Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
Распределение и роль гидролитических ферментов морских бактерий 9
2. Гидролитические ферменты, модифицирующие полисахариды 10
2.1. Специфичность и механизм действия гликозидгидролаз 11
2.2. Классификациягликозидгидролаз. 13
2.3. Субстраты о-гликозидгидролаз 15
2.4. А-галактозидазы. 17
2.4.1. Распределение и физиологическая роль а-галактозидаз. 18
2.4.2. Генетическая регуляция биосинтеза а-галактозидаз . 20
2.4.3. Молекулярные и каталитические свойства а-галактозидаз. 22
2.4.4. Структурно-функциональные особенности а-галактозидаз. 26
3. Гидролитические ферменты, модифицирующие Полинуклеотиды. 29
3.1. Классификация и механизм действия нуклеаз 29
3.2. Субстраты нуклеаз 35
3.3. Щелочные фосфатазы. 37
3.3.1. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз 38
3.3.2. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз 41
3.3.3. Молекулярные и каталитические свойства щелочных фосфатаз 45
3.3.4. Структурно-функциональные особенности щелочных фосфатаз 53
Ii. Материалы и методы исследования 57
Iii. Результаты исследования и их обсуждение 79
Скрининг о-гликозидгидролаз и щелочных фосфатаз в морских бактериях и характеристика штаммов 79
2. А- галактозидаза из морской бактерии pseudoalteromonassp . 83
2.1. Выделение и очистка а-галактозидазыpseudoalteromonassp. 83
2.2. Молекулярные и ферментативные свойства а-галактозидазы pseudoalteromonas sp. 90
2.3. Первичная структура а-галактозидазы pseudoalteromonas sp. 97
2.4. Вторичная структура а-галактозидазы pseudoalteromonas sp. 104
2.5. Структурные особенностиа-галактозидаз 27 и 36 семейств 106
2.6. Моделирование пространственной структуры а-галактозидазы pseudoalteromonas sp. 107
2.7. Филогенетический анализ а-галактозидаз по
3. Щелочная фосфатаза из морской бактерии советы marina 114
3.1. Выделение и очистка щелочной фосфатазы советы marina 114
3.2. Молекулярные и ферментативные свойства щелочной фосфатазы советы marina 117
3.3. Первичная структура щелочной фосфатазы советы marina 126
3.4. Пространственная структура щелочной фосфатазы советы marina 138
3.5. Экспрессия щелочной фосфатазы советы marina 148
3.6. Филогенетический анализ щелочных фосфатаз 150
Выводы 152
Список литературы 154
- Специфичность и механизм действия гликозидгидролаз
- Генетическая регуляция биосинтеза а-галактозидаз
- Классификация и механизм действия нуклеаз
- галактозидаза из морской бактерии pseudoalteromonassp
Введение к работе
Морские микроорганизмы всегда были и будут объектом фундаментальных исследований в самых разных областях науки. Несмотря на то, что Океан еще мало изучен, очевидно, что именно морская микробиота играет ключевую роль в классической цепи круговорота энергии и вещества, превращая их в источники необходимых элементов на высших трофических уровнях [1]. Другими словами, микробиота обладает набором таких биологических инструментов, как экзо- и эндоферменты, которые участвуют во всех биохимических процессах, - от синтеза простейших органических соединений до деградации и утилизации высокомолекулярных органических остатков в морской воде (ДНК, РНК, белков, полисахаридов) (Рис.1). К тому же ферменты морских микроорганизмов в процессе эволюции были адаптированы к условиям крайних значений температур, давления, солнечной энергии, концентрации солей и дефицита источников питания [2-4]. Эти факты являются краеугольным камнем в понимании структурно-функциональных особенностей макромолекул, производимых морскими микроорганизмами. В целом, изучение молекулярно-генетического состава любой морской бактерии вносит определенный вклад в понимание процессов метаболизма, физиологии, механизмов адаптации всех участников биологического сообщества. Более того разнообразие генетического материала в морской среде, его эволюционная динамика и пластичность, участие в экологических процессах оказывает глобальный эффект на скорость круговорота энергии и материи в океане равно как и на биогеохимический
круговорот, состав атмосферы и
Classic food chain
Microbial food web
климат Земли в целом [5-6].
