Содержание к диссертации
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
ГЛАВА 1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе 11
ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий — субстрата
бактериолитических ферментов 13
Клеточная стенка грамположительных бактерий 15
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий 17
Строение пептидогликана бактерий 20
ГЛАВА 3. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов 26
ГЛАВА 4. Бактериолитические ферменты бактерий 28
Внеклеточные бактериолитические ферменты 28
Автолитические ферменты бактерий 29
Физиологическая роль ферментов 29
Спектр и субклеточная локализация автолититических ферментов бактерий 36
Свойства автолитических ферментов 40
Регуляция и контроль активности автолитических ферментов 43
4.3. Взаимосвязь биосинтеза внутриклеточных и внеклеточных
бактериолитических ферментов 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Материалы и методы 50
Материалы 50
Микроорганизмы и условия их культивирования 50
Субклеточное фракционирование 51
5.4. Солюбилизация автолитических ферментов из фракции
клеточных стенок и мембран 52
5.5. Определение ферментативных активностей клеточных фракций 52
Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности 52
Определение лактатдегидрогеназной активности 53
Определение активности циклической фосфодиэстеразы 53
Определение автолитической активности ..53
5.6. Турбидиметрический метод определения автолитической активности
ферментных препаратов 54
Определение белка 54
Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеточных фракций Lysobacter sp. XL 1 и XL 2 55
Электрофоретический анализ в анодной системе 55
Электрофоретический анализ в катодной системе 56
5.9. Выделение пептидогликана бактерии Lysobacter sp. XL 1 56
Определение состава пептидогликана Lysobacter sp. XL 1 57
Определение конфигурации диаминопимелиновой кислоты
в пептидогликане Lysobacter sp. XL 1 58
Элюция автолитических ферментов из ПААГ 58
Определение субстратной специфичности автолитических ферментов....59
Обнаружение ферментов с глюкозаминидазной активностью 59
Обнаружение ферментов с мурамидазной активностью 59
Обнаружение ферментов с амидазной и эндопептидазной активностями 59
Осаждение белков цитозоля сульфатом аммония 60
Ионообменная хроматография элюата из ПААГ на SP-сефадексе С-50...60
Определение молекулярной массы цитозольной эндопептидазы А7 61
Гельфильтрация 61
Электрофорез в присутствии SDS-Na 61
5.17. Характеристика ферментных препаратов, содержащих эндопептидазы
As, А7 и N-ацетилмурамоил-І^аланин амидазу Аб 62
Определение оптимального значения рН для действия автолитических ферментов 62
Определение оптимального значения концентрации буфера для действия автолитических ферментов 63
Определение влияния температуры на активность автолитических ферментов 63
Определение термостабильности ферментных препаратов 64
ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение 65
Химическая структура пептидогликана Lysobacter sp. XL 1 65
Автолитические ферменты активного штамма Lysobacter sp. XL 1,
не секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты 66
6.3. Субстратная специфичность автолитических ферментов по отношению
к пептидогликану бактерии Lysobacter sp. XL 1 76
6.4. Определение свойств наиболее активных автолитических ферментов
цитозоля Lysobacter sp. XL 1 80
Оптимум рН действия эндопептидазы As и К-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазы Аб 81
Зависимость активности эндопептидазы А5 и ІЯ-ацетилмурамоил-І^ аланин амидазы Аб от ионной силы раствора 83
Оптимум температуры реакции эндопептидазы As
и И-ацетилмурамоил-І^аланин амидазы Аб 86
6.4.4. Термостабильность эндопептидазы As и
^ацетилмурамоил-І^аланин амидазы Аб 88
Автолитические ферменты активного штамма Lysobacter sp. XL 1, секретирующего внеклеточные бактериол итические ферменты 90
Сравнение субстратной специфичности автолитического фермента А7
и внеклеточного фермента Лі 91
6.7. Автолитические ферменты малоактивного штамма
Lysobacter sp. XL 2 94
6.8. Вьщеление, очистка и свойства цитозольной эндопептидазы А7 96
6.9. Заключение 114
ВЫВОДЫ 117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
»
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДНФ - 2,4-динитрофторбензол
SDS-Na - додецилсульфат натрия
ТХУ - трихлоруксусная кислота
трис - трис-(оксиметил)-аминометан
Ala -аланин
Glu - глутамин
Lys - лизин
Gly - глицин
Агрт - диаминопимелиновая кислота
MurNAc - N-ацетилмурамовая кислота
GlcNAc - N-ацетилглюкозамин
ПААГ - полиакриламидный гель
ФЭА - фосфатидилэтаноламин
ФГ - фосфатидилглицерин
КЛ - кардиолипин
Введение к работе
Актуальность проблемы. Внутриклеточные бактериолитические
(автолитические) ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане -основном структурном компоненте клеточной стенке эубактерии, играют важную роль в процессах роста и деления бактериальной клетки. Они являются жизненно необходимыми для любой эубактерии. Кроме того, некоторые эубактерии в определенных условиях продуцируют не только автолитические, но и внеклеточные бактериолитические ферменты, которые необходимы им для завоевания экологической ниши и обеспечения их клеток пищей и энергией. В этом случае в клетках эубактерии идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как автолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим встает вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов?
