнозу, уроновые кислоты.
Альгиновые кислоты - линейные полисахариды, построенные из остатков 0-D-маннуроновой и a-L-гулуроновой кислот, связанных 1—»4-0-гликозидными связями.
Ферменты, катализирующие деградацию , полианионных полисахаридов, используются для изучения их структуры, биологической активности и получения лекарственных препаратов. Альгинат-лиазы применяются для получения протопластов разнообразных водорослей. Из природных альгинатов с помощью высокоспецифичных альгинат-лиаз получают поли-М-, поли-Г- и поли-МГ-блоки, которые необходимы для исследований субстратной специфичности ферментов. Альгинат-лиазы в сочетании с дезоксирибонуклеазой и антибиотиками применяются в качестве терапевтических препаратов для лечения заболеваний, вызванных патогенами.
6 Фукоиданазы обнаружены только в морских организмах и, как правило, уровень их активности чрезвычайно низок. Альгинат-лиазы найдены не только в морских макро- и микроорганизмах, но и в почвенных бактериях. Эти группы ферментов, особенно фукоиданазы, для которых известны и исследуются в настоящее время только единичные представители, относятся к малоизученным.
В качестве источников этих ферментов нами используются морские микроорганизмы, которые являются исключительно перспективными объектами для поиска различных биологически активных веществ, в том числе ферментов. Они содержат разнообразные ферменты и легко культивируются в контролируемых условиях.
Наши исследования расширят представления о механизмах действия ферментов вообще и ферментов морского происхождения, в частности, последние, если судить по имеющимся немногочисленным литературным данным, значительно отличаются от ферментов с аналогичной специфичностью из наземных организмов. Обнаружение новых источников - продуцентов фукоиданаз и альгиназ, изучение специфичности этих ферментов позволяет получить дополнительную информацию о зависимости "структура-биологическая активность" для полисахаридов бурых водорослей.
Результаты наших исследований могут иметь не только теоретический, но и практический интерес, так как могут использоваться для получения новых эффективных медицинских препаратов, источником которых является легко возобновляемое морское сырье.
7 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Фукоиданы ., 2.1.1. Распространение. Фукоиданы - сульфатированные фукозусодержащие полисахариды, которые обнаружены только в морских организмах и не встречаются в наземных (Kloareg, Quatrano, 1988). Основным источником фукоиданов являются бурые водоросли (Kloareg, Quatrano, 1988). Кроме того, фукоиданы обнаружены в мембране яйцеклеток иглокожих (Mulloy et al., 1994). Наиболее богаты этими полисахаридами представители бурых водорослей порядка Fucales. Один из видов фукусовых, Fucus vesiculosus, служит сырьем для производства коммерческого препарата фукоидана.
Следует отметить, что содержание фукоиданов зависит от вида водоросли. Например, фукоиданы в Pelvetia canaliculata составляют 18-24% от сухого веса водоросли, тогда как в Durvillea potatorum 0-2% (Nagumo, Nishino, 1997). Сезон и условия произрастания водоросли также оказывают существенное влияние на содержание фукоидана (Obluchinskaya et al., 2002).
2.1.2. Структура. Химическое строение фукоиданов бурых водорослей весьма разнообразно и изменяется от источника к источнику. Они представляют собой семейство сульфатированных гомо- и гетерополисахаридов, включающее полисахариды как с относительно высоким содержанием уроновых кислот и низким содержанием фукозы и сульфатов, так и практически чистые гомополимеры -сульфатированные a-L-фуканы. Кроме фукозы и уроновых кислот в составе фукоиданов обнаружены галактоза, манноза, ксилоза, рамноза (Percival, McDowell, 1967) (табл. 1).
Фукоиданы, выделенные даже из одного вида водоросли, но произрастающей в разных условиях, различаются не только моносахаридным составом, но и степенью сульфатирования. Известно, что фукоиданы из Laminaria saccharina, произрастающей в -«Баренцевом море, более сульфатированы и состоят из остатков фукозы и глюкуроновой кислоты, тогда как полисахариды водоросли беломорской популяции наряду с фу козой и глюкуроновой кислотой содержат глюкозу (Усов и др., 1998) (табл. 1).
Таблица 1.
Моносахаридный состав и содержание сульфатов в фукоиданах бурых водорослей
* - мольные отношения ** - процентное содержание н.о. - не определено
Несмотря на широкую известность этих полисахаридов, далеко не все их структурные особенности выяснены с достаточной определенностью из-за сложности и разнообразия их структуры.
На примере полисахарида бурой водоросли F. vesiculosus видно, как изменялись представления о структуре этого фукоидана (рис. 1).
В течение долгого времени считалось, что углеводные цепи этого полисахарида содержат преимущественно остатки фукозы, соединенные а-1—»2-0-гликозидными связями и сульфатированные по С4 (рис. 1 А, Б).
OtS04 fc\
Рис. 1. Предполагаемые структуры фукоиданов бурой водоросли Fucus vesiculosus.
Пересмотр этой структуры привел авторов к выводу, что основная цепь полисахарида содержит а-1—»3-связанные остатки фукозы, разветвления присоединены к ним в положении 2, тогда как сульфатные группы - в положении 4 (Patankar et al., 1993) (рис. 1 В).
В недавней работе Bilan и др. показали, что фракция фукоидана, выделенная из Тихоокеанской бурой водоросли F. evanescens, обладает линейной структурой и состоит из чередующихся остатков а-1—»3- и а-1—>4-связанной L-фукопиранозы, сульфатированной по С2 (рис. 2 А). Небольшое количество дополнительных сульфатных групп расположено в положениях 3 и 4 остатков L-Fuc. Кроме того, в фукоидане часть остатков фукозы ацетилированы (Bilan et al., 2002).
Практически полностью сульфатированная фракция фукоидана, выделенная из бурой водоросли L. cichorioides, образована остатками фукозы, соединенными а-1—»3-О-гликозидными связями (Zvyagintseva et al., 2003) (рис. 2 Б).
. -f3)-a-L-Fuc/>-(l-+4)-a-L-Fuc/>-(l-»3)-a-L-Fucp-(l-»4)-a-L-Fucp-(l^
t t t Т
so3 so3 so3 so3
Б SO3 SO3 SOj SO3 SO3 SOj
і. і і і і і
->3)-Fuc-(l-*3)-Fuc-(l-*3)-Fuc-(l-*3)-Fuc-(l-»3)-Fuc-(l-»3)-Fuc-(l-*3)-Fuc-(l-*
2 2 2 2 2 2
т т т т т т
SOj SO3 SO3 S03 SOj SOj
Рис. 2. Структуры фукоиданов из F. evanescens (А) и L. (Б).
