Введение к работе
і.
Актуальность проблемы. В настоящее время в рыбоводстве как у нас в стране, так и за рубежом особая роль отводится биохимии как теоретической основе науки о питании (Сорвачев, 1982). Формируется новое направление в науке - биохимия питания рыб. в числе прочих вопросов изучающая начальные этапы утилизации пищи в пищеварительном тракте. Многочисленные работы по изучению динамики активности пищеварительных ферментов рыб проводились, как правило, на неочищенных препаратах (Щербина. 1973; Коновалов, 1978; Ильина, 1985; Nagase. 1964); изучению же свойств самих ферментов внимания уделялось недостаточно. Зачастую свойства, присущие хорошо изученным ферментам высших позвоночных, некритически переносились и на ферменты рыб (Сорвачев. 1982). В то же время пищеварительные ферменты рыб по многим свойствам существенно отличаются от соответствующих ферментов млекопитающих (Колодзейская. Пивнен-ко. 1988).
Белый толстолобик (Hypophthalmlchthys fnolltrlx Val., сем. Cyprlnldae) относится к группе растительноядных рыб дальневосточного комплекса и в настоящее время широко акклиматизирован в естественных и искусственных водоемах юга России (Корнеев, 1982). Характерной особенностью строения пищеварительной системы карповых рыб является отсутствие желудка, причины которого до конца не ясны (Веригина. 1969; Кобегенова, 1988). У безжелудочных рыб отсутствуют начальные стадии пепсинового пищеварения белков, и вся нагрузка по перевариванию пищи приходится на кишечник. Природные ингибиторы ферментов попадают в полость кишечника в нативном состоянии. Однако, карповые рыбы успешно справляются с гидролизом белка. Логично предположить, что протеазы карповых рыб отличаются по своему составу и свойствам от соответствующих ферментов других позвоночных, что и было показано ранее рядом работ на примере карпа (Хаблюк, Проскуряков, 1988; Cohen et al.. 1981). Данные по свойствам пищеварительных ферментов белого толстолобика немногочисленны (Бузинова. 1971; Курлыкин. 1986; Jonas et al.. 1983).
Изучение строения и свойств сходных ферментов, выделенных из разных источников, дает дополнительные сведения об их происхождении и эволюции (Колодзейская. Пивненко. 1988). и с этой точки зрения белый толстолобик представляется нам интересным объектом
исследования, так как. с одной стороны, класс рыб занимает промежуточное систематическое положение мезду беспозвоночными и высшими позвоночными животными, а с другой, безжелудочное пищеварение - достаточно редкое явление в животном мире.
Белый толстолобик - важный объект прудового рыбоводства юга России; его удельный вес в балансе продукции прудовых хозяйств Краснодарского края достигает 60-70%. Ценность белого толстолобика, помимо получения полноценного относительно недорогого белка, заключается в его способности потреблять фитопланктон. В настоящее время в связи с интенсификацией рыбопроизводства стала актуальной проблема создания искусственных рационов для взрослых особей белого толстолобика, и данная работа может отчасти помочь в решении этого вопроса.
Своеобразие безжелудочного пищеварения карповых* рыб, слабая изученность ферментов белого толстолобика и его ценность как объекта рыбоводства побудили нас к проведению этой работы.
цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление молекулярных механизмов, эволюционных приспособлений к безжелудочному пищеварению у белого толстолобика.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Выделение и очистка пищеварительных ферментов гепатопанкреаса и слизистой оболочки кишечника белого толстолобика (трипсина, химотрипсина. коллагеназы. лейцинаминопептидазы, амилазы);
-
Исследование физико-химических свойств этих пищеварительных ферментов (молекулярная масса, количество изоформ и изоточки, оптимумы стабильности и активности, взаимодействие с ингибиторами) ;
-
Выявление сходства и различий пищеварительных ферментов белого толстолобика с соответствующий ферментами других животных.
Научная новизна. При проведении исследования пищеварительных ферментов гепатопанкреаса и слизистой оболочки кишечника белого толстолобика впервые установлено, что все ферменты гепатопанкреаса, кроме коллагеназы, представлены несколькими изоформами; определены значения изоэлектрических точек всех исследованных ферментов гепатопанкреаса. трипсина и лейцинаминопептидазы слизистой оболочки кишечника.
Найдены значения молекулярных масс всех исследованных ферментов гепатопанкреаса и химотрипсина слизистой кишечника.
Показано наличие проферментов у трипсина и химотрипсина гепатопанкреаса.
Рассчитаны оптимумы рН стабильности и активности пищевари тельных ферментов гепатопанкреаса с использованием природных ;: синтетических субстратов.
Исследовано угнетение протеаз гепатопанкреаса природными ин гибиторами серииовых протеаз; показана высокая молярная актив ность протеаз белого толстолобика по сравнению с соответствующим!' кристаллическими ферментами быка. На основании ингибиторного ана лиза сделан вывод о типе строении активных центров трипсина, хи мотрипсина. коллагеназы и лейцинаминопептидазы.
В слизистой оболочке кишечника белого толстолобика, наряду протеазами панкреатического происхождения, установлено наличи.' более высокомолекулярных собственно кишечных ферментов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты, дополняя представления о свойствах пищеварительных ферментов безкелудочных рыб, представляют интерес в выявлении молекулярных механизмов эволюционных приспособлений к безжелудочно му пищеварению. Изучение физико-химических свойств ферментов расширяет знания об изменениях структуры и функции ферментов в процессе эволюции. В работе показано, что ряд свойств пищеварительных ферментов белого толстолобика значительно отличается от свойств соответствующих ферментов других животных, в частности, рыб. имеющих желудок. К этим свойствам относятся: наличие значительного количества изоформ протеиназ с предположительно различной субстратной специфичностью; высокая молярная активность панкреатических протеиназ;- широкие оптимумы рН-активности ферментов; наличие в слизистой кишечника собственно кишечных эндопептидаз. Эти особенности, по нашему мнению, направлены на компенсацию от-сутсвующего пепсинового пищеварения.
Благодаря высокой протеолитической и амилолитической активности ферментов пищеварительные органы белого толстолобика могут служить источником' недорогих ферментных препаратов с широким спектром применения. Ацетоновый порошок гепатопанкреаса может использоваться в качестве ферментной добавки в стартовых кормах для личинок карповых рыб. Химотрипсин белого толстолобика является эффективным молокоствораживающим ферментом, способными действовать и при высоких значениях рН. и может применяться в молочной
промышленности. Перспективно' использование препаратов высокоактивной амилазы белого толстолобика.
Результаты работы могут быть использованы при разработке искусственных кормов для карповых- рыб. В силу особенностей питания взрослых особей до последнего времени создавались лишь корма для личинок белого толстолобика. Однако, при интенсификации рыбопро-нзводства (выращивание рыбы на теплых водах в условиях плотной посадки) стала актуальной проблема разработки кормов и для взрослых толстолобиков. Принимая во внимание высокую молярную активность протеаз и амилазы белого толстолобика, а также отсутствие у него желудка, необходимо контролировать искусственные корма по содержанию ингибиторов этих ферментов. Наличие в пищеварительном тракте белого толстолобика существенной коллагенорггической активности, теоретически обосновывает введение в кормовые смеси такого малодефицитного белка, как коллаген.
Материалы диссертации могут быть использованы при чтении спецкурсов "Биохимия пищеварения рыб" и "Экология рыб" студентам, специализирующимся по ихтиологии и гидробиологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
По своим физико-химическим свойствам пищеварительные ферменты белого толстолобика существенно отличаются от соответствующих ферментов других животных.
-
Эндопептидазы (трипсин и химотрипсин) гепатопанкреаса белого толстолобика, по данным ингибиторного анализа, обладают существенно большей, чем эндопептидазы млекопитающих, молярной активностью.
3.< В слизистой оболочке кишечника наряду с протеиназами, имеющими панкреатическое происхождение и адсорбировавшимися на кишечной стенке, имеются собственно кишечные трипсин и химотрипсин.
-
Ряд свойств, характерных для эндопептидаз белого толстолобика (большое количество изоформ с предположительно различной субстратной специфичностью, высокая молярная активность, наличие протеаз собственно кишечного происхождения), направлен на компенсацию отсутствующего пепсинового пищеварения в желудке.
-
И морфологические особенности строения желудочно-кишечного тракта, и физико-химические особенности пищеварительных фер-, ментов карповых рыб направлены на максимальное извлечение пита-
тельных веществ из пищевых объектов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доклады вались на 8-ой научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск. 1992). на 3-ем Симпозиуме."Химия лрп-теолитических ферментов" (Москва. 1993). на межреспубликанской ;:*учно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы предгорных экосистем" (Краснодар, 1993). на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные воп^-росы экологии и охраны природы степных экосистем и сопределъних территорий (Краснодар. 1994), на конференции молодых ученых; Северного Кавказа по физиологии (Ростов-на-Дону, 1995), на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1996). на заседаниях Краснодарского биохимического общества (1993. 1996).
Публикация материалов исслебования. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.. '
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литера- . туры, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения. ' заключения и выводов. Работа иллюстрирована 41 рисунком и 21 таблицей. Список ,исполь- зованной литературы включает 262 источника-, из них 162,на иностранных языках.