На сегодняшний день изучены свойства, клонированы гены и определены структуры большого количества ферментов наземных бактерий, грибов и растений, среди которых около 30% составляют гидролазы. Данные о структурах и функциях таких же ферментов из морских
Suilifjht
Рис. 1. Роль морской микробиоты в круговороте веществ.
объектов практически отсутствуют, а было бы полезно пополнить такого рода информацию и прояснить многие вопросы - например, насколько богато структурное разнообразие гидролитических ферментов в природе, как отражается на их свойствах и функциях и зависит ли от мест обитания их источников? Интересно отметить что, несмотря на многообразие первичных структур гидролаз в природе, существует весьма ограниченное число структур каталитических центров, которые являются трехмерным продуктом сворачивания полипептидной цепи белка. Вероятно, существует определенный алгоритм сборки таких структур, позволяющий в нужной точке пространства локализовать необходимую функциональную группу белка. Этот алгоритм определяется в свою очередь первичной последовательностью аминокислот и может быть назван условно вторичным кодом. Почему природа оказалась столь скудна на разнообразие каталитических структур? Можно высказать предположение, что возникновение эффективных каталитических структур - событие в высшей степени редкое. Возникшие эволюционным или случайным образом структуры природа «запомнила» и научилась использовать во всем многообразии обсуждаемых классов ферментов [7]. Возможно, ответ на вопрос о первопричине возникновения ограниченного числа типов эффективных каталитических структур кроется именно в море - колыбели всей жизни на Земле. С появлением первой информации о первичной структуре некоторых ферментов из морских микроорганизмов и сравнительном анализе их с наземными аналогами стало появляться представление о молекулярных механизмах, определяющих столь необычные физико-химические свойства ферментов морского происхождения как высокая удельная активность, устойчивость к неблагоприятным факторам - высокой солености, давлению, низким температурам. Это объясняется особым строением функционально значимых участков белковых молекул, которое легло в основу механизма адаптации микроорганизмов к суровым условиям обитания в морской среде. Одна из стратегий такой адаптации заключается в уменьшении количества межмолекулярных и внутримолекулярных связей в молекулах ферментов, что позволяет увеличивать эффективность каталитической реакции за счет увеличения числа оборотов их активных центров [2-3].
Традиционные схемы получения информации о биоразнообразии морских бактерий и продуктах экспрессии их генов включают в первую очередь скрининг, отбор и тестирование огромного количества материала. Но это трудоемкий и затратный процесс для достижения конечной антропогенной цели большинства этих исследований - создание жизненно и коммерчески важных биотехнологических продуктов для использования в
7 медицине, пищевой промышленности и генной инженерии. Сейчас уже существует технология рекомбинантных ДНК, позволяющая получать в больших количествах как ценные низкомолекулярные вещества, так и макромолекулы, в том числе и различные гидролитические ферменты, используемые для модификации биополимеров, которые в естественных условиях синтезируются в минимальных количествах [8].
Так, щелочные фосфатазы (ЩФ) бактерий являются широко распространенными в природе ферментами, катализирующими удаление 5'-фосфатных групп в полимерных молекулах нуклеиновых кислот и их мономерных предшественниках, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, что определяет их важную роль в метаболизме нуклеиновых кислот и круговороте фосфора в симбиотическом сообществе [9-10]. Практический интерес к ЩФ объясняется их широким использованием в генной инженерии для дефосфорилирования ДНК перед лигированием; в гибридизационной технике при хемилюминесцентном мечении генов для получения конъюгатов с олигонуклеотидами; для создания генетических конструкций на основе гена щелочной фосфатазы (векторов, плазмид-реперов); в медицине для получения иммуноконъюгатов; в диагностике для получения рекомбинантных диагностических антител к клеточным рецепторам с целью создания реперных белков и т.д. [11-13]. Существуют немало наземных источников ЩФ, но выделенные из них ферменты имеют ряд недостатков, таких как низкая активность, примеси диэстеразной активности, неустойчивость к химическим модификациям и длительному хранению [14].