Более разветвленная структура с неупорядоченным расположением сульфата предложена для фукоидана бурой водоросли Е. киготе (Nishino et аі., 1991а; Nishino etal., 1991b) (рис.3).
SOj Fuc«-(l->3)-Fuca-(l-»
1 4 SO3
2 T I
->3)-Fucpa-(l-+3) v SO3 -»3)-Fucpa-(l-»3) >4
^Яиса-(\-> j!>Fuca-(l-f2)
-*3)-Fucp или Fuc/a-(l->2) SOj->4)-Fucpa-(l->2)
Fucp или Fuc/a 1
і
-+3)-Fucpa-(l-+ -»?)-Fucpa-(l-»2)-Gal-(l-»4)-Fucpa-(l-
Рис. 3. Структурные фрагменты фукоиданов, выделенных из Е. киготе.
В целом, можно сказать, что отсутствие видимых признаков регулярности в построении полимерных молекул делает в высшей степени затруднительной построение общей концепции структуры фукоиданов. Наличие в их составе минорных компонентов (Man, Xyl, Gal) еще более усложняет структурный анализ фукоиданов водорослей. В настоящее время можно сделать предварительный вывод, что фукоиданы, выделенные из лиминариевых, представляют собой 1—+3-CC-L-фуканы, а из фукусовых- 1—*3; 1-^4-а-Ь-фуканы.
11
В отличие от фукоиданов бурых водорослей полисахариды, выделенные из
иглокожих, обладают линейной структурой с повторяющимися тетрасахаридными
звеньями (Mulloy etal., 1994) (рисЛ 4).
Рис. 4. Структура повторяющихся тетрасахаридных блоков в сульфатированных фуканах из морского ежа Lytechinus variegates (А), голотурии Ludwigothurea grisea (Б) и морского ежа Arbacia lixula (В).
Предполагают, что наличие фукоидана, состоящего из регулярно повторяющихся тетрасахаридов определенной структуры, является характерной особенностью иглокожих (Mulloy et al., 1994).
2.1.3. Функции» выполняемые фукоиданами в бурых водорослях и
иглокожих. Публикаций о функции фукоиданов в организмах морских водорослей и
животных немного (Kloareg, Quatrano, 1988; Mulloy et al., 1994).
Предполагают, что они являются матричными полисахаридами клеточных стенок бурых водорослей (Kloareg, Quatrano, 1988). Благодаря полианионной природе, фукоиданы могут участвовать в электролитическом гомеостазе. Они очень гигроскопичны и их водные растворы могут образовывать вязкие гели, обеспечивая физиологический барьер, который входит в систему иммунитета. Фукоидан выполняет функцию протектора и наряду с альгиновой кислотой предохраняет водоросль от гибели в момент отлива (Obluchinskaya et al., 2002). Предполагают таїрке, что фукоиданы участвуют в механизме ионной регуляции водоросли (Kloareg, Quatrano, 1988). Как компоненты клеточной стенки эти полисахариды обеспечивают устойчивость и эластичность водоросли.
Известно, что фукоидан, выделенный из яйцеклеток морского ежа L. variegatus, играет важную роль в их оплодотворении (Mulloy et al., 1994).
2.1.4. Биологическая активность фукоиданов. Большое количество
публикаций, патентов, обзоров посвящено исследованиям биологической активности
этих полисахаридов. Фукоиданы обладают антикоагулянтной (Nagumo, Nishino, 1997;
Розкин и др., 1991; Millet et al., 1999), противоопухолевой (Ellouali et al., 1993; Zhuang et al., 1995), противовирусной (Baba et al., 1988; McClure et al., 1992), контрацептивной активностями (Glabe et al., 1982).
Особо следует отметить способность фукоиданов ингибировать ретровирусные инфекции, в том числе вирус иммунодефицита человека, вирус цитомегалии и вирус герпеса (McClure et al., 1992; Baba et al., 1988).
Из всех перечисленных активностей фукоидана наиболее изучена антикоагулянтная. Механизм антикоагулянтного действия фукоидана реализуется посредством ингибирования активности факторов "внутреннего" пути свертывания крови XI, XII, VII, а не через антитромбин III (AT III), как это происходит в случае гепарина. Фукоиданы могут быть эффективны при антикоагулянтной терапии у больных с врожденным или приобретенным дефицитом AT III. Получены препараты фукоидана, которые по антикоагулянтной активности не уступают или даже превосходят гепарин. Это - фукоиданы, выделенные из бурых водорослей семейства Laminariales, Fucales (Лоенко и др., 1997).
Фукоиданы обладают высокой степенью сродства к ионам двухвалентных металлов. Это обстоятельство нашло свое применение в исследованиях, касающихся вопросов выведения свинца и других тяжелых металлов из организма млекопитающих и человека. Установлено, что катионы двухвалентных металлов по способности связываться с фукоиданами из A. nodosum располагаются в следующей последовательности: Pb2+> Ва2+) Cd2+) Cr2*) Cu2+> Fe2+> Со2+> Zn2+> Mg2+> Mn2+> Ni2+> Ca2+. Наименьшим сродством к фукоидану обладают ионы Са2+, что делает его Са2+-сберегающим лечебным препаратом, служащим для вывода ионов тяжелых металлов из организма человека (Лоенко и др., 1997).
Биологическая активность фукоиданов обусловлена в первую очередь степенью сульфатирования, хотя, очевидно, что и другие особенности структуры (моносахаридный состав, тип связи), и молекулярно-массовое распределение также должны существенно влиять на биологические свойства препаратов (Nagumo, NIshino, 1997).
Считают, что биологическая активность фукоиданов в организме млекопитающих связана с модификацией свойств клеточной поверхности при взаимодействии этих полисахаридов с мембраной клетки. Фукоиданы могут быть
использованы при разработке новых медицинских препаратов противовирусного, иммуномодулирующего, контрацептивного и антикоагулянтного действия.
2.2. Фукоиданазы
* 2.2.1. Номенклатура. Известные представители. Для решения вопроса о
применении фукоиданов в качестве медицинских препаратов необходимо изучить
взаимосвязь между их структурой и биологической активностью. Для этого
необходимы высокоспецифичные ферменты, катализирующие деградацию этих
сложных полимеров.
Такими ферментами являются фукоиданазы. Они относятся к классу О-
* гликозилгидролаз (КФ 3.2.1.44).
Первые сведения об этих ферментах появились в литературе сравнительно
недавно - в 1967 году (Thanassi, Nakada, 1967).