К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов эубактерии. Однако, до сих пор в литературе нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов, в которых они были бы достаточно полно исследованы.
Автолитические ферменты хорошо изучены у многих представителей грамположительных бактерий (Shockman, Holtje, 1994), у грамотрицательных, за исключением Escherichia coli (Holtje, Tuomanen, 1991), их подробно не изучали.
Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. (ранее определенная как Xanthomonas campestris) относится к числу таких бактерий, которые в определенных условиях продуцируют внеклеточные бактериолитические ферменты: мурамидазу, эндопептидазу
Лі и К-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазу Jfe. Эти ферменты входят в состав применяемого в медицине антибактериального препарата лизоамидаза (Машковский, 1998), поэтому их свойства хорошо изучены. Все они являются положительно заряженными низкомолекулярными белками, проявляющими наибольшую активность в среде с низкой ионной силой и высоким значением рН (Степная и др., 1999).
Ранее в цитозоле этой бактерии был обнаружен автолитический фермент с глюкозаминидазной активностью, не выявленный среди внеклеточных бактериолитических ферментов (Цфасман и др., 2000). Его физико-химические свойства существенно отличались от свойств внеклеточных ферментов Lysobacter sp. Однако, подробный анализ автолитических ферментов этой бактерии не проводили. Вместе с тем изучение автолитических ферментов Lysobacter sp. в сравнении с ее уже изученными внеклеточными бактериолитическими ферментами позволит приблизиться к пониманию механизма функционирования этих двух "пулов" бактериолитических ферментов у одной бактерии.
Цель работы - изучение автолитических ферментов бактерии Lysobacter sp.
Задачи работы:
1. Изучение химической структуры пептидогликана бактерии Lysobacter sp. -
субстрата ее автолитических ферментов.
Выявление автолитических ферментов бактерии и установление их локализации.
Определение субстратной специфичности автолитических ферментов бактерии Lysobacter sp. по отношению к связям пептидогликана.
Выделение и очистка наиболее активных автолитических ферментов бактерии.
Изучение свойств автолитических ферментов Lysobacter sp. и сравнение их со свойствами изученных ранее внеклеточных бактериолитических ферментов этой бактерии.
Научная новизна работы. Установлена химическая структура пептидогликана грамотрицательной бактерии Lysobacter sp.
Впервые на примере Lysobacter sp. проведено сравнение вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов у одной и той же бактерии. При этом в клетках Lysobacter sp. XL 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, обнаружено 9 внутриклеточных (автолитических) ферментов. В условиях секреции внеклеточных ферментов в клетках Lysobacter sp. XL 1 выявлен дополнительный автолитический фермент. В клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен. Показано, что спектр этих ферментов Lysobacter sp. включает в себя глюкозаминидазы, мурамидазы, ІЧ-ацетилмурамоил-І^-аланин амидазы и эндопептидазы. Он существенно отличается от спектра внеклеточных бактериолитических ферментов по количеству, субстратной специфичности и свойствам.
Установлено, что автолитические ферменты присутствуют в цитозоле клеток, в периплазме и во фракции клеточных стенок и мембран.
Показано, что спектр и уровень активности автолитических ферментов изменяется в процессе роста бактерии.
Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках Lysobacter sp. XL 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты. Показано, что этот фермент имеет ряд свойств, аналогичных свойствам внеклеточной эндопептидазы Ль Это и тот факт, что цитозольная эндопептидаза отсутствует в клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу Ль позволило предположить, что цитозольная эндопептидаза может являться предшественником внеклеточной эндопептидазы.
Научно-практическое значение. Полученные в работе новые данные расширяют наше представление о механизме функционирования внутриклеточных и внеклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Настоящая работа по своему характеру относиться к разряду фундаментальных исследований. Однако, полученные результаты имеют также и практическое значение, так как они могут быть использованы для оптимизации условий секреции внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1, выяснения перспективности обогащения автолитическими ферментами медицинского препарата лизоамидаза, и как следствие - улучшение его качества и бактериолитических свойств.
Похожие диссертации на Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов
