Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Миколитическая активность сапротрофных почвенных бактерий как одно из проявлений антагонизма к мицелиальным грибам 10
1.2. Природа миколитической активности и строение клеточной стенки грибов 12
1.3. Характеристика миколитических ферментов бактерий и данные об их роли в антагонизме к почвенным микромицетам 19
1.3.1.Ферменты, гидролизующие хитин и хитозан 20
1.3.2. |3-1,3-глюканазы и родственные ферменты 31
1.3.3. Ферменты, гидролизующие компоненты матрикса клеточной стенки грибов 35
1.4. Сравнительная оценка роли ферментов и метаболитов бактерий
Bacillus в механизмах лизиса и подавления роста микромицетов...37
1.5 Перспективы применения миколитических ферментов Bacillus Cohn в защите растений от болезней и других областях...40
2. Объекты и методы исследований 45
2.1. Бактериальные культуры 45
2.2. Культуры грибов 46
2.3. Физико-химические методы 46
2.3.1. Получение коллоидного хитина 46
2.3,2.Получение коллоидного хитозана 47
2.3.3.Получение других источников углерода 47
2.4. Определение антигрибной активности бацилл в смешанной культуре с фитопатогенными и сапротрофными грибами 48
2.5. Оценка антигрибной активности ферментов и метаболитов бактерий Bacillus Cohn 49
2.6. Методы измерения активности миколитических ферментов 50
2.6.1. Определение общей миколитической активности 50
2.6.2. Определение хитиназной активности 51
2.6.3. Определение хитозаназной активности 52
2.6.4. Определение Р-1,3-глюканазной (ламинариназной) активности 52
2.6.5. Определение общей протеазной активности 52
2.7. Оценка литического воздействия ферментов бактерий Bacillus на клеточные стенки и интактный мицелий микромицетов 53
2.8. Микроскопия 53
2.9. Методы выделения и очистки миколитических ферментов 54
2.9.1. Осаждение сульфатом аммония 54
2.9.2. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-носителях 55
2.9.3. Аффинная адсорбция на коллоидном хитине 55
2.9.4. Хроматография на тойоперле HW-50 56
2.9.5. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях 56
2.10. Методы выделения, очистки и идентификации метаболитов с антигрибной активностью 57
2.10.1. Ультрафильтрация 57
2.10.2. Осаждение ацетоном 57
2.10.3. Хроматография на бумаге и в тонком слое ... 58
2.10.4. Гель-хроматография на тойоперле HW-40 58
2.10.5. Аминокислотный анализ 58
2.11. Определение концентрации белка 58
2.12. Статистическая обработка результатов 59
3. Отбор продуцентов миколитических ферментов из коллекции бацилл-антагонистов и исследование их миколитической активности 60
3.1. Основные критерии отбора штаммов 60
3.2. Действие отобранных штаммов бацилл-антагонистов и их метаболитов на рост и развитие Bipolaris sorokiniana в смешанной жидкой культуре 63
3.3. Синтез миколитических ферментов бактериями-антагонистами в совместной культуре с микромицетами 73
3.4. Миколитическая и фунгистатическая активность внеклеточных метаболитов бактерий Bacillus spp 78
4. Сравнительная характеристика основных миколитических ферментов антагонистических штаммов бактерий ва cill us cohn 80
4.1. Характеристика отобранных штаммов Bacillus Cohn по уровню и спектру синтезируемых ферментов 80
4.2. Изучение взаимосвязи между миколитической активностью и синтезом внеклеточных ферментов у бацилл-антагонистов 84
4.3. Особенности выделения и очистки миколитических ферментов...88
4.3.1. Хитиназа ...90
4.3.2. Хитозаназа 93
4.3.3. Р~1,3-глюканаза (ламинариназа) 95
4.3.4. Общая протеазная активность бактерий-антагонистов 96
4.4. Характеристика основных физико-химических и каталитических свойств миколитических ферментов ряда бактерий Bacillus 98
4.5. Сравнительная характеристика миколитической активности бациллярного ферментного комплекса и его индивидуальных компонентов 100
4.6. Взаимодействие миколитических ферментов бацилл-антагонистов при гидролизе клеточных стенок микромицетов 106
5. Взаимодействие миколитических ферментов и вторичных метаболитов бацилл - антагонистов почвенных микромицетов 109
5.1. Общая характеристика антигрибных веществ, продуцируемых штаммами бацилл-антагонистов 109
5.2. Выделение и свойства низкомолекулярных метаболитов бактерий Bacillus Cohn 113
5.3. Антигрибная активность миколитических ферментов бацилл 117
5.4. Взаимодействие миколитических ферментов и вторичных метаболитов антибиотической природы 119
Заключение 125
Выводы 128
Список литературы 129
- Природа миколитической активности и строение клеточной стенки грибов
- Оценка антигрибной активности ферментов и метаболитов бактерий Bacillus Cohn
- Действие отобранных штаммов бацилл-антагонистов и их метаболитов на рост и развитие Bipolaris sorokiniana в смешанной жидкой культуре
- Изучение взаимосвязи между миколитической активностью и синтезом внеклеточных ферментов у бацилл-антагонистов
Введение к работе
В разработке современных методов биологической борьбы с фитопато-генными грибами большое значение имеют исследования процессов микробного антагонизма. Среди почвенных бактерий-антагонистов перспективными агентами биологического контроля фитопатогенов являются бактерии Bacillus Cohn. Бациллы широко распространены в почве и обладают такими преимуществами, как легкость выделения, быстрый рост на относительно простых питательных средах, возможность культивирования в промышленных масштабах для получения биомассы, ферментов, биологически активных веществ и других технологических препаратов.
