Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика исследуемых ферментов 10
1.1.1. Пепсин 11
1.1.2. Трипсин 24
1.1.3. Химотрипсин 32
1.1.4. Коллагеназа "! 39
1.1.5. Эластаза.. 44
1.1.6. Лейцинаминопептидаза 49
2. Экспериментальная часть 54
2.1. Материал и реактивы
2.2. Методы очистки ферментов
2.2.1. Определение количества ферментов 55
2.2.2. Приготовление ацетоновых порошков 55
2.2.3. Высаливание, диализ, концентрирование растворов 56
2.2.4. Гель-хроматография, обессоливание препаратов 57
2.2.5. Ионообменная хроматография 58
2.2.6. Изоэлекторфокусирование, определение изоточек ферментов 59
2.3. Биохимические методы исследования 61
2.3.1. Определение активности пепсина 61
2.3.2. Определение активности трипсина 62
2.3.3. Определение активности химотрипсина 64
2.3.4. Определение активности коллагеназы 65
2.3.5. Определение активности эластазы 66
2.3.6. Определение активности лейцинаминопептидазы 66
2.3.7. Определение концентрации белка 67
2.4. Методы изучения физико-химических свойств
ферментов 67
2.4.1. Область рН-стабильности 67
2.4.2. Область рН-активности .68
2.4.3. Термостабильность, температурный оптимум действия.. 68
2.4.4. Определение молекулярной массы ферментов 69
2.4.5. Действие ионов металлов, активаторов и ингибиторов 70
2.5-; Статистическая обработка результатов .71
3. Результаты исследований и их обсуждение 72
3.1. Определение количества ферментов и их распределение в желудочнсг-кижечном тракте озерной лягушки. 72
3.2. Выделение и очистка протеолитических фрментов озерной лягушки 75
3.2.1. Влияние обработки ацетоном на активность пищеварительных ферментов 75
3.2.2. Высаливание ферментов сульфатом аммония
3.2.1. Разделение ферментов пищевода гель-хроматографией на сефадексах 79
3.2.2. Разделение ферментов пищевода ионообменной хроматографией 83
3.2.3. Разделение ферментов пищевода изоэлекторофоку-сированием на колонке в градиенте плотности сахарозы 84
3.2.4. Разделение ферментов желудка гель-хроматографией на сефадексах 88
3.2.5. Разделение ферментов желудка ионообменной хроматографией
3.2.6. Разделение ферментов желудка изоэлекторофоку-сированием на колонке в градиенте плотности сахарозы 92
3.2.7. Разделение ферментов поджелудочной железы гель-хроматографией на сефадексах — 97
3.2:8; Разделение ферментов поджелудочной железы ионообменной хроматографией 99
3.2.9. Разделение ферментов поджелудочной железы изоэлекторофокусярованием на колонке в градиенте плотности сахарозы 102
3.3. Выделение ферментов языка озерной лягушки 107
3.3.1. Разделение ферментов языка изоэлекторофоку сированием на колонке в градиенте плотности сахарозы 109
3.4. Гистологические исследования пищевода и желудка озерной лягушки ПО
3.5. Свойства протеолитических ферментов озерной лягушки 114
3.5.1. Пепсин 114
3.5.2. Трипсин 125
3.5.3. Химотрипсин 136
3.5.4. Эластазаи коллагеназа 141
3.5.5. Лейцинаминопептидаза 149
3.5.6. Протеиназы языка 153
3.5.7. Ферменты кишечника головастиков 157
Заключение 160
Выводы 164
Список литературы
- Трипсин
- Биохимические методы исследования
- Выделение и очистка протеолитических фрментов озерной лягушки
- Гистологические исследования пищевода и желудка озерной лягушки ПО
Трипсин
Как видно, в спектре кислых протеиназ желудка пресмыкающихся и птиц также обнаружены пепсины, которые по своим свойствам идентичны пепсинам А и С млекопитающих.
Из слизистой оболочки желудка лошади был выделен пепсиноген. Его молекула содержит 8 остатков метионина; по аминокислотному составу пепсиноген лошади идентичен пепсиногену свиньи и быка. При рН около 2,0 пепсиноген быстро превращался в активную форму. Молекулярная масса пепсина лошади была ниже массы свиного пепсина [212]. Фермент был устойчив при рН 4,5-5,5, оптимум активности находился при рН 1,7-1,8. Ингибировался ингибиторами карбоксильных протеаз. Изоэлектрофокусированием было выделено 8 изоформ пепсина лошади с pi 1,6; 1,8; 2,1; 2,3; 2,6; 2,8; 3,2; 3,6. Их №І2-концевая последовательность гомологична пепсину А свиньи [16].
В экстрактах слизистой оболочки желудка крысят была обнаружена высокая активность пепсина, которая увеличивалась с возрастом. Пепсин крысят при нейтральных значениях рН был более стабилен, чем пепсин взрослых крыс. Показано, что при введение гормонов роста крысятам, увеличивается активность изоформы пепсина, преобладающей у взрослых крыс [160]. Позже Muto Norio и Tani Satori [222] из слизистой оболочки желудка крыс очистили 2 пепсиногена - пепсиноген I и пепсиноген II, которые при рН 2,0 были активированы до соответствующих пепсинов с молекулярной массой 32000 Да и оптимумом рН активности при рН 2,0. Ферменты проявляли высокую активность до рН 8,0. В течение 60 минут определялась активность при рН 10,0. Активность пепсинов желудка крыс при гидролизе N-ацетил-Ь-фенилаланин-3,5-дийодотирозина была в 1,8 раза выше по сравнению со свиным пепсином. Ферменты ингибировались диазоацетил-ОЬ-норлейцин метиловым эфиром. Аффинной хроматографией с пепстатином из слизистой оболочки желудка . мыши выделены 2 формы пепсиногена (пепсиноген I и пепсиноген II), которые при рН 2,0 превращались в соответствующие пепсины. Активация пепсиногена I шла быстрее, чем пепсиногена II. Область рН активности пепсинов желудка мыши при температуре 25 С находилась в интервале рН от 2,0 до 3,0. Молекулярные массы пепсинов равны 38000 и 36000 Да, соответственно [163].
Из слизистой оболочки желудка кота выделена кислая протеиназа с оптимумом рН активности при рН 2,5, молекулярной массой 36000 Да. Ее аминокислотный состав был гомологичен пепсину С свиньи. Иммуноэлектрофорезом определены идентичные свойства кислой протеиназы желудка кота и пепсина С свиньи. Оба фермента обладали высокой молокосвертывающей активностью, одинаково гидролизовали гемоглобин. Обнаруженная протеиназа в желудке кота была классифицирована как пепсин С [191].
Из слизистой оболочки желудка крольчат выделены 6 изоформ пепсиногена, два из которых были определены как пепсиноген Ей пепсиноген М. При рН 2,2 пепсиногены были активированы до соответствующих пепсинов. Методом электорофореза в ПААГ обнаружен пепсин, который специфичен только для новорожденных крольчат [197].
Пепсиногены слизистой оболочки желудка тюленя и акулы NH2 -концевой аминокислотной последовательностью гомологичны пепсиногену В быка. Активация пепсиногенов тюленя и акулы протекала с образованием промежуточных форм, что также приближало их к бычьему. Аминокислотные составы соответствующих пепсинов были идентичны аминокислотному составу бычьего пепсина В [201].
Из слизистой оболочки желудка свиньи выделены и охарактеризованы пепсиногены В, С, Д и их активные формы. Пепсины желудка свиньи проявляли различную активность по М-ацетил-Ь-фенилаланил-Ь-дийодотирозину; отличались значением молекулярных масс и оптимумом рН активности. Пепсин В инактивировался при рН около 1,0 и рН около 7,0 [242]. Активация пепсиногена В при рН 2,0 приводила к образованию промежуточного псевдопепсина В путем расщепления связи Met 16-Gly 17. Псевдопепсин В превращался в пепсин В при рН 5,5. В процессе превращения пепсиногена В в пепсин В отщепляется 43 аминокислотных остатка с N-конца [225]. Пепсин С инактивировался при рН 8,5. Пепсины желудка свиньи проявляли одинаковую чувствительность к п-бромфенацилбромиду. Аминокислотные составы трех главных пепсинов желудка свиньи были идентичны [242].
В развивающихся желудках поросят была обнаружена высокая активность химозина. Его присутствие определялось в течение 2 месяцев, но максимальная активность наблюдалась в первую неделю. Секреция пепсина в желудке недельных поросят была незначительна. Его активность увеличивалась в конце 1-го месяца. Химозин и пепсин поросят одинаково створаживали молоко, но протеолитическая активность пепсина при гидролизе гемоглобина была значительно выше таковой химозина [158].
Аминокислотный состав пепсина быка отличен от такового свиного пепсина. Молекулярная масса фермента равна 37500 Да. Активность пепсина быка полностью ингибировалась диазоацетил-норлейцин метиловым эфиром в соотношении фермент : ингибитор - моль : моль [198].
Из слизистой оболочки желудка ягненка и теленка выделены прохимозины и пепсиногены, которые при рН 2,2 активировали до химозинов и пепсинов. Иммуноэлектрофорез показал, что химозины ягненка и теленка идентичны друг другу. Пепсины животных также проявляли одинаковые электрофоретичеекие свойства. Наблюдается гомология КВгконцевой последовательности пепсинов ягнят с №і2-концевой последовательностью быка [128].
Биохимические методы исследования
Протеолитическую активность определяли по методу Кунитца [66], сущность которого заключается в количественном спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза казеина при длине волны 280 нм после осаждения непереваренных остатков белка трихлоруксусной кислотой (ТХУК). Ход определения: 1 мл 1%-го казеина, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6, прогревали до 30 С в течение 20 минут, реакцию останавливали, добавляя 3 мл 0,3 М ТХУК. Пробы выдерживали 1-1,5 часа и фильтровали через плотный складчатый фильтр. В фильтрате определяли оптическую плотность против контроля, в который фермент добавляли после кислоты. За 1 единицу активности принимали количество фермента, которое в указанных условиях повышает оптическую плотность на 1,0 ед по сравнению с контролем.
Протеолитическую активность трипсина определяли также с использованием денатурированного гемоглобина методом Ансона [122], измеряя спектрофотометрически продукты гидролиза гемоглобина после осаждения ТХУК. Субстрат готовили следующим образом: к 10 мл 22%-го раствора гемоглобина добавляли 8 мл 1н NaOH, 36 г мочевины и 72 мл воды и выдерживали 1 час для денатурирования гемоглобина, затем доводили рН до 7,5 концентрированным раствором однозамещенного фосфата калия. Ход определения: к 2,5 мл субстрата добавляли 0,5 мл раствора фермента, инкубировали при 35 С 10 минут, после чего приливали 5 мл 0,3 М ТХУК, выдерживали 30 минут и фильтровали. В фильтрате определяли оптическую плотность при длине волны 280 нм против контроля, куда фермент добавляли после кислоты. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое в указанных условиях дает прирост оптической плотности на 1,0 ед.
Пептидазную (амидазную) активность трипсина определяли по гидролизу М-бегооил4),Ь-аргинин-р-нитроанилида (БАПНА) спектрофотометрически [278]. Субстрат представляет собой 0,0005 М раствор БАПНА в 0,02 М трис-НСІ буфере рН 8,2. К 1,0 мл субстрата приливали 1,0 мл 0,02 М трис-НС1 буфера рН 8,2, 0,25 мл дистиллированной воды и 0,25 мл раствора фермента и измеряли оптическую плотность при длине волны 400 нм. Смесь инкубировали при 35 С в течение 30 минут, после чего вновь измеряли оптическую плотность. Прирост оптической плотности за 30 минут инкубации пропорционален активности фермента, причем линейная зависимость сохранялась вплоть до величины прироста 0,3 ед.
Эстеразную активность трипсина определяли спектрофотометрически с использованием этилового эфира М-бензоил-Ь-аргинина (БАЭЭ) [246]. К 1 мл субстрата (1,5 мМ раствор БАЭЭ в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 8,0) приливали 1,5мМ буфера, 0,5 мл фермента и измеряли прирост оптической плотности при длине волны 253 нм при температуре 25 С через равные промежутки времени против контроля, где к 1 мл субстрата приливали 2 мл буфера. Прирост оптической плотности за 1 минуту находили по участку линейной зависимости. Активность выражали в мкМ расщепленного субстрата в минуту. 2.3.3. Определение активности химотрипсина
Протеолитическую активность химотрипсина определяли, используя казеин и денатурированный гемоглобин, аналогично определению активности трипсина (см. разд.2.3.2).
Химазную (молокосвертывающую) активность химотрипсина определяли методом Пятницкого [79]. Химотрипсин принадлежит к числу ферментов, створаживающих молоко. Молокосвертывающая активность химотрипсина -отличительный признак в ряду других щелочных протеиназ. MAC готовили также, как для определения химазной активности пепсина. Ход определения: к 0,5 мл пробы фермента приливали 5 мл прогретой до 35 С МАС и измеряли время до появления первых хлопьев выпадающего в осадок р-казеина. За единицу химазной активности принимали такое количество фермента, которое створаживало 5 мл МАС за 1 минуту при температуре 35и С. Расчет проводили также, как при определении активности пепсина.
Эстеразную активность химотрипсина определяли, применяя этиловый эфир М-ацетил-Ь-тирозина (АТЭЭ), спектрофотометрически [246]. Субстрат представляет собой 0,0001 М раствор АТЭЭ в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,0; в качестве контроля использовали 0,001 М раствор L-тирозина в том же буфере. Ход измерения: в опытную кювету к 3 мл субстрата приливали 0,1 мл пробы фермента и измеряли уменьшение оптической плотности через равные промежутки времени при длине волны 237 нм и температуре 25 С против контрольной кюветы, куда помещали 3 мл раствора L-тирозина. По линейному участку определяли падение экстинкции в единицу времени. За одну АТЭЭ-единицу принимали количество фермента, которое в данных условиях уменьшает оптическую плотность раствора субстрата на 0,001 единицы за 1 минуту [109].
Пептидазную (амидазную) активность химотрипсина определяли по N-ацетил-В,Ь-фенилаланин-р-нитроанилиду (АФПНА) [278]. К 3,5 мл субстрата (0,25 мМ раствор АФПНА в ОД М трис-НС1 буфере с рН 8,0) приливали 0,5 пробы и, измерив экстинкцию при длине волны 400 нм, инкубировали при температуре 35 С 1 час, после чего вновь измеряли экстинцию. Разность конечной и начальной экстинкций пропорциональна активности фермента до значения 0,3 ед. Активность химотрипсина выражали в мкМ расщепленного субстрата в 1 минуту, для чего прирост оптической плотности умножали на коэффициент перевода 2,97.
Выделение и очистка протеолитических фрментов озерной лягушки
Для определения соотношения изоформ пепсина в желудке лягушки на изоэлектрофокусирующую колонку наносили водный экстракт слизистой оболочки. Как свидетельствуют результаты опыта, в желудке озерной лягушки преобладают изоформы с pi 3,45 и с р! 4,15. На их долю приходится 23,9% и 32,7%, соответственно, от общей элюированной активности.
Пепсин Ш-1 с pi 2,05 определяет всего 4,8% пепсиновой активности желудка лягушки. Пепсины Ш-2 и ІІІ-3 в сумме дают 19,6% (пепсин Ш-2 -10,3%, пепсин ПІ-3 - 9,3%). Доля кислой пртеиназы желудка озерной лягушки составляет 19% от общей элюированной активности, что в 3,8 раза больше по сравнению с пищеводом, где доля подобной кислой протеиназы составляет всего 4,9% общей пепсиновой активности.