К настоящему времени фукоиданазы выделены из морских моллюсков Haliotis
sp. (Thanassi, Nakada, 1967; Tanaka et al., 1968), Patinopecten yessoensis (Kitamura et al.,
1992) и Pecten maximus (Daniel et al., 1999), морского ежа Strongylocentrotus nudus
(Sasaki et al., 1996). Известны также фукоиданазы морских бактерий: Vibrio sp. №5
(Furucawa et al., 1992), Flavobacterium sp. SA-0082 (Sakai et al., 2001), Fucoidanobacter
marinus SI-0098 (Sakai et al., 2001). Следует отметить, что фукоидан-деградирующие
ферменты во всех вышеперечисленных источниках содержатся в крайне малых
количествах и очистить их до гомогенного состояния чрезвычайно трудно (табл. 2, 3).
В таблицах 2, 3 представлены схемы и степень очистки фукоиданаз из различных
источников. *
* Наибольшая степень очистки была достигнута для фермента, выделенного из
морского ежа S. nudus (307 раз) (табл. 3). Высокая исходная активность фукоиданазы в этом источнике согласуется с тем, что морские ежи, предпочитают питаться водорослями, содержащими фукоидан.
2.2.2. Физико-химические свойства фукоиданаз. Свойства фукоиданаз животного и бактериального происхождения были исследованы на частично очищенных ферментных препаратах. Фукоиданазы морских животных и микроорганизмов различаются по физико-химическим свойствам (табл. 4).
А А Таблица 2.
Схема очистки фукоиданаз из различных источников
Ферменты, синтезируемые морским ежом S. nudus и моллюском Haliotis sp., имеют общие черты. Их рН-оптимумы лежат в кислой области, ферменты имеют молекулярные массы 100-200 кДа и являются фукоиданазами экзо-типа действия (табл. 4). Двустворчатый моллюск P. yessoensis продуцирует фермент эндо-типа действия с молекулярной массой 85 кДа (табл. 4).
Таблица 3. Удельная активность и степень очистки фукоданаз
Примечание:*- количество фермента, катализирующее образование 1 цмоля L-фукозы за 12 часов.
**- количество фермента, которое катализирует расщепление 1 рлюля гликозидной связи между
маннозой и глюкуроновой кислотой за 1 мин. ***- количество фермента, катализирующее образование Іцмоля пиридиламинид фукозы в мин. ****- по уменьшению вязкости фукоидана, за единицу принимали 1-Оы,,.
В отличие от ферментов моллюсков фукоиданазы бактерий имеют оптимум действия в нейтральной или щелочной области рН. Ферменты, продуцируемые морской бактерией Vibrio sp. №5, сохраняют активность до 50-60С, тогда как фукоиданаза из Flavobacterium sp. SA-0082 теряет активность при температуре выше 30С. Бактерии биосинтезируют низкомолекулярные фукоиданазы (39,5-70 кДа), за исключением внутриклеточного фермента морской бактерии Flavobacterium sp. SA-0082, молекулярная масса которого равна 460 кДа (табл. 4).
Установлено, что фукоиданазы морской бактерии Vibrio sp. № 5 и морского моллюска Haliotis sp. ингибируются ионами Ag+ и двухвалентных металлов (Hg2+, Fe2+, Mn2+) (Glabe et al., 1982; Furucawa et al., 1992) (табл. 4). ЭДТА, ионы Cu2+, РЬ2+не влияют на активность этих же ферментов, тогда как ионы Со2+, Mg2+ слабо активируют их активность. Предположения о механизме ингибиторного действия ионов металлов на активность фукоиданаз отсутствуют.
І «
Таблица 4. Физико-химические свойства фукоиданаз
Примечание:* - активаторы
., 2.2.3. Тип действия и специфичность фукоиданаз. Исследование и сравнение специфичности фукоиданаз затруднено из-за отсутствия субстратов, хорошо охарактеризованных с точки зрения их структур, и из-за структурного разнообразия последних, а также из-за сложностей, связанных с выделением индивидуальных ферментов. До настоящего времени свойства и специфичность фукоиданаз изучались с использованием экстрактов или частично очищенных ферментных препаратов. Известно, что продуктами действия фукоиданаз на фукоиданы являются сульфатированные фукоолигосахариды, точная структура которых чаще всего не была установлена (Kitamura et al., 1992; Furucawa et al., 1992; Sakai et al., 2001; Daniel et al., 1999) (табл. 4).
Возможно, все известные ферменты, деградирующие фукоидан, различаются по специфичности, так как в качестве субстратов при их изучении использовались фукоиданы, выделенные из разных источников, структура и моносахаридный состав которых значительно различаются.
Действием эндо-фукоиданаз морских бактерий Flavobacteriwn sp. SA-0082 и Fucoidanobacter marinus SI-0098 на фукоидан из К. crassifolia удалось получить низкомолекулярные фрагменты, структуру которых установили с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии (табл. 5).
Таблица 5.
Продукты ферментативной деградации фукоидана из бурой водоросли Kjellmaniella crassifolia, под действием фукоиданазы из морской бактерии F. marinus SI-0098 (Sakai et al., 2001)
Продолжение табл. 5
Окончание табл.5
Почти все продукты ферментативной реакции имеют на невосстановливающем конце 4-дезокси-Ь-эритро-гекс-4-енопиранозилуроновую кислоту, а на восстановливающем конце - маннозу или ее сульфатированные производные. Исходя из этого, авторы предполагают, что в фукоидане, изученном ими, присутствуют чередующиеся дисахаридные фрагменты, построенные из глюкуроновой кислоты и маннозы (Sakai et al., 2001). На наш взгляд, присутствие среди продуктов реакции олигосахаридов, имеющих двойную связь в
моносахаридном остатке на невосстанавливающем конце, а также олигосахаридов, не имеющих двойной связи, говорит о том, что препарат фермента, использованный в данной работе, негомогенен. Возможно, он содержит наряду с фукоиданазой лиазу, которая расщепляет О-гликозидные связи по механизму р-элиминирования.
Интересно, что ферментный препарат морской бактерии F. marinus SI-0098 катализирует гидролиз других фукоиданов, выделенных из бурых водорослей семейства Laminariaceae, а именно из Undaria pinnatifida и Lessonia nigrescens (Sakai, et al., 2002).
2.2.4. Условия культивирования морских бактерий, синтезирующих фукоиданазу. Японские исследователи отметили, что в качестве продуцентов фукоиданаз могут быть использованы любые морские бактерии, способные синтезировать эти ферменты. Они показали, что активность ферментов зависит от условий культивирования бактерий. В качестве источника углерода может быть использован фукоидан, порошок морских водорослей, альгиновая кислота, фукоза, глюкоза, маннитол, глицерин, сахароза, мальтоза, лактоза, крахмал. Источником азота может служить дрожжевой экстракт, пептон, мясной экстракт, обезжиренная соя, также можно добавлять соли натрия, фосфорной кислоты, калия, цинка (Sakai et al., 2001).
Состав питательной среды существенным образом влияет на синтез фукоиданаз (табл. 6).
Видно, что введение фукоидана вместо глюкозы при культивировании бактерии Flavobacterium sp. SA-0082 увеличивает биосинтез внутриклеточного фермента в 4 раза, а внеклеточного в 5 раз (табл. 6).
Максимальный выход фукоиданаз достигается при температуре культивирования 15-30С, рН 5-9, при циркуляционном встряхивании продолжительностью 5-72 часа (Sakai et al., 2001). При соблюдении этих условий бактерии синтезируют как внутри-, так и внеклеточные фукоиданазы. Примером могут служить штаммы морских бактерий Flavobacterium sp. SA-0082 и F. marinus SI-0098, которые синтезируют внутри- и внеклеточную фукоиданазы (табл. 6).
Таблица 6.
Активность фукоиданаз морских бактерий, выращенных на питательных средах
разного состава
Примечание: U*- количество фермента, которое катализирует расщепление 1 цлюля гликозидной связи между маннозой и глюкуроновой кислотой за 1мин.
В таблице 7 представлены фенотипические характеристики этих бактерий.
Видно, что эти бактерии различаются по физиологическим свойствам: Flavobacterium sp. SA-0082 гидролизует желатин, казеин, эскрин, тогда как F. marinus SI-0098 - крахмал и эскрин. Содержание Г+Ц в ДНК у F. marinus SI-0098 в 2 раза больше, чем у F. sp. SA-0082. Однако, несмотря на различия в физиологии, обе бактерии увеличивают синтез фукоиданаз при добавлении в среду фукоидана.
Таким образом, несмотря на повышенный интерес к фукоиданам и ферментам, способным катализировать их расщепление, они являются малоизученными. Все фукоиданазы обладают низким уровнем активности, но, несмотря на это, они могут быть использованы для деполимеризации высокомолекулярных полисахаридов с целью дальнейшего использования последних в медицине.
Таблица 7.
Фенотипические характеристики морских бактерий Flavobacterium sp. SA-0082
и F. marinus SI-0098
2.3. Альгиновые кислоты
2.3.1. Распространение. Альгиновые кислоты и их соли содержатся, главным
образом, в морских бурых водорослях (Phaeophyceae). Содержание альгиновых
кислот в некоторых случаях достигает 30-40% от сухой массы водоросли (Rossel,
Srivastava, 1984). Эти полисахариды также найдены в красных водорослях
семейства СогаШпасеае (Okazaki et al., 1982). Показано, что наличие альгинатов
является отличительным признаком представителей семейства СогаШпасеае (Усов,
Билан, 1996). Из наземных организмов альгиновые кислоты обнаружены только в
почвенных бактериях родов Pseudomonas и Azotobacter (Skjak-Brak et al., 1986).
В других морских и наземных организмах эти полисахариды не найдены. Большинство альгиновых кислот, которые используются как коммерческие препараты, получены из морских водорослей, принадлежащих к родам Macrocystis, Laminaria, Ascophyllum (Skjak-Brak, Martinsen, 1991).
2.3.2. Структура. Альгиновые кислоты являются высокомолекулярными
линейными полиуронидами, которые построены из остатков P-D-маннуроновой
(М) и oc-L-гулуроновой кислот (Г), соединенных 1—»4-0-гликозидными связями.
Содержание альгиновых кислот колеблется в зависимости от вида и возраста
водоросли, а также сезона и условий ее произрастания (Ganesan et al., 2001;
Obkichinskaya et al., 2002).
Маннуроновая и гулуроновая кислоты различаются только конфигурацией ассиметрического центра при С5 и могут превращаться друг в друга путем эпимеризации (Усов, Чижов, 1988) (рис. 5).
о/
соо'
Рис. 5. Фрагменты структуры альгиновой кислоты.
^tif-щ -v*yv " -.,--^.,-
Основное отличие альгиновых кислот, синтезируемых бактериями, от водорослевых состоит в том, что часть их гидроксильных групп ацетилирована, причем, ацетильные группы занимают положения 2 или 3 (иногда сразу оба) в остатках D-маннуроновой кислоты (Skjak-Brak et al., 1985) (рис. 6). Степень полимеризации (п) природных полисахаридов достаточно велика и может варьировать от 1000 до 10000.
Альгиновые кислоты из разных источников могут различаться не только количественным соотношением остатков маннуроновои и гулуроновои кислот, но и распределением мономерных звеньев вдоль цепи полимера (Усов, 1999).
Альгинаты водорослей
-[ 4-a-L-GulpA l-»4-p-D-ManpA l-*4-p-D-ManpA l-»4-P-D-ManpA l-*4-a-L-GulpA l-»4-a-L-GulpA 1-wf-a-L-GulpA 1 ]-»
Альгинаты бактерий Azotqbacter vinelandii
-+[ 4-a-L-GulpA l-»4-p-D-ManpA l->4-p-D-ManpA l-*4-P-D-ManpA 1—M-a-L-GulpA l-M»-a-L-GulpA l-»4-a-L-GulpA 1 ]-»
CH,CO.O
Pseudomonas aeruginosa
-»[ 4-p-D-ManpA l->4-p-D-ManpA l-»4-P-D-ManpA l-»4-0-D-ManpA l-»4-P-D-ManpA l-»4-p-D-ManpA l-»4-a-L-GuIpA 1 ]-»
t T T
CIbCO.O CHjCO.O СІЬСО.О
Рис. 6. Фрагменты структуры альгиновых кислот из различных источников (Sutherland, 1995).
Установлено, что в молекулах альгиновых кислот имеются участки, построенные только из остатков одной либо маннуроновои (М-блоки), либо гулуроновои кислоты (Г-блоки). Эти блоки разделены участками, которые содержат приблизительно равные количества обоих, более или менее строго чередующихся моносахаридов (МГ-блоки) (Haug et al., 1967).
Такое строение является результатом ступенчатого биосинтеза молекул полисахарида, при котором сначала образуются полиманнуронаты, а затем в этих полимерных предшественниках происходит эпимеризация при С5 атоме части остатков D-маннуроновой кислоты под действием специфического фермента -полиманнуронан-С5-эпимеразы, что приводит к появлению в составе полимера остатков a-L-гулуроновой кислоты (Skjak-Brak, 1992).
В присутствии катионов двухвалентных металлов, особенно ионов кальция, альгиновые кислоты образуют прочные гели, растворимые в щёлочи (Кочетков и др., 1967; Усов, Чижов, 1988). Прочность геля линейно возрастает с увеличением п до значения 400. Дальнейшее увеличение молекулярной массы полисахарида не влияет на качество геля. Существует зависимость гелеобразования альгиновой кислоты от структуры ее молекул. Гель вообще не образуется, если содержание гулуроновой кислоты меньше 20-25%. Чем выше содержание гулуроновой кислоты, тем прочнее гель. Природа противоиона также оказывает определенное влияние на гелеобразование. По прочности формируемого геля ионы двухвалентных металлов образуют ряд Ba2+>Sr2+>Ca2+»Mg2+. В присутствии катионов бария альгинаты, содержащие даже 10% гулуроновой кислоты образуют "слабый" гель.
Поли-Г-блоки имеют конформацию «гибкой» цепи и, связываясь с ионами кальция, образуют крепкие, но хрупкие гели. Поли-М-блоки имеют конформацию ленты, тогда как полимеры, построенные из беспорядочно расположенных М- и Г-блоков, могут образовывать цепи с петлями. Полисахариды, построенные из регулярных поли-(МГ)„-блоков имеют конформацию синусоиды (Wong et al., 2000).
2.3.3. Биологическая активность альгиновых кислот. Повышенный интерес вызывают работы по оценке противоопухолевых свойств альгинатов (Fujihara et al., 1984а; Fujihara et al., 1984b). Противоопухолевая активность зависит от соотношения М- и Г-блоков в альгинатах: образцы с высоким содержанием полиманнуронидов проявляют большую противоопухолевую активность и наоборот (Fujihara, Nagumo, 1992). Альгинаты с низким содержанием полиманнуронида начинают проявлять высокую противоопухолевую активность при добавлении от 1 до 3 мМ Са2+. На основании этого предполагают, что для проявления противоопухолевой активности альгинатам необходима пространственная структура (Fujihara, Nagumo, 1993).
Тип действия и специфичность фукоиданаз
Ферменты, деградирующие альгинат, выделены из пищеварительного тракта, гепатопанкреаса различных морских моллюсков, таких как Littorina spp., Turbo cornutus, Haliotis spp. (Favorov et al., 1979; Muramatsu et al., 1984; Nakada, Sweeny, 1967). Несмотря на то, что альгинат-лиазы обнаружены давно, к настоящему времени небольшое число таких ферментов очищено до гомогенного состояния и детально охарактеризовано с точки зрения механизма действия.
Для выделения и очистки альгинат-лиаз чаще всего используют традиционные методы: осаждение различными концентрациями сульфата аммония, катионообменную, анионообменную хроматографии, гель-фильтрацию (Wong et al., 2000). Иногда применяют гидрофобную и аффинную хроматографии (Favorov et al., 1979; Malissard et al., 1995; Kennedy et al., 1992). Большинство моллюсков продуцируют одну форму фермента, за исключением Turbo cornutus, продуцирующего два изофермента (Muramatsu, Egawa, 1980) (табл. 8). Практически все известные альгинат-лиазы моллюсков являются эндо-поли-М лиазами с рН-оптимумом 5,6-9,6. Исключение составляет экзо-поли-Г-лиаза из Н. rufescens с рН-оптимумом действия при 4,0 (Nakada, Sweeny, 1967). Активность ферментов, выделенных из морских моллюсков, часто зависит от присутствия в среде ионов металлов. Так, например, ферменты Н. corrugate, Н. rufescens проявляют максимальную активность в присутствии 0,05-0,08 М NaCl. Высокая концентрация NaCl (0,1-0,2 М) необходима для ферментов из Я. tuberculata, Spisula solidissima, Т. cornutus (Boyen et al., 1990b; Jacober et al., 1980; Muramatsu et al., 1984). Альгинат-лиаза из Littorina spp. имеет оптимум действия при рН 5,6 в присутствии 0,05 М NaCl. При увеличении концентрации NaCl до 0,2 М оптимум активности сдвигается к рН 8,0-8,5. Активность этой альгинат-лиазы заметно увеличивается при добавлении ионов Са2+ (Favorov et al., 1979) (табл. 9).
Альгинолитические ферменты морских водорослей, практически не изучены. Известно, что их активность варьирует в зависимости от части таллома, из которой выделен фермент, а также времени сбора водоросли (Shiraiwa et al., 1975). рН-Оптимум действия альгинат-лиаз водорослей лежит в области 7,5-7,7 (табл. 9). Показано, что для активности альгинат-деградирующих ферментов
Pelvetia canaliculata, Undaria pinnatifida необходимы ионы Са (Madgwick et al., 1978; Watanabe, Nisizawa, 1982). Многие ферменты водорослей проявляют широкую субстратную специфичность (по поли-М и поли-Г) (табл. 8). Широкая субстратная специфичность альгинат-лиаз, возможно, обусловлена недостаточной очисткой ферментных препаратов.
Альгинат-лиазы морских бактерий. Большинство бактерий, синтезирующих альгинат-лиазы, ассоциированы с морскими водорослями или моллюсками. Многие из них были изолированы при использовании селективных питательных сред, в состав которых, в качестве единственного источника углерода и энергии, вводили альгиновую кислоту. Так были выделены бактерии Alginovibrio aquatilis (Stevens, Levin, 1977), морские бактерии A3 и W3 (Doubet, Quatrano, 1984) и морская бактерия АТСС 433367 - ассоциант бурой водоросли Sargassum fluitans (Brown, Preston, 1991). Однако есть бактерии, например, Pseudomonas alginovora, которые продуцируют альгинат-лиазу конститутивно (Boyen et al., 1990b). Использование альгиновой кислоты в качестве источника углерода стимулирует экспрессию внеклеточных и не влияет на синтез внутриклеточных ферментов (Sawabe et al., 1998).
Морские бактерии синтезируют, главным образом, внеклеточные и/или периплазматические альгинат-лиазы, рН-оптимум действия которых расположен в области 7,5-8,5. Изоэлектрические точки (pi) ферментов лежат между 4,3-6,7, тогда как у лиазы из Halomonas marina pI-7,78 (табл. 9). Морские бактерии синтезируют, как правило, одну или две молекулярные формы альгинат-лиаз. Исключением является бактерия Alteromonas sp. Н-4, синтезирующая, по меньшей мере, 5 различных альгинат-лиаз, 4 из которых - внутриклеточные с разной субстратной специфичностью (поли-М; поли-МГ и поли-М; поли-Г; поли-Г) (Sawabe et al., 1998; Sawabe et al., 1997) (табл. 8).
Для проявления активности одних альгинат-лиаз необходима высокая концентрации NaCl (например, из АТСС 433367 (Alg-A), из АТСС 433367 (Alg-G), из Vibrio harveyi), тогда как для других важно присутствие ионов двухвалентных металлов Са2+, Mg2+ (табл. 9). Как и ферменты морских моллюсков, альгинат-лиазы бактерий являются, в основном, эндо-поли-М-лиазами, за исключением экзо-поли-М-лиазы морской бактерии A3 (Doubet, Quatrano, 1984). Этот фермент имеет достаточно высокую молекулярную массу (100 кДа), что характерно для О-гликозилгидролаз экзо-типа действия.
Альгинат-лиазы почвенных бактерий. Почвенные бактерии, также как и морские, синтезируют вне-, внутриклеточные и/или периплазматические ферменты. рН-Оптимум действия альгинат-лиаз также расположен в щелочной области. Исключение составляет фермент грамположительной бактерии Bacillus circulans JBH2, рН-оптимум которого 5,8. Альгинат-деградирующие ферменты большинства грамотрицательных почвенных бактерий имеют основные значения pi (табл. 9). Активность альгинолитического фермента бактерии Enterobacter cloacae М-1 возрастает при добавлении 2 мМ ионов Са , тогда как для ферментов Azotobacter vinelandii, P. syringae pv. syringae, P. aeruginosa необходима довольно высокая концентрация NaCl (0,2-0,35 М).
Все известные альгинат-лиазы почвенных бактерий - ферменты эндо-типа действия, деградирующие как поли-М-, так и поли-Г-блоки (табл. 8). Некоторые из них способны деполимеризовать ацетилированный альгинат, синтезируемый почвенными микроорганизмами (Kennedy et al., 1992; Wong et al., 2000).
Сведения о структуре каталитического центра
Микроорганизмы и условия их культивирования. В работе использовали 78 штаммов морских бактерий, которые были выделены с поверхности бурых водорослей F. evanescens, С. filum, произрастающих на литорали у островов Парамушир, Онекотан, Итуруп, а также голотурии Apostichopus japonicus, обитающей в заливе Петра Великого. Выделение микроорганизмов из образцов тканей бурых водорослей и голотурии, а также определение их таксономического положения было выполнено сотрудниками лаборатории микробиологии по методам, описанным ранее (Иванова и др., 1996). Штаммы бактерий хранятся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН.
Для первичного скрининга фукоидан-деградирующих ферментов штаммы бактерий выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): бакто-пептон-5; дрожжевой экстракт-2; фукоидан-1; К2НРО4-0,2; MgSO4-0,05; морская вода-500 мл, дистиллированная вода-500 мл, рН 7,5-7,8 на термостатированной качалке (160 об/мин) при 28С в течение 24 ч.
Для исследования фукоидан-деградирующих ферментов морской бактерии Р. citrea КММ 3296, выделенной с поверхности бурой водоросли F. evanescens, культивирование штамма проводили на среде следующего состава (г/л): пептон-5,0; дрожжевой экстракт-2,0; гидролизат казеина-2,0; MgSO4-0,05; глюкоза-1,0; морская вода-500 мл; дистиллированная вода-500 мл. Культивирование проводили в течение 32 часов при температуре 25С на термостатированной качалке (120 об/мин).
Для исследования альгинолитических ферментов морской бактерии P. citrea КММ 3297 культивирование штамма проводили на средах различного состава (г/л): среда А - пептон-5,0; дрожжевой экстракт-2,0; гидролизат казеина-2,0; MgSO4-0,05; глюкоза-1,0; морская вода-500 мл; дистиллированная вода-500 мл; рН 7,8; в средах Б и В глюкоза заменена на ксилозу-2,0 и фукоидан-1,0, соответственно.
Для исследования динамики роста бактерии и биосинтеза альгинат-лиаз посевной материал P. citrea КММ 3297 выращивали в колбах объемом 250 см3, содержащих 100 мл питательной среды А, Б или В, в течение 24 часов при температуре 25С на качалке со скоростью вращения 150 об/мин, до получения плотности 109 клеток на 1 мл среды. Полученным посевным материалом (плотность-109 клеток/мл) засевали 20 колб объемом 250 мл, содержащих по 100 мл питательной среды того же состава. Культивирование проводили в течение 60 часов при температуре 25С на термостатированной качалке (120 об/мин). Пробы (1 колба) отбирали каждые три часа. Рост бактерии регистрировали на спектрофотометре по поглощению при 560 нм. Содержимое колбы центрифугировали при 5000 g в течение 30 мин. Супернатант (культуральную среду) анализировали на содержание восстанавливающих Сахаров, общего сахара, и общего белка. 3Неорганические соли и кислоты: этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), азид натрия - коммерческие препараты производства "Реахим" (Россия); носители для хроматографии: ДЭАЭ-целлюлоза ("Reanal", Венгрия), биогели Р-2, ДЭАЭ-сефароза СЬбВ, Сефароза CL-6B ("Sigma"), Toyopearl 40-HW, Сефадекс G-10, Сефадекс G-25 ("Pharmacia"); FPLC колонки: Superdex 75-HR, Source 15Q PE, Superose 12-HR. Стандартные белки: бычий сывороточный альбумин (БСА), ангидраза, химотрипсиноген А, миоглобин, цитохром С, апротинин, лизоцим, иммуноглобулин, Р-лактоглобулин ("Sigma"). Декстраны Т-10, -20, -40 и 80 - препараты фирмы "Sigma". Пептон, дрожжевой эскстракт ("Difco"), гидролизат - казеина, фукоза, глюкоза, глюкуроновая кислота ("Merck"). КМ-целлюлоза, амилопектин, и-нитрофенил-a-D галактопиранозид (p-Np-a-Gal), пара-нитрофенил-Р-В-галактопиранозид (p-Np-P Gal), пара-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозид (p-Np-Glc), пара-нитрофенил-N ацетил-Р-В-глюкозаминид (p-Np-N-Ac-Glc), пара-нитрофенил-а-Б-маннопиранозид (p-Np-Man), пара-нитрофенил-Р-О-ксилопиранозид (p-Np-Xyl), пара-нитрофенил-а L-фукопиранозид (p-Np-Fuc), пара-нитрофенилсульфат (p-Np-сульфат) - препараты фирмы "Sigma". Полигулуроновая кислота производства фирмы "Merck". Полиманнуроновая кислота из бурой водоросли F. evanescens, ламинаран из L. cichorioides, пустулан из лишайника Umbellicaria russica, а также фукоиданы бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides, L. japonica получены по методикам, описанным ранее (Zvyagintseva et al., 1999). Определение количества белка. Белок определяли по методу, описанному в работе (Lowry et al., 1951). Концентрацию белков определяли по калибровочным кривым, используя в качестве стандарта БСА. Определение восстанавливающих Сахаров Сахара определяли по методу, описанному в работе (Nelson, 1944). Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по соответствующим калибровочным кривым, используя в качестве стандартов фукозу, глюкуроновую кислоту. Определение нейтральных Сахаров - фенол-сернокислотный метод (Dubois et ф al., 1956). К аликвоте исследуемого раствора (0,5 мл) добавляли 0,5 мл 5% раствора фенола, затем приливали 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Оптическую плотнбсть измеряли при 490 нм на спектрофотометре Cecil СЕ-1011 относительно соответствующих контролей. Концентрацию нейтральных Сахаров определяли по калибровочным кривым, используя в качестве стандарта фукозу, глюкуроновую " кислоту. ЯМР-спектроскопия. 13С-ЯМР-спектры получены на приборе WM-250 Briiker-Physic ("Bruker", Германия) в D20 при 60С, а Н-ЯМР-спекры при 30С. В качестве внутреннего стандарта использовали метанол (Д8МеОн=50,15 м.д.). УФ-спектры записывали на спектрофотометре Сесії СЕ 7250 серии 7000 (Германия). ИК-спектроскопия. ИК-спектры полисахаридов и продуктов их ферментативной трансформации регистрировали чна спектрометре Carl Zeiss IR-75.
Фукоиданазы морских бактерий-изолятов голотурии Apostichopus japonicus
Таким образом, из 78 исследованных бактериальных штаммов 57 (73%) имели в составе ферментных систем фукоиданазы (табл. 16). Высокий процент бактерий, имеющих фукоидан-деградирующие комплексы, ферментов говорит о важности этих ферментов для эпифитных бактерий. Фукоидан-деградирующие ферменты могут быть одним из звеньев механизма адаптации морских микроорганизмов, колонизирующих как водоросли, так и животных, к среде обитания. Эти бактерии могут использовать фукоиданы в качестве одного из источников углерода и энергии. Широкое распространение фукоиданаз среди морских микроорганизмов и низкий уровень их активности по сравнению с другими гликозилгидролазами, возможно, обусловлены особой ролью щ фукоиданов и преобразующих их ферментов в живых организмах. Выше было отмечено, что фукоиданы из L. cichorioid.es и F. evanescens, помимо фукозы, содержат минорные моносахариды: маннозу, галактозу, ксилозу, глюкозу (табл. 13). Поэтому существует вероятность деградации таких полисахаридов под действием других гликозилгидролаз, субстраты которых имеются в морской среде.
Из большого числа бактерий КММ ТИБОХ ДВО РАН, протестированных на способность деградировать фукоидан, в качестве продуцентов были отобраны три штамма морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, выделенные с поверхности талломов бурых водорослей F. evanescens (КММ 3296) и С. filum (КММ 3298), и целомической жидкости голотурии A. japonicus (КММ 3297). Известно, что в состав клеточных стенок бурых водорослей и кутикулу голотурии входит фукоидан.
Любопытно было выяснить, содержатся ли фукоиданазы в штаммах этого же вида бактерий, населяющих другие местообитания, где фукоиданы отсутствуют и как состав О-гликозилгидролаз зависит от условий обитания? Для ответа на него были взяты типовой штамм вида и 8 штаммов из КММ (не считая трех, отобранных ранее), идентифицированных как Pseudoalteromonas citrea с помощью методов традиционной и молекулярной таксономии (Ivanova et al., 1998; Недашковская и др., 2002),
В таблице 17 суммированы результаты исследования состава гликаназ и гликозидаз 12 штаммов P. citrea. Анализ данных о присутствии ферментов, катализирующих гидролиз высокополимерных субстратов, показал, что все бактерии, независимо от мест обитания, эффективно гидролизовали ламинаран. Известно, что ламинариназы (1— 3-Р-0-глюканазы) присутствуют во многих морских макро- и микроорганизмах (Звягинцева и др., 1998). Менее эффективно экстракты бактерий гидролизовали альгиновую кислоту, растворимую агарозу, КМ-целлюлозу (табл. 17). Штаммы Р. citrea похожи по гликаназному составу, но деградировать фукоиданы бурых водорослей могут ферменты только трех из них - КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298, которые были выбраны нами для выделения и изучения свойств фукоиданаз. Эти бактерии изолированы из источников, богатых фукоиданами, в отличие от остальных девяти, в местообитаниях которых эти полисахариды отсутствуют.
Полученные нами данные о гликозидазах исследуемых штаммов, ферментах, которые обычно катализируют расщепление небольших молекул - олигосахаридов или гликозидов, но участие которых в полимеризации фукоиданов нельзя исключить, показали, что бактерии могут быть разделены на две подгруппы. Отличительной чертой микроорганизмов одной подгруппы . был синтез высокоактивной P-N-ацетилглюкозаминидазы. В нее вошли четыре штамма: АТСС 29719 (выделен из образца воды Средиземного моря), три штамма, выделенные из гребешка Patinopecten yessoensis (КММ 157, КММ 280, КММ 327) (табл. 17). Микроорганизмы другой подгруппы отличались синтезом высокоактивной ос-галактозидазы: два штамма-эпифита бурых водорослей F. evanescens и С. filum (КММ 3296 и КММ 3298, соответственно), один из голотурии A. japonicus (КММ 3297), один из мидии Crenomytilus grayanus (КММ 188), три из асцидий Halocynthia aurantium и Amaroucium translucidum (КММ 216, КММ 250, КММ 256) и один из губки Plocamia sp. (КММ 504). Большинство штаммов не содержало oc-L-фукозидаз, а-Ы-ацетил-О-галактозаминидаз, cc-D-маннозидаз, P-D-ксилозидаз.
Мощные агаролитики (КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504, КММ 3297, КММ 3296, КММ 3298) синтезировали а- и P-D-галактозидазы. Интересно отметить, что экстракты трех штаммов (КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298), которые гидролизовали фукоидан, не имели в своем составе a-L-фукозидазы. Этот факт скорее составляет исключение из правила, согласно которому чаще всего в полисахарид-гидролазные ферментные системы организмов включены, наряду с гликаназами, и родственные им гликозидазы. _ Вероятно, дальнейшую деполимеризацию фукоидана выполняют другие микроорганизмы (синтезирующие фукозидазы, сульфатазы и др.) того микробного сообщества, откуда выделены эти штаммы. Способность синтезировать сульфатазу была отмечена только у бактерий, выделенных из P. yessoensis: КММ 157, КММ 280, КММ 327.
Известно, что штаммы P. citrea, обитающие в Японском море, по своим эпигенетическим (фенотипическим) признакам очень разнообразны. Фенокопии сильно отличались друг от друга (и от типового штамма) по макроморфологии и многим морфологическим свойствам (Ivanova, et аЦ 1998). Полученные результаты также позволяют предположить, что синтез О-гликозилгидролаз (фукоиданаз, (3-N-ацетилглюкозаминидаз или а-галактозидаз) является внутривидовым отличительным признаком штаммов P. citrea, который зависит от происхождения штамма, т.е. от проявления (не существенных с точки зрения молекулярной таксономии) геномных особенностей в месте обитания штамма, и обусловлен его физиологической ролью в определенном сообществе организмов и давлением окружающей среды (экофизиологией штамма).
Косвенным подтверждением этому предположению могут служить сведения о том, что, например, способность гидролизовать фукоидан связана в большей мере не с таксономическим положением штамма, а с иными причинами. По-видимому, гидролиз фукоидана осуществляют не только различные протеобактерии: P. citrea, Vibrio sp., но также и микроорганизмы Cytophaga-Bacteroides-Flavobacterium-Flexibacter (Cytophaga sp., Flavobacterium sp. - другого типа домена Bacteria (Бакунина и др., 2000; Gonzalez, Weiner, 2000).
Влияние компонентов питательной среды на синтез альгинолитических ферментов
Вероятно, для успешного гидролиза альгиновой кислоты морской бактерии Р. citrea КММ 3297 необходимо наличие всех трех ферментов. Подобный эффект ранее наблюдали при совместном действии на полиманнуроновую кислоту двух альгинат-лиаз ALY и ALYII из Pseudomonas sp. OS-ALG-9 (Kraiwattanapong et al., 1999a).
Константы Михаэлиса-Ментен {K ) были определены для альгинат-лиаз АлІ и АлШ по отношению к полигулуроновой и полиманнуроновой кислотам. Альгинат-лиаза АлІ имеет практически одинаковое сродство к поли-Г- и к поли-М-блокам (Кт 24 мкг/мл и 34 мкг/мл, соответственно). Альгинат-лиаза АлШ "предпочитает" поли-Г- (40,0 мкг/мл) в большей мере, чем поли-М-блоки (Кт 130,0 мкг/мл) (рис. 31).
Многие альгинат-лиазы из грамотрицательных бактерий проявляют специфичность только по отношению к поли-М-, и только некоторые к поли-Г-блокам (Wong et al., 2000). Альгинат-лиазы смешанной, ГМ- или МГ-специфичности обнаружены в штаммах морских бактерий п 8 и 9 (Minet al., 1977а) и Alteromonas Н-4, позже идентифицированной как Pseudoalteromonas elyakovii (Sawabe, 2000). По своим филогенетическим свойствам последняя является близкородственной исследуемой нами P. citrea (Mikhailov et al., 2002). Возможно, что исследуемые нами альгинат-лиазы, также представляют собой ферменты смешанной специфичности. 1. Изучено распространение фукоидан-деградирующих ферментов среди 25 штаммов морских бактерий-эпифитов бурых водорослей F. evanescens и С. filum и 53 бактерий-изолятов голотурии A. japonicus. Показано, что 18 исследованных экстрактов штаммов бактериальных эпифитов бурых водорослей (72%) и 39 бактерий-ассоциантов голотурии (74%) катализировали деградацию фукоиданов. Высокая активность фукоиданаз отмечена для бактерий-эпифитов рода Cytophaga и бактерий родов Alteromonas/Pseudoalteromonas. Штаммы Pseudoalteromonas citrea КММ 3296 и КММ 3298, выделенные из бурых водорослей L cichorioides и С. filum, соответственно, и КММ 3297 (ассоциант голотурии A. japonicus) выбраны в качестве продуцентов фукоиданаз. 2. Изучен состав О-гликозилгидролаз 12 штаммов P. citrea, в том числе типового штамма АТСС 29719т, выделенных из разных морских организмов. Показано, что фукоиданазы синтезируются штаммами, изолированными из организмов богатых фукоиданами, и могут служить экофизиологической характеристикой данного вида бактерий. Ф 3. Установлено, что фукоиданазы штаммов P. citrea КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298 действуют на фукоиданы при рН 6,5-7,0, сохраняют активность до 40-50С. Ферменты этих штаммов катализируют гидролиз фукоиданов из L. cichorioides (1- 3-а-Ь-фукана) и F. evanescens (1—»3; 1— 4-ос-Ь-фукана) по эндо-типу с образованием сульфатированных фукоолигосахаридов. В фукоолигосахаридах, продуктах действия фукоиданазы из P. citrea КММ 3296 на фукоидан из F. evanescens, преобладают а-1—»4-связанные остатки фу козы. По всей видимости, этот фермент катализирует гидролиз доступных а-1— 3-0-гликозидных связей и является 1—»3-а-Ь-фуканазой. 4. Показано, что морская бактерия P. citrea КММ 3297, ассоциант голотурии A. japonicus, выращенная на среде, содержащей глюкозу, синтезирует 2 внутриклеточных альгинолитических фермента АлІ, АлІІ. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens индуцирует биосинтез еще одного альгинолитического фермента АлШ. 5. Показано, что изученные альгинолитические ферменты имеют оптимумы рН 7-8 и полностью сохраняют активность до 35С (Ал!) и 45С (АлІІ, АлШ). Молекулярные массы ферментов АлІ, АлІІ и АлШ составляют 25, 79 и 61 кДа, соответственно. Ионы Na+ (0,2 М) и Mg2+ (0,01 М) активируют эти ферменты более, чем в 2 раза. Кт для АлІ по поли-Г и поли-М-блокам альгиновой кислоты сопоставимы и составляют 24 и 34 мкг/мл, соответственно. Альгинат-лиаза АлШ имеет большее сродство к поли-Г- (Кт - 40,0 мкг/мл), чем к поли-М-блокам (Кт -130,0 мкг/мл). 6. Все исследуемые альгинолитические ферменты являются альгинат-лиазами эндо-типа действия и деградируют полигулуроновую и полиманнуроновую кислоты до олигосахаридов со степенью полимеризации 5 п 3, имеющих на невосстанавливающем конце моносахаридные остатки с ненасыщенной связью между С4 и С5 атомами. Смесь всех трех ферментов альгинолитического комплекса P. citrea КММ 3297 проявляет синергический эффект при действии на полимерный субстрат. Наличие нескольких альгинолитических ферментов и фукоиданазы в одном организме обеспечивает эффективную деструкцию полианионных полисахаридов бурых водорослей бактерией P. citrea КММ 3297.