Актуальность темы. Создание эффективных препаратов биологического контроля грибных фитопатогенов является одной из актуальных задач современной микробиологии. По мнению многих исследователей, одним из ключевых элементов таких препаратов может быть миколитическая активность внеклеточных ферментов бактерий, например, хитиназы. В антагонизме бактерий рода Bacillus к почвенным микромицетам наиболее изучена роль антибиотических веществ, тогда как значение внеклеточных гидролитических ферментов остается не очень ясным, хотя эти ферменты широко распространены у бацилл-антагонистов. Исследование взаимосвязи между синтезом гидролитических ферментов и антагонистической активностью бацилл на примере целой группы штаммов представляет большой интерес и позволит сделать некоторые обобщения практического характера, в том числе и о перспективности направления, связанного с поиском штаммов - продуцентов гидролитических ферментов для биоконтроля фитопатогенов.
Результаты проведенных исследований позволят расширить научные представления о свойствах миколитических ферментов бактерий группы Bacillus, уточнить их роль в антагонизме и в процессах деградации грибного мицелия в почве и оценить перспективы применения бактериальных продуцентов миколитических ферментов в борьбе с болезнями культурных растений.
Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы являлось изучение роли внеклеточных гидролитических ферментов бактерий Bacillus Cohn, таких как хитиназа, хитозаназа, 3-1,3-глюканаза и протеаза, в антагонизме к фитопатогенным грибам. В соответствии с этим были определены следующие задачи:
1. Провести отбор наиболее активных продуцентов миколитических ферментов среди бацилл - антагонистов фитопатогенных грибов из коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН;
2. Определить миколитическую активность как комплекса, так и индивидуальных внеклеточных ферментов бацилл (хитиназа, хитозаназа, протеаза и Р-1,3-глюканаза);
3. Оценить антигрибную активность индивидуальных миколитических ферментов бактерий Bacillus in vitro;
4. Изучить взаимодействие комплекса миколитических ферментов бацилл-антагонистов с вторичными метаболитами антибиотической природы.
Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование взаимосвязи миколитической и антигрибной активности бацилл-антагонистов, как на уровне отдельных штаммов, так и у групп бактерий, отличающихся по своим свойствам. В последнем случае показано, что способность бацилл подавлять рост фитопатогенных грибов не коррелирует с их общей миколитической и хи-тиназной активностью. Изучена антигрибная и миколитическая активность очищенных хитиназы, хитозаназы, Р-1,3-глюканазы и протеазы нескольких штаммов бацилл. Наибольшую активность в гидролизе компонентов клеточных стенок грибов проявляют хитиназа и Р-1,3-глюканаза. Установлена ключевая роль Р 1,3-глюканазы Bacillus sp. 739 (ИБ-30) в лизисе нативного мицелия фитопатогенных грибов. Показано, что миколитические ферменты бацилл проявляют низкую собственную антигрибную активность (хитиназа) или не имеют таковой (протеаза). Участие хитиназы и Р-1,3-глюканазы бацилл в антагонизме подтверждено при комплексном воздействии на микромицеты совместно с вторичными метаболитами бацилл. Впервые для бактерий Bacillus показано усиле ниє антигрибной активности их антибиотических веществ в комплексе с мико-литическими ферментами на 15-70%. В ходе работы у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30) обнаружен новый антигрибной белок неферментной природы с Mw 14,000.
Практическая значимость. Установлены индивидуальные особенности продукции миколитических ферментов штаммами бацилл - антагонистов, что имеет значение для разработки технологии получения ферментных препаратов в лабораторных и промышленных условиях. Отобраны штаммы — наиболее перспективные продуценты миколитических ферментов и антибиотических веществ. Штамм Bacillus sp. 739 запатентован как продуцент комплекса хити-нолитических ферментов и ламинариназы (Патент РФ № 2213773).
Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 6-й и 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003), Первой Всероссийской интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем» (Уфа, 2002), Первом Международном конгрессе Европейского микробиологического общества FEMS (Любляна, Словения, 2003), 7-й Международной конференции Российского хитинового общества «Современные перспективы в исследовании хитина и хито-зана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 10 работ, включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), объекты и методы исследований (1 глава), результаты и их обсуждение (3 главы), заключение, выводы и список литературы, включающий 203 ссылки, из них 33 на русском языке. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста и содержит 41 рисунок и 15 таблиц.
Природа миколитической активности и строение клеточной стенки грибов
Лизис различных микромицетов почвенными бактериями был описан еще в 1930-х гг. отечественными и зарубежными учеными (R.H. Bamberg, 1931; D.E. Johnson, 1931; Я.П. Худяков, 1935). Именно тогда было положено начало исследованиям данного явления, как одного из типов антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами, который может успешно применяться для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов (Д.М. Новогрудский, 1936). До этого времени внимание на лизис грибов под действием бактерий обращали в основном микологи в связи с проблемой бактериального заражения чистых культур в условиях лаборатории (D.E. Johnson, 1931).
R. Mitchell и М. Alexander (1961, 1962) изучали миколитическую активность почвенных бактерий как один из возможных способов биологического контроля фитопатогенных грибов в условиях почвенного ценоза. Позднее различными исследователями была подтверждена возможность успешного применения почвенных миколитических бактерий для защиты различных сельскохозяйственных культур от болезней, вызываемых грибами (D.A. Davies, A.M. Pope, 1978; I. Chet, J. Inbar, 1994; A.R. Podile, A.P. Prakash, 1996; S. Pleban et al., 1997).
Уже на начальном этапе исследований ученые указывали на различные случаи антагонистических взаимоотношений между грибами и бактериями, разделяя такие явления как лизис и угнетение развития одного микроорганизма другим (C.L. Porter, 1924, Я.П. Худяков, 1935). Современные взгляды на антагонизм к микромицетам и различные варианты его проявления сформировались в 1960-70-е гг. и связаны с работами многих, как отечественных, так и зарубежных исследователей. Основываясь на данных различных авторов, можно, весьма условно, выделить несколько типов антагонистических взаимоотношений: 1) конкуренция за источники питания; 2) продукция антибиотиков и (или) токсических веществ неспецифического действия; 3) синтез ферментов, разрушающих клеточные стенки грибов. При конкуренции за источники углерода и энергии, быстро растущие микроорганизмы интенсивнее потребляют субстрат, ограничивая тем самым рост других, нуждающихся в тех же источниках питания. Образование при этом токсичных веществ неспецифического действия, например органических кислот, микробных ядов (производные синильной кислоты), летучих соединений (аммиак и др.) менее характерно для бацилл по сравнению, например, с бактериями рода Pseudomonas. В антагонизме бактерий Bacillus к микромицетам доминирующая роль, по всей видимости, принадлежит соединениям антибиотической природы, число которых к настоящему времени превышает 200. Угнетение роста грибов без видимого изменения в их структуре, свойственное действию многих штаммов-антагонистов, зачастую не характерно для бацилл, активно лизирующих мице-лиальные грибы. Такие штаммы рассматриваются как типично миколитические (R. Mitchell, М. Alexander, 1961, 1962; Ю.М. Возняковская, А.К. Труфанова, 1988). В свое время, рассматривая различные проявления грибного антагонизма, некоторые исследователи большее значение придавали антибиотическим веществам, продуцируемым микробами-антагонистами (D. Hornby, 1978; Г.С. Муромцев, И.И. Черняева, 1980), другие считали главным условием в борьбе за выживаемость фитопатогенов в почве конкуренцию за питательные вещества (K.F. Baker, 1968; Т.Г. Мирчинк, О.