Таким образом, в желудке озерной лягушки при использовании гель-хроматографии на сефадексах, ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и изоэлектрофокусирования нами обнаружено 5 изоформ пепсина с р! 2,05, 2,45, 2,95, 3,45 и 4,15, а также кислая протеиназа с pi 2,8. В количественном соотношении преобладают пепсины с р! 3,45 и 4,15. При изоэлектрофокусировании ферментов желудка сеголеток озерной лягушки обнаружили некоторые отличия.
При фокусировании пика IV (аналогичный взрослым особям, рис. 10) получили 3 изоформы пепсина: пепсин IV-1 с pi 3,45±0,17, пепсин IV-2 с pi 4,15+0,15 и пепсин IV-3 с pi 5,05+0,19.
При изоэлектрофокусировании пика III (аналогичный взрослым особям, рис. 10) получили 2 изоформы пепсина с pi 1,75+0,16 и pi 2,95+0,08, названные, соответственно, пепсин III-1 и пепсин III-2.
Методом изоэлектрофокусирования определили изоточку кислой протеиназы желудка сеголеток, которая находилась при рН 2,8+0,08.
Таким образом, в желудке сеголеток озерной лягушки нами обнаружены 5 изоформ пепсина с pi 1,75, 2,95, 3,45, 4,15, 5,05 и кислая протеиназа с pi 2,8, которая при низких значениях рН расщепляет молекулу гемоглобина, но не створаживает молочно-ацетатную смесь.
Изоэлектрофокусированием грубого экстракта слизистой оболочки желудка сеголеток определили соотношение изоформ пепсина. Ферменты с pi 3,45; 4,15 и 5,05 соотавляют в сумме 69,5% общей пепсиновой активности желудка сеголеток и являются доминирующими изоформами. Пепсин с pi 3,45 определяет 20,5% пепсиновой активности желудка сеголеток, пепсин с pi 4,15 -30,7%, пепсин с pi 5,05, отсутствующий в желудке взрослых особей - 18,3%. Пепсины с pi 1,75 и pi 2,95 определяют 13% общей активности (4,7% и 8,3%, соответственно). Доля кислой протеиназы желудка сеголеток составляет 17,5 % общей протеолитической активности.
Подводя итог исследованиям кислых протеиназ пищевода и желудка озерной лягушки, можно предположить, что для данного вида характерно наличие 11 изоформ пепсина. В желудке черепахи Trionyx sinensis обнаружено 9 изоформ пепсина. [183]; в желудке лошади - 8 изоформ [16]; у человека - 8 изоформ пепсина [105, 223]. Однако, из 11 молекулярных форм пепсина озерной лягушки две изоформы (с pi 1,75 и pi 5,05) характерны только для сеголеток озерной лягушки; изоформы с pi 2,05 и 2,45 встречаются только в желудке взрослых особей. Пепсины с pi 1,6; 1,95; 2,95 3,45 и 4,15 определяются в пищеводе и желудке сеголеток и взрослых лягушек. Здесь же следует отметить, что пепсины с pi 1,6; 1,95; 2,6 обнаружены только в пищеводе лягушек. Пепсины с р! 2,05; 2,45 2,95 (у взрослых особей) и с pi 1,75 (у сеголеток) обнаружены только в желудке (рис. 13).
Из рисунка 13 видно, что пепсин с pi 3,45 обнаружен в пищеводе и желудке лягушки, пепсин с pi 4,15 определен в пищеводе и желудке сеголеток и в желудке половозрелых лягушек. Как указывалось выше, изоформа с pi 2,8 не обладает молокосвертывающей активностью. В желудке озерной лягушки (сеголеток и взрослых особей) ее активность выше, чем в пищеводе. В заключении следует сказать, что доля пепсинов желудка озерной лягушки с pi 3,45 и р! 4,15, а также кислой протеиназы pi 2,8 с возрастом не изменяется.
Полученные результаты позволяют предположить, что функция пищевода озерной лягушки не ограничивается проведением пищи, то есть нельзя исключить роль пищевода в пепсиновом пищеварении. В литературе подобный факт описан В. Barabasz и V.M. Olejnik [127], которые определили, что переваривание белков у хорьков происходит главным образом в пищеводе. Этот вывод приводит нас к рассмотрению еще одной важной проблемы: существуют ли какие-либо сходства в гистологическом строении пищевода и желудка озерной лягушки. Этот вопрос освещен нами в главе 3.4.
Рис. 14. Гель-хроматография белков поджелудочной железы озерной лягушки на сефадексе G-75. Колонка 1,9 х 75 см, уравновешена 0,02 М трис-НС1 буфером рН 8,0. Скорость элюции 25мл/час. Нанесено 370 ед. белка. ЛАП-активность лейцинаминопептидазы, Т-трипси-на, Х-химотрипсина, К,Э-коллагеназы и эластазы. Из рисунка 14 видно, что со свободным объемом колонки элюируются белки с высокой молекулярной массой. Они определили первый пик, на который приходится 20,9% белка от общего элюированного (табл. 19).
Второй и третий пики содержали 15,6% и 46,8% белка от общего элюированного; низкомолекулярные белки определили четвертый и пятый пики, с процентным содержанием белка - 9,1% и 7,6%, соответственно (табл. 19). Ферментативной активностью обладали элюаты первого, второго и третьего пиков (рис. 14, табл. 19).
Первый пик содержал активность лейцинаминопептидазы и незначительную часть химазной и БАПазной активности (5,6% и 8,1%, соответственно). Большая часть химазной и трипсиновой активности принадлежит второму пику. Он обладал также активностью эластазы (84% от общей элюированной) и активностью коллагеназы (84,6% от общей элюированной). Третий пик обладал активностью трипсина, эластазы и коллагеназы. На его долю приходится 13,2 % активности трипсина и около 15% активности эластазы и коллагеназы от общей элюированной. Степень очистки ферментов поджелудочной железы озерной лягушки при гель-хроматографии на сефадексах составила от 0,39 до 4,6 для трипсина, от 0,69 до 5,0 для химотрипсина и от 0,4 до 6,0 для эластазы и коллагеназы в сравнении с наносимым образцом. Удельная активность ферментов поджелудочной железы озерной лягушки относительно грубого экстракта увеличилась в 1,5-4,1 раза (табл. 10, 19).
Для дальнейшей очистки лейцинаминопептидазы поджелудочной железы озерной лягушки использовали сефадекс G-200 (рис. 15). На колонку наносили белки первого пика, полученного при гель-хроматографии на сефадексе G-75 и содержащего активность лейцинаминопептидазы (рис. 14, пик I).
Гистологические исследования пищевода и желудка озерной лягушки ПО
Из таблицы 26 видно, что свиной пепсин угнетается пепстатином в концентрации 0,01 мкмоль в 1,5 раза сильнее, чем пепсин III с pi 3,45. Активность пепсинов пищевода II-1 и ІІ-3 с pi 1,6 и pi 2,6, также угнетается пепстатином в концентрациях 0,01 мкмоль и 0,1 мкмоль слабее по сравнению со свиным. Наиболее чувствительным к ингибитору оказался пепсин П-2 с pi 1,95. Его активность в присутствии пепстатина в концентрации 0,001 мкмоль уменьшалась на 46%, а при концентрации ингибитора 0,01 мкмоль -подавлялась полностью.
Пепсин III, на долю которого приходится более 50% от общей активности кислых протеиназ пищевода (табл. 13), был подвергнут тепловой обработке. Образец фермента, в течение 3 часов находился в водяной бане при температуре от 35 до 75С в оптимуме рН стабильности. При температуре от 35 до 55 С сохранялось 90-95% активности пепсина III. При повышении температуры до 60 С активность пищеводного пепсина III озерной лягушки снижалась на 80%, при температуре 65С фермент полностью инактивировался. Наши данные совпадают с результатами исследований Н.П. Пятницкого [77], который в 1947 году доказал, что пепсин холоднокровного животного лягушки по теплоустойчивости своей молекулы ближе к пепсину человека, чем к пепсину рыб.