Большой научно-практический интерес представляют и гликозидазы, широко используемые при исследовании антигенной структуры различных биологических объектов, в том числе клеток крови [15]. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов человека а-галактозидазой, что позволяет из эритроцитов с различной групповой специфичностью получать эритроциты 0(1)-группы крови ("универсальный донор") [16]. Литературные данные указывают на то, что в отличие от гликозидаз эукариотического происхождения, ферменты бактерий действуют в условиях нейтральных рН, физиологичных для эритроцитов [17]. Однако на сегодняшний день среди известных бактерий наземного происхождения пока не выявили подходящих продуцентов ос-галактозидаз с требуемой специфичностью и оптимумом рН.
Несмотря на то, что данные о структурах и функциях гидролаз из морских бактерий практически отсутствуют, уже имеющиеся сведения указывают на их преимущества перед
8 известными аналогами [14, 16, 19]. Так как они синтезируются в основном в глубоководных акваториях, являясь основными поставщиками фосфора, азота и углерода, можно предположить, что суровые условия обитания повлияли на их функциональные особенности и свойства, например способность к каталитическому расщеплению, приводящему к модификации сложных биополимеров, которые имеют в своем составе нуклеиновые кислоты, полисахариды и другие субстраты - составляющие важных биологических субстанций [9-10,18-20].
Таким образом, широкие возможности использования уникальных свойств ферментов морских микроорганизмов для целей биотехнологии и медицины определяют необходимость исследования их молекулярно-генетических характеристик и создания суперпродуцентов ценных рекомбинантных белков.
Цель настоящей работы заключалась в разработке общего подхода к установлению структурно-функциональной организации и свойств молекул гидролаз морских бактерий. Объектами исследования бьши выбраны гидролазы класса О-гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, имеющие биотехнологическую ценность в способности модифицировать биополимеры. В соответствии с заявленной целью работы бьши поставлены следующие задачи:
1. Провести в морских бактериях скрининг гидролитических ферментов класса О-
гликозидгидролаз и фосфомоноэстераз, модифицирующих соответственно
полисахариды и нуклеиновые кислоты.
Выделить и изучить свойства а-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701, катализирующей удаление групповой специфичности В(Ш)-группы крови человека с трансформацией эритроцитов в 0(1)-группу крови.
Установить первичную структуру и построить теоретическую модель пространственной структуры а-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701.
4. Выделить и изучить свойства ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.
5. Установить первичную структуру и построить теоретическую модель
пространственной структуры ЩФ из морской бактерии Cobetia marina.
6. Провести экспрессию ЩФ из морской бактерии Cobetia marina в клетках
Escherichia coli.
Специфичность и механизм действия гликозидгидролаз
В зависимости от типа действия на субстрат гликозидгидролазы делятся на экзо- и эндо-гликозидгидролазы. Экзо-гликозидгидролазы действуют на гликозидные связи, расположенные на невосстанавливающем конце сахаридных цепей. К ним относятся галактозидазы, глюкозидазы и др. Эндо-гликозидгидролазы, такие как а-амилаза, эндо-1,3 P-D-глюканазы, действуют на внутренние гликозидные связи сахаридных цепей. На сегодняшний день известно большое количество гликозидгидролаз из разных источников, проявляющих специфичность по отношению к гликозидным типам связи. Например, а амилаза гидролизует эндо- х-(1,4)-связь внутри полисахаридной цепи, образуя линейные а (1,4)-олигосахариды. Такой тип ферментов сохраняет конфигурацию субстрата [45]. Тогда как Р-амилаза, гидролизующая эндо-а-(1,4)-гликозидную связь, отщепляет только мальтозу с невосстанавливающего конца (экзо-)полисахарида и формирует другую аномерную конфигурацию (P-D-глюкозу), т.е. фермент является инвертирующим [46]. Некоторые гликозидгидролазы предпочтительно катализируют гидролиз субстратов определенной длины и степени разветвления, например, циклодекстрингликозилтрансфераза действует в основном на линейные цепи полисахаридов с одним типом ответвления (амилопектин со степенью разветвления 13,14 или 15) [47].
Ферментативный гидролиз гликозидных связей происходит по механизму общего кислотного/основного катализа, зависящего от двух аминокислотных остатков: донора протона и нуклеофила/основания [48]. Такой гидролиз может идти либо по внутренним гликозидным связям с сохранением их конфигурации (эндо-тип), либо по внешним гликозидным связям с инверсией аномерной конфигурации (экзо-тип) [49]. В реакции, проходящей по экзо-типу, кислород гликозида в начале протонируется, затем происходит нуклеофильная атака молекулой воды при Сі атоме углеводного остатка, которая активируется карбоксильным основанием, что приводит к инверсии продуктов реакции (Рис. 2а). Инверсия, как известно, часто сопутствует реакциям одноактного замещения, в которых разрыв и образование связи происходят синхронно в один этап [50]. Реакция зависит от концентрации, субстрата и нуклеофила. Гидролиз внешних связей может также происходить по другому механизму - реакции двойного замещения с сохранением конфигурации продуктов реакции [51]. В этом случае, на первом этапе происходит такое же протонирование гликозидного кислорода общей кислотой с образованием промежуточного соединения в виде оксо-карбоний иона, который на втором этапе атакуется нуклеофилом воды с образованием сопряженного основания кислотного катализатора (Рис. 26). Для гидролаз, сохраняющих конфигурацию продуктов реакции, возможно образование промежуточного продукта либо в виде оксо-карбоний иона, который электростатически стабилизируется за счет карбоксильного остатка, либо в виде ковалентного соединения (Рис. 2с), в котором один из каталитических остатков аспарагиновой кислоты (иногда глютамата) выступает в роли нуклеофила.
Гликозидтрансферазы действуют по похожему принципу, с той разницей, что на втором этапе вместо нуклеофила вступает в реакцию нередуцирующий конец моносахарида, стимулирующий образование сопряженного основания кислотного катализатора [52].
Классификация гликозидгидролаз, основанная на типе каталитической реакции и субстратной специфичности, не дает общего представления об эволюции ферментов и их структурных особенностях (аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул). В 1991 году Хенриссат предложил объединить гликозидгидролазы в семейства по принципу сходства аминокислотных последовательностей (Табл.1).
Некоторые семейства оказались моноспецифичными, например, а-амилазы и циклодекстрингликозилгидролазы были объединены по этому принципу в семейство 13, отличающееся общим каталитическим доменом. Однако некоторые гликозидгидролазы, имеющие схожую специфичность, попали в разные семейства, т.к. различаются каталитическими доменами, поэтому такие семейства называются полиспецифичными. Так, эндоглюканазы можно обнаружить в десятке различных семейств (Табл.1). Такая классификация, конечно, больше отвечает требованиям структурного исследования, нежели субстратной специфичности, но она помогает отследить общие корни происхождения и эволюции ферментов и их связь между собой, а также является удобным инструментом для пополнения или извлечения механистической информации [53-54]. В связи с быстрым пополнением баз данных первичными структурами гликозидгадролаз к 1996 году уже насчитывалось 57 семейств и более 950 гликозилгидролаз [55].
На сегодняшний день классификация охватывает уже около 30000 последовательностей гликозилгидролаз и их гомологов, образующих 106 семейств, которые можно найти на сетевом ресурсе http://www.cazy.org/ CAZY/ fam/acc_GH.html [56]. С тех пор, как появились данные об упаковке белковой молекулы гликозилгидролаз в пространстве, некоторые семейства стали объединять в кланы [57-58]. Так как информация о пространственной структуре большинства гликозидгадролаз еще отсутствует, пока удалось выделить 14 кланов, включающих 46 семейств, которых объединяет не только идентичная упаковка молекул, но и механизм действия фермента.
Генетическая регуляция биосинтеза а-галактозидаз
В растениях a-D-галактозидазы особенно в большом количестве встречаются в семенах бобовых растений [62-66]. Однако эти ферменты встречаются и в других растениях, например в листьях риса Oryza sativa [67], стеблях тростника Saccharum officinarum [68], мякоти грейпфрута [69], плодов томата [70], зерен риса [71] и других. Как видно из Табл.3, помимо запасной и защитной функции в семенах олигосахариды раффинозного ряда играют важную роль в транслокации фотоассимилянтов в высших растениях, в которых распределяются и расходуются по пути следования к плоду в зависимости от стадии его развития [72-73]. Известно, что большое количество галактозил-сахарозосодержащих олигосахаридов семян бобовых вызывают метеоризм у животных и человека, поскольку из-за отсутствия собственной a-галактозидазы в организме используется кишечная микрофлора, активно включающая растительные сахара в свой метаболизм, побочным эффектом которого является газообразование [74]. Таким образом, а-галактозидаза является первым ферментом, включающимся в катаболизм Сахаров раффинозного ряда, и удаляющим наряду с Р-маннозидазой концевую галактозу из запасенных галактоманнанов в период прорастания семян и формирования стенок молодых клеток. Совсем недавно появились сведения о возможном участии а-галактозидазы в апоптозе в процессе старения листьев [67] или в период созревания плода, в результате чего происходит размягчение его тканей [75]. Способность к трансгликозилированию позволяет говорить о роли некоторых а-галактозидаз в синтезе новых веществ [76]. Есть также упоминание об участии a-галактозидазы в процессе удаления токсичных ассимилянтов и гидролиза фенольных гликозидов, что позволяет растению контролировать уровень гормонов роста [77].
Сравнительно мало сведений существует об а-галактозидазах животных. Основная часть работ посвящена человеческой а-галактозидазе из селезенки, плаценты, плазмы и печени в связи с исследованием болезни Фабри [78-79]. Дефицит фермента у человека приводит к серьезному расстройству, в результате которого в клеточных лизосомах накапливается глоботриаозилцерамид, являющийся причиной заболевания [79]. У некоторых животных а-галактозидазная активность была обнаружена в красных кровяных тельцах и костном мозге [80]. Места обнаружения этих ферментов в высших животных указывает на то, что а-галактозидазы вовлечены в гидролиз галактолипидов. В тканях мозга а-галактозидаза, возможно, вовлечена в гидролиз моно- и дигалактозилдиглицеридов [81].
И, наконец, самым распространенным источником а-галактозидаз являются микроорганизмы, использующие фермент для гидролиза олиго- и полисахаридов из окружающей среды и утилизации их концевых галактозосодержащих остатков, таких как галактоза, глюкоза и манноза в виде источника углерода. На сегодняшний день огромное количество микробиальных а-галактозидаз изучены не только как ферменты с определенными физико-химическими свойствами, но и как продукты деятельности определенных генов и их регуляторов. Более того, большинство а-галактозидаз стали известны лишь благодаря появлению современных технологий, позволяющих исследовать сразу весь геном бактерии, который детально анализируется с помощью компьютерных программ, позволяющих конвертировать нуклеотидные последовательности кодирующих участков генов в аминокислотные последовательности белков [24-26]. Каждой нуклеотидной и белковой последовательности белка присваивается в соответствующей базе данных свой идентификационный номер (код), по которому можно найти описание последовательности белка и его источника на сводном сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Табл.4).
Структура и функция лактозного оперона Е. coli (lac) явились парадигмой генной регуляции вообще. Изучение регуляции lac привели к фундаментальной концепции о том, как работа нескольких генетических структур может слажено регулироваться в зависимости от концентрации метаболитов в окружающей среде. Молекулярная характеристика системы утилизации Сахаров дала полное представление о регуляции генов у бактерий [82-83].
Утилизация мелибиозы в клетках E.coli К12 контролируется, по крайней мере, двумя индуцибельными функциями - транспортной системой галактозидов (мелибиозная пермеаза) и гидролизующим их ферментом (а-галактозидаза) [84]. За эти две функции у бактерий отвечают гены мелибиозного оперона - соответственно melA и теІВ. В E.coli было обнаружено два вида пермеаз: тиометилгалактозидпермеаза (TMG)-I и (TMG)-II. Экспрессия обоих ферментов индуцируется мелибиозой, но (TMG)-II отличается тем, что индуцируется галактинолом и не экспрессируется в клетках при 37С.
Дикий штамм E.coli К12 не способен использовать раффинозу как единственный источник углерода, так как не имеет специальной индуцируемой системы транспорта и гидролитической активности, однако ряд передающихся плазмид позволяют клеткам расти на раффинозном источнике [85]. В таких плазмидах содержится так называемая raf система, включающая регуляторные и структурные гены для раффинозной пермеазы, а-галактозидазы и инвертазы [86]. Оперон также находится под двойной регуляцией -отрицательный контроль за счет связывания репрессора RafR со спаренными операторами 01 и 02, и положительный контроль за счет связывания camp с белком САР [87]. Сравнительно недавно была описана область генома у Streptococcus pneumoniae, отвечающая за регуляцию метаболизма раффинозы (Рис.3), куда входят восемь генов.
Классификация и механизм действия нуклеаз
В последнее время, благодаря богатой структурной базе данных (SWISS-PROT; http://www.expasy.ch), которая содержит информацию об аминокислотах, составляющих активные центры ферментов, стало возможным классифицировать все гидролазы по структуре их активных центров [7]. При этом была обнаружена удивительная закономерность - при практически бесконечной вариабельности специфичности ферментов и соответственно сорбционных участков активного центра существует феномен
При идентификации групп каталитического участка активного центра всегда можно найти нуклеофил - активатор воды и электрофил - активатор реакционного центра. Если суммировать данные о структурах активных центров ферментов, то можно вьщелить следующие типы нуклеофильных и электрофильных агентов, входящие в активные центры гидролаз: Активаторы воды (или белкового нуклеофила при образовании ковалентного интермедиата):
Если учесть, что для эффективного катализа необходимо согласованное участие нуклеофильной и электрофильной групп, то возможное число комбинаций представляет матрица из 16 вариантов, однако в природе реализуются всего пять [7]: S II - тип химотрипсина, рибонуклеазы, папаина; S 112 - тип лизоцима, пепсина; S ИЗ - тип карбоксипептидазы, термолизина; S III4 - тип пирофосфатазы, рестриктаз; S IV3 - тип щелочной фосфатазы, органофосфатгидролазы.
Таким образом, согласно данной класификации а-галактозидаза (Гл. 2.1.) обладает активным центром типа 112, где происходит согласованное действие двух карбоксильных групп, одна из которых в ионной форме выступает в качестве нуклеофильного активатора воды, другая в протонированной форме выступает в качестве электрофильного активатора субстрата.