Е. Марфенина, 1975; J.L. Lockwood, 1986). Позднее были получены результаты, показывающие, что проявление различных типов антагонистических взаимоотношений определяется внешними факторами, в первую очередь количеством доступных питательных веществ (Ю.М. Возняковская, А.К. Труфанова, 1988). При избытке последних, в среде, обильно заселенной бактериями, главным фактором подавления прорастания спор фитопатогенов становится конкуренция за питательные вещества. При небольшом количестве бактерий в среде и недостатке питательных веществ, как это имеет место в малоплодородной почве, проявляются антагонистические свойства бактерий и их способность лизировать гифы гриба. Отечественными учеными было установлено, что миколитическая активность бактерий в почвах зависит от различных условий, в том числе, от типа и влажности почвы, ее утомленности монокультурой, возраста гриба и его таксономической принадлежности, вида бактерий и т.п. (Я.П. Худяков, 1935). Это показывает, что миколитическая активность, являясь одним из важнейших типов антагонизма сапрофитных бактерий к почвенным микромицетам, в то же время представляет собой явление комплексного характера, которое нельзя объяснить действием какого-либо одного фактора. H.-S. Lim et al. (1991) определяют миколизис как потерю протоплазмы клеточными структурами грибных гиф и ферментативное растворение клеточных стенок. Однако первый процесс может протекать как следствие второго. Поэтому такое определение, скорее всего, подчеркивает, что бактериальный лизис грибов как совокупное явление может иметь различные механизмы. Наиболее распространенной является точка зрения о ферментативном характере миколитических процессов в почве, что подкрепляется достаточным количеством экспериментальных данных в этой области, начиная с работы D.E. Johnson (1931) по механизму лизиса Ustilago. Визуально процесс лизиса грибного мицелия бактериями подробно описан Я.П. Худяковым (1935) у грибов рода Fusarium. Позже К. Horikoshi и S. Iida (1958) показали, что внеклеточные ферменты штамма Bacillus circulans, лизирующего клетки Aspergillus oryzae, также вызывают лизис живого мицелия этого и близких видов грибов. Литиче-ское действие ферментов В. circulans на клеточные стенки A. oryzae было подтверждено авторами с помощью биохимических методов и электронной микроскопии. J.J. Skujins el al. (1965) наблюдали растворение клеточных стенок гри бов под действием хитиназ и 3-1,3-глюканаз Streptomyces. Y. Tsujisaka et al. (1975) описали эффективный лизис клеточных стенок Rhizopus ферментами бактерии Bacillus R-4. Сходное действие, кроме бактерий Bacillus, было установлено для внеклеточных ферментов из Myxobacter, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas, Streptomyces и др. (A. Hedges, R.S. Wolfe, 1974; M. Vrsanska el al., 1977; H.-S. Lim et al., 1991; A. Romaguera et al., 1993; R. Gupta et al., 1995). У ферментов Arthrobacter globiformis и В. circulans WL-12 обнаружена также дрожжелитиче-ская активность (D. Blechschmidt et al., 1982; Tanaka, Phaff, 1965; Rombouts, Phaff, 1976). Активно лизируют клетки грибов также ферменты микопаразити-ческих грибов родов Aphanocladium, Gliocladium, Trichoderma (Vasseur et al., 1990; A. Di Pietro et al., 1993; M. Lorito et al., 1993).
Многими исследователями была показана различная чувствительность к лизису у различных видов и родов грибов (K.R. Thomas et al., 1979; S. Harish et al., 1998), что связано с разнообразием компонентного состава их клеточной стенки. Поэтому для ее эффективного гидролиза необходимо действие определенного набора гидролитических ферментов. В литературе эти ферменты называют миколитическимщ а в зарубежных источниках также - cell wall-degrading enzymes (М.Т. Esquerreugaye, 2000). Большое значение в устойчивости различных грибов к действию ферментов и лизису имеет присутствие меланина и других пигментов в составе клеточной стенки (B.J. Bloomfleld, М. Alexander, 1967; M.S. Berthe, R. Bonaly, 1976).
Оценка антигрибной активности ферментов и метаболитов бактерий Bacillus Cohn
Индукция хитиназной активности у В. subtilis AF1 была подтверждена S. Harish et al. (1998), однако, авторами не было показано, что эта активность связана с белками, подавляющими рост грибов. Кроме того, авторы не показали, индуцируется ли синтез хитиназы В. subtilis AF в смешанной культуре гриба и антагониста, что могло бы служить доказательством участия этого фермента в антагонизме.
S. Pleban et al. (1997), обнаружив подавление прорастания спор Fusarium oxysporum f. sp. meloni под действием препарата неочищенной хитиназы эндо-фитной бактерии В. сегеш, показали, что мутантные штаммы В. cereus, дефективные по этому ферменту, не оказывают антигрибного эффекта in vitro и in vivo. Тем не менее, роль данной хитиназы в биологическом контроле фитопато-генов, по мнению авторов, требует уточнения.
Е. Frandberg и J. Schmirer (1998), изучая антигрибную активность большой группы хитинолитических бактерий, выделенных из семян злаков, показали отсутствие корреляции между хитиназной активностью бактерий и степенью подавления роста грибов. При этом только 4 % штаммов проявляли фунгиста-тическую активность (все активные изоляты относились к роду Streptomyces).
K.V. Thara и S.S. Gnanamanickam (1994) также не обнаружили корреляции между хитиназной активностью бактерий-антагонистов и степенью подавления развития ризоктониоза в опытах на растениях риса.
Аналогичные результаты были получены для различных видов хитиноли-тических почвенных бактерий W. De Boer et al. (1998).
С другой стороны, S.-L. Wang et al. (2002), в опытах in vitro показали ин-гибирующее влияние очищенных хитиназ В. amyloliquefaciens V656 на рост Fusarium oxysporum.
Таким образом, сведения о роли хитиназ в антагонизме бацилл к грибам являются во многом противоречивыми и до конца невыясненными. Это характерно и для других сапротрофных бактерий, среди которых наиболее активными продуцентами хитиназ являются Serratia marcescens (J. Monreal, E.T. Reese, 1969; Д.В. Юсупова и др., 1997), представители родов Streptomyces (Н.А. Тиу-нова, 1989; A. Romaguera et al., 1993; R. Gupta et al., 1995; Н.Ю. Татаринова и др., 1996), Pseudomonas (H.-S. Lim et al., 1991; N.B. Andreeva et al., 1996; S.-L. Wang, W.T. Chang 1997) и Vibrio (B.L. Bassler et al., 1991).
Согласно результатам, полученным W. Roberts и С. Selitrennikoff (1988), бактериальные хитиназы значительно отличаются от растительных по своей антигрибной активности и специфичности. К примеру, тестируемые ферменты из S. marcescens, Streptomyces griseus и Pseudomonas stutzeri оказались экзохи-тиназами и не оказывали эффекта на рост тест-грибов, таких как Trichoderma reesei и Phycomyces blackesleeanus. В то же время, хитиназы из семян пшеницы, ячменя и кукурузы представляли собой эндоферменты и значительно подавляли удлинение гифов этих грибов. Эффективная ингибирующая концентрация растительных хитиназ была меньше таковой для бактериальных ферментов в 10M0J раз. Аналогичные результаты были получены для очищенной экзохити-назы Bacillus sp. 739 (А.И. Мелентьев и др., 2001).
Однако, подобное обобщение, основанное на различиях в механизме действия хитиназ, представляется неправильным. В первую очередь, потому, что как бациллы (К. Sakai et al., 1998; N. Mabuchi, Y. Araki, 2001; S.-L. Wang et al., 2002), так и другие почвенные бактерии, наряду с экзохитиназами, синтезируют эндохитиназы (М. Brurberg et al., 1996; О.В. Порфирьева и др., 1997). Кроме того, в аналогичных экспериментах у некоторых бактериальных хитиназ была обнаружена антигрибная активность (Д.В. Юсупова и др., 1997). Более существенным свидетельством функциональной специфичности бактериальных и растительных хитиназ является их различие на молекулярном уровне. Исследования бактериальных хитиназ, проводившиеся Н. Blaak et al. (1993) и Т. Watanabe et al. (1993), показали наличие в их структуре специфического фрагмента (домен фибронектинового типа III) и косвенным образом поддержали точку зрения W. Roberts и С. Selitrennikoff. Таким образом, принципиальное отличие бактериальных и растительных хитиназ заключается в особенностях их первичной и третичной структуры, что, в конечном счете, влияет на их специфичность.
Однако недавно у Streptomyces griseus была обнаружена хитиназа, первичная структура которой соответствует структуре растительных хитиназ из семейства 19 (Y. Itoh et al., 2003). Присутствие антигрибной активности у этого фермента поддерживает мнение, что она в большей степени свойственна растительным хитиназам. Одновременно аналогичный тип хитиназы был обнаружен у бактерии Aeromonas sp. No. 10S-24 (M. Ueda et al., 2003). Эти данные показывают, что у бактерий могут встречаться хитиназы, близкие по своей структуре ферментам растений. С другой стороны, не все растительные хитиназы проявляют антигрибную активность (С. Lawrence et al., 1996; A. Kasprzevska, 2003).
Имеется также много работ, которые, напротив, доказывают участие хи-тинолитических ферментов в антагонизме и биоконтроле.