Необходимо отметить, что одна из форм желудочных пепсинов озерной лягушки по своим свойствам идентична пищеводному пепсину III. Желудочный пепсин IV-1 имеет изоточку при рН 3,45 (табл. 18), молекулярную массу 31600±250 Да (рис. 28), оптимум рН его активности определен при рН 2,2 (рис. 30). Выделенный фермент желудка озерной лягушки, также как и пищеводный пепсин III, термоустойчив и проявляет одинаковую чувствительность к пепстатину (табл. 26, 27). Из литературы известно, что в пищеводе и желудке лягушки-быка обнаружены два идентичных пепсина, которые по своим свойствам и аминокислотной последовательности были гомологичны пепсину С (гастриксину) человека. Сравнивая полученные нами результаты с данными E.Yakabe et.al. [292] предположили, что пепсин III пищевода озерной лягушки и пепсин IV-1 желудка относятся к классу пепсинов С.
Таким образом, обнаруженный нами пепсин с pi 3,45, который определяет большую часть общей пепсиновой активности пищевода лягушки, принадлежит к группе пепсинов С.
Кроме описанных выше 4 изоформ пепсина, в пищеводе озерной лягушки нами обнаружена кислая протеиназа с pi 2,8, которая при низких значениях рН эффективно расщепляла молекулу гемоглобина, но не створаживала MAC. Оптимум ее активности определен при рН 3,0 (рис. 26), стабильна кислая протеиназа в интервале рН 2,0-4,5 с оптимумом при рН 3,45 (рис. 27). Активность фермента угнеталась пепстатином слабее, чем активность пепсинов пищевода лягушки и активность пепсина свиньи (табл. 26).
Молекулярная масса обнаруженной протеиназы, по данным гель -хроматографии, равна 80000 Да (рис. 23).
Ферменты с высокой молекулярной массой были ранее обнаружены и охарактеризованы. Из кишечника эмбриона кур выделен фермент, активный в кислой среде, с молекулярной массой 56000 Да [293]. Из желудка крысы очистили катепсин Е [223], молекулярная масса которого равна 85000-90000 Да, оптимум рН активности по гидролизу гемоглобина около рН 3,0. Катепсин Е состоял из двух субъединиц и содержал углеводные цепи. М.И. Зильберман с соавторами [31] из слизистой тонкого кишечника свиньи выделил подобную протеиназу с молекулярнлой массой 60000 Да и оптимумом рН активности при рН 3,2. В кишечнике головастиков лягушки-быка на конечных стадиях метаморфоза обнаружен фермент с молекулярной массой 88000 Да, который был обнаружен и в желудках взрослых лягушек. Его активность угнеталась пепстатином. Обнаруженный фермент был отнесен к группе катепсинов Е [187].
Таким образом, обнаруженная кислая протеиназа пищевода озерной лягушки, была отнесена к семейству катепсинов Е.
В целом, в пищеводе озерной лягушки кислые протеиназы представлены пепсинами с молекулярной массой 31600 Да и р! 1,6, 1,95, 2,6, 3,45, и катепси-ном Е с молекулярной массой 80000 Да и изоточкой при рН 2,8. Пепсин пищевода озерной лягушки с р! 3,45 был классифицирован как пепсин С.
В желудке озерной лягушки нами обнаружено 5 изоформ пепсина и кислая протеиназа, не створаживающая молочно-ацетатную смесь. Как уже указывалось выше (см. разд. 3.2.6.) пепсины желудка озерной лягушки имеют значения изоточек 2,05, 2,45, 2,95, 3,45 и 4,15. В количественном отношении наиболее выражены изоформы с pi 3,45 и pi 4,15. Они определяют 53, 3 % пепсиновой активности. Остальные пепсины (р! 2,05, 2,45, 2,95) в сумме составляют 22,7 % общей активности. Молекулярные массы пепсинов желудка озерной лягушки различны. Пепсин с pi 4,15 имеет молекулярную массу, по данным гель-хроматографии, 35500±400 Да (рис. 28), пепсин с pi 3,45 - 31600±250 Да. Молекулярные массы пепсинов с pi 2,05, 2,45 и 2,95 одинаковы и равны 27300±200 Да. К