Согласно данной классификации активных центров в классе ферментов нуклеинового обмена оказалось наибольшее число типов активных центров, несмотря на то, что ферментативный гидролиз любых полинуклеотидных субстратов происходит по единому синхронному механизму общего кислотного/основного катализа, о чем свидетельствуют колоколообразные формы кривых рН-зависимости ферментов нуклеинового обмена [7, 14, 117]. Значения рКя позволяют считать, что в процессе катализа у панкреатической рибонуклеазы участвуют два остатка His, из которых один функционирует как кислота, другой - как основание, где имидазольные группы в двух сходных последовательных стадиях меняются ролями [7]. Панкреатическая рибонуклеаза (3.1.27.5) и родственые ей ферменты принадлежат к И типу гидролаз. Каталитическое расщепление фосфодиэфирных связей в молекуле РНК на первой стадии представляет собой депротонацию соседней ОН"- группы в положении 2 рибозного кольца при атаке основанием остатка His 12 в активном центре панкреатической рибонуклеазы (Рис. 7). Образующийся алкоксид-ион атакует затем фосфор, замещая кислород, соединенный с 5 -углеродом соседнего нуклеотидного звена. Последующее расщепление может облегчаться миграцией протона от кислой группы остатка Hisl 19. В качестве промежуточного соединения образуется циклический 2 ,3 -дифосфат, который гидролизуется молекулой воды на второй стадии с образованием свободного З -нуклеотида. Если имидазольные группы здесь выступают как общеосновные активаторы нуклеофила, то амидную группу остатка Glu можно рассматривать как электрофильный активатор субстрата (нуклеофила). Таким образом, суммарная реакция представляет собой процесс двухстадийного замещения, подобно тому, как это имеет место в случае с а-галактозидазой, с той разницей, что в роли нуклеофильного катализатора (нуклеофила) выступает соседняя группа в молекуле субстрата, а не аминокислотный остаток боковой цепи полипептида фермента (Рис. 6).
В то время как атом углерода (С) способен образовывать только 4 прочные ковалентные связи, фосфор (Р) может образовьшать пять связей. Нуклеофильная атака атома С приводит к образованию неустойчивого переходного состояния с 5-тью связями, тогда как в результате атаки атома Р образуется пятиковалентное относительно стабильное промежуточное соединение. Нуклеотидное замещение у атома Р - очень важный тип реакций ввиду большого числа участвующих в этом процессе ферментов и их центральной роли в энергетическом метаболизме (118). Многие нуклеазы - металлозависимые ферменты, среди которых существует два типа классификации по активному центру. Так, пирофосфатазы, ряд рестриктаз и экзонуклеаз принадлежат к типу ИІ4, у которых один из ионов Mg2+ (или Мп2+) в активном центре играют роль генератора гидроксильных ионов, другой - активатора атакуемого центра (Рис. 8).
Очевидно, что металлозависимые ферменты составляют значительную часть всех гидролаз Наконец, представителями IV3 типа ферментов среди гидролаз, катализирующих расщепление или модификацию полинуклеотидов, являются щелочные фосфатази (3.1.3.1) и органофосфатгидролазы (3.1.8.1). Последние катализируют гидролиз триэфиров фосфорной кислоты, например фосфороорганических пестицидов (Рис.9). Каталитический гидролиз под действием этого типа ферментов протекает с согласованным участием двух комплексов ионов Zn2+ (или Со2+).
галактозидаза из морской бактерии pseudoalteromonassp
Большой практический интерес представляют а-галактозидазы, способные удалять а-1,3-связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ крови В(Ш) с превращением последних в детерминанту крови группы 0 (I) (Рис. 16). Такая специфичность и была обнаружена у а-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ701, что определило необходимость выделения, очистки и дальнейшего изучения каталитических и молекулярно-генетических характеристик фермента.
Фермент выделяли по схеме, включающей традиционные методы выделения белков, а именно осаждение белковых фракций с помощью различных концентраций сульфата аммония, диализ, ионообменную хроматографию и гельфильтрацию (Рис. 18). В этой схеме отсутствуют такие жесткие процедуры, как концентрирование разбавленных растворов фермента с помощью ультрафильтрации. Наибольшее количество белка отделялось при осаждении сульфатом аммония и хроматографии на DEAE Toyopearl 650
М (Рис. 19, Табл. 12). С помощью хроматографии на колонке DEAE 15 QPE4.6/100 (FPLC) удалось максимально сконцентрировать фермент, практически не потеряв его активности (Рис. 20). Гельфильтрация а-галактозидазы на колонке с Sepharose CL-4B (Рис. 21) не являлась достаточно эффективным методом очистки, однако с помощью этой процедуры фермент был подготовлен к рехроматографии на колонке DEAE 15 QPE4.6/100 (FPLC) (Рис. 22, Табл. 12). Дважды рехроматографированный на этой колонке фермент (Рис. 23) по данным ДСН-электрофореза имел максимальное количество исследуемого белка (Рис. 24, А2). Сопутствующие белки легко отделялись на колонке с Superose 12 HR 10/30 (Рис. 24, Б2). В результате проведенной очистки было получено 0,5 мл препарата фермента с удельной активностью 231 ед./мг белка и выходом 4,5% (Табл. 12).
На основании данных гельфильтрации, проведенной на калиброванной аналитической колонке с Superose 12 HR 10/30, молекулярная масса фермента составила 170±3 кДа, что указывает на мультимерное строение активного белка в физиологических условиях. Тот факт, что при ДСН-электрофорезе исследуемый фермент мигрирует одним фронтом, указывает на то, что а-галактозидаза из морской бактерии является димером и состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой 80,5+2,5 кДа. Большинство известных ос-галактозидаз имеют более многомерную структуру, обычно тетрамерную, однако прототип из Tennotoga maritima, на основе структуры которого была в дальнейшем смоделирована структура ос-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. KMM701, также состоит из двух одинаковых субъединиц, но с меньшей молекулярной массой 60 кДа (Табл. 5). рН-оптимум и термостабилыюсть:
Как видно из Рис. 26, фермент проявляет наиболее высокую активность при рН (7.0 - 7.9) ± 0.2, что согласуется с данными, полученными ранее [102]. Такой рН-оптимум выгодно отличает исследуемый фермент от других а-галактозидаз, применяемых для модификации групповой специфичности в целях переливания крови (Табл. 13).
На сегодняшний день для успешной ферментативной трансформации эритроцитов человека из В(Ш)-группы в 0(Г)-группу крови до сих пор используют а-галактозидазу из зеленых зерен кофе [16, 207]. Однако остается проблема с кислой рН среды, в которой приходится инкубировать эритроциты с ферментом. На первом этапе процедура обработки эритроцитов включает отделение эритроцитов от плазмы крови центрифугированием, затем следует отмывание изотоническим раствором Na-фосфат-цитратного буфера (рН 5.5-5.6), в котором происходит удаление групповых детерминант с помощью а-галактозидазы зерен кофе в течение 2,25 ч при 26С (Табл. 13). После проведения реакции эритроциты вновь переводят в физиологический раствор (0,9% двухосновного фосфата Na, рН 7.3-7.4). После таких манипуляций остается лишь 70-75% функционально пригодных эритроцитов. Бактериальные а-галактозидазы имеют часто нейтральный (физиологический) рН-оптимум действия, однако в этом случае существует проблема загрязнения их препаратов токсинами бактериального происхождения и, как следствие, гемолиза обработанных таким препаратом эритроцитов [207]. Кроме того, на сегодняшний день известна всего одна бактериальная а-галактозидаза, способная конвертировать групповую специфичность В(Ш)-группы крови в 0(1)-группу, но в связи с низким выходом фермента достоверно проверить возможность и эффективность трансформации детерминант группы крови человека авторам не удалось [208].
Температурный оптимум действия а-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ701 при 20-22С также благоприятен для жизнестойкости эритроцитов (Рис. 27). Из Рис. 27 видно, что фермент термолабилен и инкубация в течение 10 мин приводит к полной потере активности при 37С. Однако при 20С фермент остается стабильным в течение 24 ч.
Похожие диссертации на Гидролитические ферменты морских бактерий, модифицирующие биополимеры : молекулярное клонирование и свойства