Например, A. Ordentlich et al. (1988) связывают снижение развития болезни, вызываемой Sclerotium rolfsii у семян бобовых, в присутствии S. marcescens с высокой хитиназной активностью этой бактерии. R. Shapira et al. (1989) клонировали ген хитиназы S. marcescens в E. coli, и обнаружили, что продукт экспрессии эффективно подавляет развитие болезни, вызываемой S. rolfsii у бобовых и R. solani у хлопчатника в условиях теплицы.
J. Inbar и I. Chet (1991) показали участие хитиназы Aeromonas caviae в биоконтроле почвенных фитопатогенов в ризосфере хлопчатника. Исследованиями H.-S. Lim et al. (1991) и Н.Ю. Татариновой и др. (1996) выявлено участие хитиназ Pseudomonas stutzeri и Streptmyces kurssanovii в биологическом контроле возбудителей корневых гнилей Fusarium solani и F. culmorum.
По мнению R.S. Patil et al. (2000), противоречия в исследованиях антигрибной активности хитиназ различных бактерий могут быть объяснены различием используемых тест-грибов и другими факторами ингибирования. К различной интерпретации полученных результатов может приводить также разнообразие традиционных и современных методов определения антигрибной активности хитиназ (М.В. Howard et al., 2003).
Выводы, касающиеся роли хитиназ в антагонизме почвенных сапротроф-ных бактерий, применимы и к ферментам бацилл, поскольку бактериальные хитиназы имеют много общего в строении и функциях (табл. 1.3).
Хитинолитический комплекс бактерий Bacillus, в отличие от микопарази -тиического гриба Trichoderma harzianum, содержит не все ферменты, необходимые для эффективного гидролиза хитина. Как правило, в данной системе отсутствует N-ацетилглюкозаминидаза, а зачастую - и эндохитиназа. Это может быть причиной отсутствия корреляции между хитиназной активностью и степенью подавления роста грибов. Поэтому хитиназная активность не может служить строгим критерием антагонистических свойств бацилл при скрининге или исследованиях большого количества штаммов. Вероятно, индивидуальные ферменты Bacillus слабее угнетают рост грибов по сравнению с аналогичными ферментами Т. harzianum или высших растений. Тем не менее, бактериальные хитиназы могут быть вовлечены в механизм подавления роста гриба, не угнетая сами его развитие, они способны усиливать действие антибиотических веществ, роль которых в антагонизме бацилл является доминирующей.
Действие отобранных штаммов бацилл-антагонистов и их метаболитов на рост и развитие Bipolaris sorokiniana в смешанной жидкой культуре
В ходе проведенной работы из коллекции института биологии УНЦ РАН были отобраны 26 антагонистических штаммов бактерий рода Bacillus - продуцентов миколитических ферментов. Хитиназную активность проявляли менее 30% коллекционных штаммов-антагонистов, а среди хитинолитических штаммов также лишь 30% проявляли антагонистическую активность к фитопатоген-ным грибам. Эти данные показывают, что способность бактерий Bacillus к синтезу хитиназы как первичный признак не может служить строгим критерием при их скрининге в качестве агентов биологического контроля над фитопато-генными грибами. То же следует сказать о способности к синтезу 0-1,3-глюканазы, хитозаназы и протеазы, которую проявляли все хитинолитические штаммы, тогда как у коллекционных антагонистических штаммов наблюдался только синтез хитиназы и протеазы. Обе группы бактерий отличались также по составу своих хитинолитических ферментов. Если в ферментном комплексе типовых антагонистических штаммов доминировала эндохитиназа, то у хитинолитических штаммов - экзохитиназа (хитобиогидролаза).
При смешанном культивировании с мицелиальными грибами в жидкой среде различные штаммы бацилл-антагонистов оказывали угнетающее и/или лизирующее действие на грибы. В некоторых случаях внешнее проявление действия живой культуры совпадало с результатом действия низкомолекулярных внеклеточных метаболитов (антибиотических веществ) того же штамма (В. subtilis ИБ-54). Однако, как выяснилось, максимальный миколитический эффект некоторых штаммов обеспечивался только при комплексном действии антибиотиков и внеклеточных ферментов, в особенности, (3-1,3-глюканазы и хитиназы. Сами эти ферменты не способны лизировать активно растущий мицелий грибов даже при больших концентрациях (до 10 мг/мл). Участие литиче-ских ферментов в непосредственном воздействии бактериальной культуры на мицелий гриба было обнаружено у штаммов Bacillus sp. 739 (ИБ-30) и Bacillus sp. X-b. В данном эксперименте лизис гиф тест-гриба усиливался с дальнейшим увеличением в питательной среде активности таких ферментов как р-1,3-глюканаза, протеаза и хитиназа. Показано, что в зависимости от возраста культуры гриба В. sorokiniana (время от начала взаимодействия с антагонистом), он способен формировать гифы, устойчивые к действию ферментов и антибиотиков некоторых штаммов бацилл.
Анализ миколитической и антигрибной активности внеклеточных метаболитов 26 штаммов бацилл-антагонистов показал полное отсутствие корреляции между двумя этими характеристиками. Последующие эксперименты подтвердили, что внеклеточная антигрибная активность бацилл главным образом сосредоточена во фракции низкомолекулярных антибиотических веществ (до 90 %) и в большей степени зависит от уровня их концентрации. Остаточная антигрибная активность в той или иной мере связана с действием высокомолекулярных соединений, в том числе миколитических ферментов и белков неферментной природы. Это было подтверждено обнаружением антигрибного белка с молекулярной массой — 14,000 у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30). Однако, ми-колитические ферменты, такие как хитиназа, Р-1,3-глюканаза, хитозаназа и протеаза, не проявляли собственной антигрибной активности при концентрациях 1-10 мг/мл. Для сравнения, по данным литературы, хитиназы из ячменя; пшеницы и кукурузы имеют минимальную ингибирующую концентрацию порядка 1-10 мкг/мл (W. Roberts, С. Selitrennikoff, 1988); для ферментов гриба Trichoderma harzianum Р10 эта цифра составляет 50-250 мкг/мл (М. Lorito et al., 1993). Таким образом, роль миколитических ферментов в непосредственном антигрибном эффекте внеклеточных метаболитов бацилл сведена к нулю. Тем не менее, нами было обнаружено, что различные ферменты в той или иной мере способны усиливать действие антибиотических соединений бацилл-антагонистов. Наибольшее увеличение антигрибной активности наблюдалось при добавлении смеси очищенных миколитических ферментов (65-70 %). Это может восполнять недостающую антигрибную активность (10-20 %) низкомолекулярных антибиотических веществ. Однако, синергичного эффекта, свойст 127 венного совместному действию ферментов и антибиотиков Т. harzianum (Н.А. Маркович, Г.Л. Кононова, 2003) в данном случае не наблюдалось. Миколитическая активность внеклеточных продуктов бацилл, характеризуемая по способности гидролизовать клеточные стенки грибов, зависит от состава их гидролазного комплекса и уровня активности отдельных ферментов. Наиболее активно клеточные стенки грибов разрушались под действием препаратов КЖ бактерий, имеющих полный набор ферментов, включавший хитина-зу, Р 1,3-глюканазу, хитозаназу и протеазу. Очищенные ферменты бацилл были способны воздействовать только на мертвые или нерастущие грибы. При этом основную роль в лизисе интактного (неповрежденного) мицелия играла (3-1,3-глюканаза, тогда как все остальные ферменты, включая хитиназу, гидролизова-ли только измельченный или частично деградированный мицелий. Таким образом, роль миколитических ферментов в антагонизме бактерий Bacillus Cohn к фитопатогенным грибам сводится к взаимодействию с веществами антибиотической природы. Лизис грибного мицелия, как одно из проявлений антагонизма некоторых штаммов бацилл, наблюдаемый при их непосредственном контакте с культурой гриба, представляет собой результат действия либо исключительно антибиотиков (В. subtilis ИБ-54), либо результат совместного действия антибиотиков и миколитических ферментов {Bacillus sp. ИБ-30). 1. Миколитический комплекс бактерий Bacillus Cohn включает Р-1,3-глюканазы, хитиназы, хитозаназы и протеазы. Ключевую роль в лизисе клеточных стенок нативного мицелия ферментами бацилл играет Р-1,3-глюканаза. Роль хитиназы и протеазы в процессе миколизиса носит вспомогательный характер. 2. Индивидуальные ферменты миколитического комплекса бацилл практически не оказывают ингибирующего действия на рост фитопатогенных грибов in vitro, однако, усиливают антигрибную активность вторичных метаболитов на 10-70 %. 3. Лизис почвенных микромицетов, вызываемый бактериями Bacillus Cohn, является результатом взаимодействия антибиотических веществ и ферментов. Доминирующую роль в этом процессе играют антибиотики. 4. Синтез миколитических ферментов, как единственный признак, не может служить строгим критерием антагонистических свойств Bacillus Cohn, поскольку доля низкомолекулярных веществ неферментной природы в проявлении антигрибной активности составляет 70-90 %. 5. У штамма Bacillus sp. 739, представителя группы миколитических бактерий, обнаружен, выделен и частично охарактеризован антигрибной белок неферментной природы с Mw 14,000.
Изучение взаимосвязи между миколитической активностью и синтезом внеклеточных ферментов у бацилл-антагонистов
Анализ миколитической и антигрибной активности внеклеточных метаболитов 26 штаммов бацилл-антагонистов показал полное отсутствие корреляции между двумя этими характеристиками. Последующие эксперименты подтвердили, что внеклеточная антигрибная активность бацилл главным образом сосредоточена во фракции низкомолекулярных антибиотических веществ (до 90 %) и в большей степени зависит от уровня их концентрации. Остаточная антигрибная активность в той или иной мере связана с действием высокомолекулярных соединений, в том числе миколитических ферментов и белков неферментной природы. Это было подтверждено обнаружением антигрибного белка с молекулярной массой — 14,000 у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30). Однако, ми-колитические ферменты, такие как хитиназа, Р-1,3-глюканаза, хитозаназа и протеаза, не проявляли собственной антигрибной активности при концентрациях 1-10 мг/мл. Для сравнения, по данным литературы, хитиназы из ячменя; пшеницы и кукурузы имеют минимальную ингибирующую концентрацию порядка 1-10 мкг/мл (W. Roberts, С. Selitrennikoff, 1988); для ферментов гриба Trichoderma harzianum Р10 эта цифра составляет 50-250 мкг/мл (М. Lorito et al., 1993). Таким образом, роль миколитических ферментов в непосредственном антигрибном эффекте внеклеточных метаболитов бацилл сведена к нулю. Тем не менее, нами было обнаружено, что различные ферменты в той или иной мере способны усиливать действие антибиотических соединений бацилл-антагонистов. Наибольшее увеличение антигрибной активности наблюдалось при добавлении смеси очищенных миколитических ферментов (65-70 %). Это может восполнять недостающую антигрибную активность (10-20 %) низкомолекулярных антибиотических веществ. Однако, синергичного эффекта, свойст венного совместному действию ферментов и антибиотиков Т. harzianum (Н.А. Маркович, Г.Л. Кононова, 2003) в данном случае не наблюдалось.
Миколитическая активность внеклеточных продуктов бацилл, характеризуемая по способности гидролизовать клеточные стенки грибов, зависит от состава их гидролазного комплекса и уровня активности отдельных ферментов. Наиболее активно клеточные стенки грибов разрушались под действием препаратов КЖ бактерий, имеющих полный набор ферментов, включавший хитина-зу, Р 1,3-глюканазу, хитозаназу и протеазу. Очищенные ферменты бацилл были способны воздействовать только на мертвые или нерастущие грибы. При этом основную роль в лизисе интактного (неповрежденного) мицелия играла (3-1,3-глюканаза, тогда как все остальные ферменты, включая хитиназу, гидролизова-ли только измельченный или частично деградированный мицелий.
Таким образом, роль миколитических ферментов в антагонизме бактерий Bacillus Cohn к фитопатогенным грибам сводится к взаимодействию с веществами антибиотической природы. Лизис грибного мицелия, как одно из проявлений антагонизма некоторых штаммов бацилл, наблюдаемый при их непосредственном контакте с культурой гриба, представляет собой результат действия либо исключительно антибиотиков (В. subtilis ИБ-54), либо результат совместного действия антибиотиков и миколитических ферментов {Bacillus sp. ИБ-30). 1. Миколитический комплекс бактерий Bacillus Cohn включает Р-1,3-глюканазы, хитиназы, хитозаназы и протеазы. Ключевую роль в лизисе клеточных стенок нативного мицелия ферментами бацилл играет Р-1,3-глюканаза. Роль хитиназы и протеазы в процессе миколизиса носит вспомогательный характер. 2. Индивидуальные ферменты миколитического комплекса бацилл практически не оказывают ингибирующего действия на рост фитопатогенных грибов in vitro, однако, усиливают антигрибную активность вторичных метаболитов на 10-70 %. 3. Лизис почвенных микромицетов, вызываемый бактериями Bacillus Cohn, является результатом взаимодействия антибиотических веществ и ферментов. Доминирующую роль в этом процессе играют антибиотики. 4. Синтез миколитических ферментов, как единственный признак, не может служить строгим критерием антагонистических свойств Bacillus Cohn, поскольку доля низкомолекулярных веществ неферментной природы в проявлении антигрибной активности составляет 70-90 %. 5. У штамма Bacillus sp. 739, представителя группы миколитических бактерий, обнаружен, выделен и частично охарактеризован антигрибной белок неферментной природы с Mw 14,000.
